农杆菌介导的植物转基因技术学习资料

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农杆菌的活化培养及介导的遗传转化

农杆菌的活化培养及介导的遗传转化一、目的要求通过实验掌握农杆菌的活化与培养技术与农杆菌介导获得目的基因的转化植株。

二、基本原理农杆菌共培养法最早是由Marton 等（1979 年）以原生质体为受体建立起来的，经过一系列改进后，目前已经成为最常用的转化方法。

共培养法是利用Ti 质粒系统，将农杆菌与植物原生质体、悬浮培养细胞、叶盘、睫段等共同培养的一种转化方法。

三、材料及方法1.含目的基因共整合载体或双元载体的根癌农杆菌。

2.植物幼苗。

（一）细菌培养液直接浸染法操作︰（1）无菌受体材料的准备︰叶片、睫段、胚轴、子叶等均可做受体材料，有两种来源。

取自无菌试管苗。

取自田间或温室栽培植株︰叶片、睫尖、睫段用蒸馏水冲冼1 遍后，70％乙醇洗45 秒，0.1％升汞消毒6～8 分钟，无菌水冲洗三遍，无菌滤纸吸干水分。

（2）受体材料预培养︰将无菌叶片剪成0.5cm×0.5cm 的小块或用6mm 打孔器凿成圆盘，无菌胚轴、睫切成约0.8～1cm 长的切段，接种在愈伤组织诱导或分化培养基上进行预培养，注意叶片近轴面向下︰预培养2～3 天，材料切口处刚刚开始膨大时即可进行侵染。

（3）农杆菌培养︰从平板上挑取单菌落，接种到20mL 附加相应抗生素的细菌培养液体培养基（pH7.0）中，在恒温摇床上，于27℃, 180r/ min 培养至OD600 为0.6～0.8。

取OD600 为0.6～0.8 的菌液，按1％～2％的比例，转入新配制的无抗生素的细菌培养液体培养基中，可在与上相同的条件下培养6 小时左右，OD600 为0.2～0.5 时即可用于转化；或同时加入100～500μmol/的AS；（4）侵染︰于超净工作台上，将菌液倒入无菌小培养皿中（可根据材料对菌液的敏感情况进行不同倍数的稀释）。

从培养瓶中取出预培养过的外植体，放入菌液中，浸泡适当时间（一般1～5 分钟，不同材料处理时间不同）。

取出外植体置于无菌滤纸上吸去附着的菌液。

20 【终版】农杆菌介导的烟草转gfp基因(叶盘法)

1 实验背景什么是“植物转基因技术”“转基因植物”？植物转基因技术：把从动物、植物或微生物中分离获得的目的基因，或者经过修饰的目的基因，通过各种方法转移重组到植物基因组内，使之稳定遗传并赋予植物新的遗传性状的方法。

转基因植物：通过植物转基因技术获得的、整合有外源基因的植物个体。

1 实验背景为什么要进行植物转基因？优势：◆农业：生产抗逆、高产、优质、抗病虫、除草剂、营养品质改良等优良性状的作物；遗传育种等。

◆制药、化工等：可作为生物反应器，生产药用蛋白和有用次生代谢物，或生产某些有机化合物等。

◆园艺：美化生活等，如蓝玫瑰等。

◆科学研究：生物学、遗传学等多领域基础研究等。

1 实验背景怎样将外源基因转入植物？间接转化法(载体介导)病毒介导法农杆菌介导法（双子叶/单子叶）种质系统介导法胚囊和子房注射法生殖细胞侵染法花粉管通道法直接转化法物理法化学法基因枪法(单子叶植物)显微注射法电击法超声波法PEG 法脂质体法1 实验背景各种转基因方法的区别是什么？（引自崔广荣，2003）1 实验背景针对不同植物，怎样选择转基因方法？目前转基因植株中，约80%以上通过“农杆菌介导转化法”获得。

植株特点首选方法备注对农杆菌敏感农杆菌介导法效率高，方法成熟，转基因植株遗传稳定。

原生质体培养容易直接转化法（如PEG 法）转化率高，可克服转基因植株嵌合体的难题。

多胚珠花粉管通道法提高转化率子房中有较大单胚珠植物(如核果类)显微注射法提高转化率转化难度大的植物基因枪法其它方法不可行时的备选放射性农杆菌发根农杆菌Agrobacterium rhizogenes根瘤农杆菌Agrobacterium tumefaciens旋钩子农杆菌1 实验背景农杆菌为什么能够介导基因转入植物？土壤农杆菌革兰氏阴性菌RiTi 质粒(tumor inducing plasmid ）约150~200 kb向植物细胞传递外源基因Ti1 实验背景农杆菌为什么能够介导基因转入植物？Vir 区:毒性区，包含多个致病基因，能激活T-DNA 的加工、剪切、复制及转入植物细胞，并使农杆菌表现出毒性。

农杆菌介导转化法

它是利用根癌农杆菌的Ti 质粒和发根农杆菌的Ri 质粒上的一段T-DNA区在农杆菌侵染植物形成肿瘤的过程中,T-DNA可以被转移到植物细胞并插入到染色体基因中。利用Ti质粒的这一天然的遗传转化特性,可将外源基因置换T-DNA中的非必需序列即可使外源基因整合到受体染色体而获得稳定的表达。
T-DNA区含选择标记基因＋报告基因
农杆菌介导转化法
转基因植物
一、植物转基因技术
• 植物转基因技术是生命科学前沿的重要领域之一。它是指用人工分离和修饰过的外源基因通过载体、媒体或其他物理、化学方法导入植物细胞中并得
到整合和表达，并通过对转化植株的鉴定选择，
从而使其遗传性状发生改变的技术。创造出人类
所需要的新品种或新物种。
目的基因的分离和克隆克隆基因的鉴定与分析
报告基因选择标记基因
遗传转化预备实验使用载体的T-DNA区
选择标记基因（npt－Ⅱ，hpt）确定选择用抗生素类型，报告基
因（gfp,gus)可以通过快速鉴定，迅速确定材料是否能够表达外源报告基因，及其统计转化效率，获得最佳诱导因素的梯度，从而优化目的基因的转化条件，之后进行目的基因转化。 gus基因的表达产物可以与化学试剂发生蓝色反应；gfp基因产物直接在蓝光下或紫外光下发出绿色荧光。
待改良植物的预处理受体细胞系统建立
目的基因载体构建
植物细胞的遗传转化目的基因在受体细胞的整合与表达转化细胞克隆的筛选转基因植株的获得与分子鉴定
田间性状鉴定
育成转基因植物新品种
二、植物基因转化方法
（一）外源基因的间接转化法（载体介导法）农杆菌介导法（双、单子叶植物）（二）外源基因的直接转化法物理法诱导DNA直接转化：基因枪法(单子叶植物 )、显微注射化学诱导DNA直接转化： PEG(原生质体）（三）花粉管通道法介导基因转化（种质系统介导法）

农杆菌介导的植物基因转移机制

农杆菌介导的植物基因转移机制农杆菌是一种常用的细菌工具，用于转移外源DNA到植物细胞中。

这一技术被广泛应用于农作物基因工程，以实现对特定基因的操作和操纵，以便对植物进行改良或对植物进行治疗。

农杆菌是一种典型的土壤细菌，可以通过嗅觉寻找营养物质，进而侵入细胞并获得光合作用所需的糖分和氮源。

农杆菌通过水平基因转移的生物化学机制，在与植物叶片接触的过程中，形成T-DNA复合物并将其传递到寄主细胞核中。

这一过程不仅是一种演化机制，也是一种有用的生物工具，可以通过控制T-DNA的进入和在植物中的表达，对基因进行某些操作和操纵，从而实现对植物的改良和治疗。

农杆菌介导的植物基因转移机制具有多种功能，它可以改善植物的耐受性、营养和生长特性，使得植物变得更加耐旱、耐寒、耐热、抗病等，并有助于提高植物的产量和品质。

农杆菌介导的植物基因转移机制的原理为：使用含T-DNA的负载物质，将DNA片段转化到细胞中，通过使用已浸涂的筛选代理转入细胞，并将T-DNA复制到植物细胞核中。

这样一来，细胞便可以利用这些DNA来进行氨基酸、蛋白质等重要分子的重构和重复组合。

农杆菌介导的植物基因转移机制在操作中需要注意选择不同的菌株、育种材料和先前的基因切割过程。

选用具有高转导率、灵活性和广泛适用性的农杆菌株能够增加基因转移的效率、增强其特异性和避免不必要的毒性反应。

选择合适的育种材料可以增强转基因植物的耐性、生长速度、生产能力和品质。

在进行先前的基因切割过程时，需要注意割断DNA的位置、大小和选择合适的负载载体，以避免过量或不足的载体以及不必要的病原菌受污染。

农杆菌介导的植物基因转移机制为农作物育种的研究和应用提供了前所未有的可能，它不仅能够对抗自然和病症的挑战，也能够为新一代的生物技术和医学研究带来更多的机遇和前景。

在未来，它将成为人类对生物蓝色打印移动痕迹的重要手段之一。

农杆菌介导的植物转基因技术

农杆菌介导的植物转基因技术
农杆菌介导的植物转基因技术（Agrobacterium-mediated plant transformation）是一种常用的植物遗传转化技术。

该技术利用农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）作为载体，将外源基因
导入目标植物细胞，使其产生转基因植物。

农杆菌天然具有植物细胞转化的能力。

当农杆菌感染植物时，其携带的质粒（T质粒）能够在植物细胞中插入外源基因，并
将其转化为转座子形式，随后将其整合入宿主植物基因组中。

转座子通常包含目标基因、转座酶和调控序列，它们共同确保外源基因正确表达。

T质粒还携带有自身所需的发育激素和植
物生长调节物质，以维持转化后细胞的生存和分裂。

农杆菌介导的植物转基因技术具有许多优点。

首先，它可以用于许多不同植物物种的基因转化。

其次，该技术可以实现整株或局部的基因转化，包括细胞、组织、器官或整个植株。

此外，农杆菌介导的转基因技术可实现稳定遗传转化，外源基因可以遗传到植物后代中。

最后，该技术对植物基因组中的特定位点插入外源基因，使得外源基因可以与内源基因进行正常结合。

随着转基因技术的不断发展，农杆菌介导的植物转基因技术仍然广泛应用于研究和农业生产领域。

它为植物功能研究、抗病虫害、提高产量和改善品质等方面提供了有效手段。

然而，农杆菌介导的转基因技术也面临着一些挑战，如转化效率低、插入位点随机性以及响应植物抗性等问题。

因此，研究人员不断探索新的转基因技术和改进农杆菌介导的植物转基因技术的方法，以改善转基因植物的性状和应用。

实验三(1)通过根瘤农杆菌转化拟南芥

4．将沉淀用200ml浸染液重悬，形成均匀的农杆菌悬浮液（OD600=0.8左右），并将农杆菌悬浮液转移到一个敞口的器皿中（500ml烧杯）。 5．选取初果期的健壮植株，带盆钵一起倒扣于盛有农杆菌悬浮液的容器上方，将整个花序浸入上述农杆菌悬浮液中约 20-30秒，注意叶片尽量不与浸染液接触。同一个烧杯中的农杆菌悬浮液可以转化10株或者更多株拟南芥。在此过程中，尽量避免将蛭石倒入农杆菌悬浮液中。 6．将盆钵取下，横放于暗箱中约24小时。注意保持一定的湿度。 7．24小时后将处理过的拟南芥植株放于22～25℃的光照条件下使其正常生长。 8．大约三周后收取成熟种子。
人工改造后的Ti质粒
1.保留T-DNA的转移功能，去掉T-DNA的致瘤性，有利于转化体再生植株； 2.在T-DNA左右边界序列之间构建一段DNA序列，其上含有一系列单个的限制性内切酶的识别位点、即单克隆位点，以利于插入外源DNA和其后的操作； 3.具有目的基因表达所需的启动子、终止子以及提供重组细胞筛选的标记基因等； 4.具有使质粒能够在大肠杆菌中进行复制的DNA复制起始位点，某些载体还同时带有可在农杆菌中进行复制的起始位点。
思考题
1．目前拟南芥稳定表达有几种基本的方法？试分析不同转化方法的优缺点。 2．植物转基因技术有哪些应用? 3．拟南芥作为研究植物发育的重要模式植株之一，请问有哪些特性？
培养基配制
准备—下周筛转基因种子和萌发实验。每两个人一组，准备下述平板：（1）1个含有卡那霉素（50 mg/L）的 1/2 MS固体平板；（2）1个1/2 MS固体平板（不含任何抗生素或者是激素）；（3）一个加200 mM NaCl 1/2 MS固体平板（不含抗生素）；（4）一个加1µM ABA 2 MS固体。灭菌后将平板倒好并再4 ℃保存备用。

简述利用农杆菌介导法进行植物基因转化的具体流程

简述利用农杆菌介导法进行植物基因转化的具体流程农杆菌介导的植物基因转化技术是利用细菌“农杆菌”这一自然载体，将特定的基因从一个植物中转移到另一个植物，或者将外源基因引入到植物体内，以获得期望的新特性。

近年来，越来越多的研究者开始应用农杆菌介导的植物基因转化技术，以获得期望的新基因和新特征。

农杆菌介导的植物基因转化一般可以分为以下步骤：（1）质粒制备：将要进行转化的外源基因连接到质粒上，形成可转化的质粒。

（2）农杆菌介导的转化：使用传统的农杆菌介导转化或者现代的抗性转化技术，将质粒转化到农杆菌中，从而形成转化的农杆菌。

（3）转化的农杆菌的特殊处理：将转化的农杆菌带入植物体内，通过不同的处理，使其能够将外源基因转入植物体内，形成期望的植物体。

（4）细胞内克隆：将转化后的植物细胞放入适当的生长培养基中，使其接受稳定的培养基环境，在此基础上进行细胞内克隆，以获得具备期望特性的植物体。

（5）鉴定特异性植物：为了取得具备期望特性的植物体，对转化过程中获得的基因进行特异性检测，以筛选出具有期望特性的基因组植物。

农杆菌介导的植物基因转化技术能够有效地促进基因转化，提高新基因的成功率。

在植物基因转化过程中，根据转化的具体目标，研究者可以选择不同形式的农杆菌载体来进行转化，具有非常好的灵活性和适应性。

另外，农杆菌介导的植物基因转化技术在植物基因工程应用中占有重要地位。

此外，农杆菌介导的植物基因转化技术还可以改变植物的形态和特性，提高农作物的抗病性和对环境的适应性，改善其营养价值，以提高其品质和市场价值。

例如，可以将外源抗性基因引入到植物体内，使其具有抗病虫性；也可以将外源优生基因引入到植物体内，使其具有高效优良的生产性状；还可以将外源营养基因引入植物体内，使其具备营养价值。

因此，农杆菌介导的植物基因转化技术能够更好地改善农作物的性能，为农业的发展提供重要的帮助。

总之，农杆菌介导的植物基因转化技术是一种新型的植物基因转化技术，它可以有效地将外源基因引入植物体内，以获得期望的新特性，可大大提高农作物的生产效率，在植物育种及农业发展中发挥着重要作用。

植物转基因技术

植物转基因技术植物转基因技术，也被称为植物基因工程技术，是一种利用生物技术手段改造植物基因组的方法。

通过将外源基因导入植物细胞中，植物转基因技术使得植物获得了新的性状或功能，从而在农业、环境保护和医药等领域带来了革命性的变化。

一、植物转基因技术的原理和方法植物转基因技术主要依靠DNA分子的重组和重构完成。

其中，常用的方法包括基因枪法、农杆菌介导转化法和双链RNA法。

基因枪法是将外源基因通过微粒轰击的方式送入植物细胞中，使得外源基因插入目标植物基因组中。

农杆菌介导转化法则通过利用农杆菌将外源基因转移到植物细胞中。

双链RNA法则是通过RNA干扰的方式，引导RNA分子与目标基因互作，从而达到基因沉默的目的。

二、植物转基因技术的应用植物转基因技术在农业领域中有着广泛的应用。

常见的转基因植物作物包括转基因水稻、转基因玉米、转基因大豆等。

这些作物通过引入耐草酮类和杀虫剂抗性基因，提高了作物的抗蚜、抗虫能力，从而减少了农药的使用量。

此外，转基因作物还能够抵抗病毒、细菌和真菌等各类病害，提高了作物的产量和质量。

植物转基因技术在环境保护领域也有重要的应用。

通过转基因技术改造植物的性状，例如增加植物的污染物吸收能力和金属离子富集能力，可以用于修复受到污染的土壤和水源。

此外，转基因技术还可以改善植物的耐旱、抗盐性能，以应对气候变化和土地退化等问题。

植物转基因技术还在医药领域有着巨大的潜力。

通过转基因技术，植物可以成为生产蛋白质药物和疫苗的“生物工厂”。

例如，转基因植物可以表达人类胰岛素、乳制品过敏症患者所需的乳头素等蛋白质，用于治疗糖尿病、乳制品过敏等疾病。

三、植物转基因技术的争议和风险尽管植物转基因技术在农业、环境保护和医药领域带来了巨大的潜力，但它也面临着一些争议和风险。

其中，最主要的争议之一是关于转基因食品的安全性问题。

有人担心转基因食品对人体健康产生潜在影响，而另一些人则认为已有的科学研究没有证明转基因食品有害。

植物细胞转基因技术

基因枪法最早是由美国康奈尔大学的Sanford最先提出的。它通过高速飞行的金属颗粒将包被其外的目的基因直接导入到受体细胞内，最后整合到植物基因组并得以表达从而实现基因转化的方法。1992 年，世界首例转基.2m钨弹头
装入
特制手枪
射击植物
优点：
克服了受体材料的限制，不必制备原生质体。实验操作简单易行，适合于大多数细胞或组织，
具有相当广泛的应用范围，已经成为植物细胞转化最有效方法之一。
缺点：
进去的DNA片段整合效率极低，遗传稳定性差，
拷贝数多，不易获得再生植株。
至今为止,该法已成为除了农杆菌介导转化法以外应用最广泛的基因转移技术。此法已在葡萄、水稻等植物转基因中应用,并获得转基因植株。基因枪法也可以有效地用于叶绿体的转化，还可以转移 RNA、DNA克隆等。
T-DNA能够进行高频率的转移,而且Ti质粒和 Ri质粒上可以插入到50kb的外源基因,因此Ti质粒和 Ri质粒就成为植物基因转化的理想载体系统。
T-DNA
T-DNA可以将其携带的外源基因整合到植物基因组中，T -DNA 上较重要的是 T 区两端左右边界各为 25bp 的重复序列。其中14bp 是中心,分 10bp 和4bp 两组,是完全保守的。这两个边界是 T -DNA 转移所必需的。其中尤以右边界最为重要。
基因导入时,通常需要把原生质体或培养的细胞固定在琼脂或低熔点的琼脂糖上,或用聚赖氨酸处理使原生质体附着在玻璃平板上,也可以通过一固着的毛细管将原生质体吸着在管口,再进行操作。
优点：
转化率高，特别是在没有合适的DNA载体系统时
更有价值
对转移物质没有限制，可选择受体细胞的核的接
受位点
受体不用特殊的选择系统可以控制转移的量和转移物的浓度

农杆菌介导的转化作用原理

农杆菌介导的转化作用原理
农杆菌介导的转化是一种生物技术方法，用于将外源DNA引入植物细胞中。

其原理是利用农杆菌生长势旺盛、易于培养的特点，将目标外源DNA导入到农杆菌的质粒中，形成重组质粒。

然后通过将转化质粒与植物细胞接触，使其外源DNA传递到植物细胞内部。

具体步骤如下：
1. 构建重组质粒：在质粒中插入目标外源DNA，通常使用限制性内切酶将目标基因插入到质粒的多克隆位点（多克隆位点是一段DNA序列，能够容纳外源DNA）。

2. 转化农杆菌：将质粒导入到农杆菌中，使其质粒与细菌细胞融合，形成重组菌株。

3. 培养菌株：培养重组菌株，使其扩增到大量细胞。

4. 处理植物组织：将希望转化的植物组织（例如幼嫩的叶片或胚）与农杆菌接触，使农杆菌与植物细胞发生互作用。

5. 重组质粒转入植物细胞：通过机械方法（例如悬浮培养）或生理方法（例如创伤诱导），使农杆菌穿过植物细胞的细胞壁，使重组质粒进入植物细胞。

6. 重组质粒在植物细胞中复制和表达：重组质粒在植物细胞中复制，并将插入的目标基因转录和翻译为蛋白质。

通过农杆菌介导的转化方法，可以有效地将外源基因导入到植物细胞中，实现基
因转移和基因表达的目的。

这种方法在植物基因工程和转基因技术中得到广泛应用。

农杆菌介导遗传转化原理

农杆菌介导遗传转化原理农杆菌介导遗传转化是一种常用的遗传工程技术，用于将外源基因导入植物细胞中。

它的原理是利用农杆菌与植物之间相互作用的特点，通过构建适当的载体将外源基因导入农杆菌，然后通过农杆菌感染植物的细胞，将外源基因转移到植物细胞内，使其表达。

农杆菌是一种革兰氏阴性细菌，具有携带可导致植物组织的病变形成的质体。

这种质体称为农杆菌的转座质粒（Ti质粒），其中包含了表达病原蛋白的基因。

在自然界中，农杆菌通过感染植物细胞并将自身质粒中转座基因转移到植物细胞中，从而引起植物组织的异常增生和瘤形成。

1.构建适当的载体：首先需要构建一个适合农杆菌介导遗传转化的载体，该载体通常包含农杆菌的图纸质粒与外源基因。

2. 转座基因的导入：将外源基因转移到农杆菌中，一般利用基因工程技术将外源基因插入到农杆菌的质粒中，通常选用表达农杆菌亲和素（VirA/VirG）基因的质粒。

这些基因能够诱导农杆菌感染植物细胞并转座到植物基因组中。

3. 农杆菌感染植物细胞：利用农杆菌对植物细胞的感染能力，将转座基因导入植物细胞中。

通常使用离体培养的植物组织进行转化，如幼苗的叶片、幼芽、胚轴等。

在转化过程中，植物组织被浸泡在含有农杆菌的培养液中，农杆菌利用其细菌素（VirE/VirF）蛋白，将转座质粒导入植物细胞中。

4.外源基因的整合与表达：经过转化的植物细胞在激素的诱导下会形成植物的癌瘤样结构，其中农杆菌转座质粒中的外源基因将被整合到植物基因组中。

随着癌瘤的生长，外源基因会在植物组织中得到表达。

5.植物再生和筛选：癌瘤样组织可通过激素的去除和调节激素比例来诱导植物再生。

然后通过选择合适的培养基和条件培养植物胚，获得含有外源基因的转基因植株。

农杆菌介导遗传转化技术广泛应用于植物基因工程中，可用于植物基因功能研究、育种改良、生产含有特定蛋白质的转基因植物等。

这种遗传转化技术具有高效性、简便性和广泛适用性的优点，已被应用于多种作物植物的转基因研究和应用实践中。

农杆菌如何介导植物遗传转化

农杆菌如何介导植物遗传转化？植物遗传转化技术植物遗传转化技术也称植物转基因技术，是应用DNA重组技术将外源基因通过生物、物理或化学等手段导入植物基因组，以获得外源基因稳定遗传和表达的植物遗传改良的一门技术。

目前最常用的转基因方法是基因枪法和农杆菌法。

基因枪法的基本原理是利用表面附着有外源DNA的金属微粒在高压装置中加速后高速运动到受体细胞中，从而达到转化DNA的目的。

但是基因枪法与农杆菌介导法相比，存在着转化率低、遗传稳定性较差、外源DNA整合机理不清楚、得到的转化体往往是嵌合体、转入外源基因的沉默现象突出等缺点。

接下来，这篇文章着重介绍农杆菌介导的植物遗传转化。

优点农杆菌作为一种天然的植物基因转化系统，其介导的转化属于纯生物学的过程，与其它转化方法相比具有明显的优点，主要包括：(1)转化频率高；(2)可导入大片段的DNA，且导入植物细胞的片段确切；(3)导入基因拷贝数低，大多只有1-3个，表达效果好，能稳定遗传，多数符合盂德尔遗传规律。

而且，从大量的报道可以发现，农杆菌的寄主范围有很大的扩展，已经延伸到了原核生物、真菌甚至人类细胞等非植物领域。

原理农杆菌是一种革兰氏阴性细菌，它对寄主细胞的转化是借助诱导瘤细胞(tumor-inducing, Ti)质粒将其中一段特定的DNA片断转入寄主细胞基因组的过程。

在自然环境中，被转移的DNA (T-DNA)携带了一套致瘤基因和冠瘿碱代谢基因，它们在植物中的表达可引起被侵染组织产生肿瘤并合成冠瘿碱作为细菌的氮源。

利用分子克隆技术可以将T-DNA替换为目标基因，使农杆菌成为一个能有效将外源基因导入植物的天然工具。

图1 农杆菌介导的基因转化。

此外，有多种植物蛋白质也参与了农杆菌介导的基因转化过程，主要作用于T-DNA胞内运输、进入细胞核以及整合阶段。

因为农杆菌主要利用植物细胞内的生物过程(例如DNA和蛋白质运输、靶蛋白水解和DNA修复)来转化其受体，研究这些基本的植物细胞生物学机制有助于扩大农杆菌的受体范围，同样也可促进转化过程和转基因植物的产物控制。

(完整版)农杆菌介导法

1981年，Ooms et al.发现Ti质粒上有致瘤区(virulence region)，Vir区。
Ti质粒
Ti质粒是根癌农杆菌细胞核外存在的一种环状双链DNA分子，长度约200kb，平均周长54.1－75 .4 um，分子质量为（90－ 150）×106 Da。在温度低于30℃的条件下， Ti质粒可稳定地存在于根癌农杆菌细胞内。
的冠瘿碱类型分为三类：章鱼碱(octopine)类胭脂碱(nopaline)类农杆碱（agropine）类。
Ti质粒携带着既能分解又能合成这些化合物的酶类和相应基因，然而冠瘿碱合成基因却不能在根癌农杆菌中表达，它们只有进入植物细胞后才能表达，Ti质粒上的冠瘿碱分解基因产物却能分解冠瘿碱，为宿主细胞提供能源、氮源和碳源。
子的刺激，Ti质粒vir区毒性
基因被激活和表达。
目前已经发现9种信号因子，均为水溶性酚类化合物。其中乙酰丁香酮（acetosyringone，AS）和羟基乙酰丁香酮（OH-AS）的作用较强，儿茶酚、原儿茶酚、没食子酸、焦性没食子酸、二羟基苯甲酸、香草酚和对羟基苯酚处理农杆菌时也对Vir区的基因表达起促进作用。
脂碱型根癌农杆菌Ti质粒中TDNA的左右两侧是一段24bp 的重复序列,构成T-DNA的边界序列(border sequence), 分别称为左边界(left border,LB)和右边界(right border,RB).在某些章鱼碱型根癌农根癌农杆菌Ti质粒中TDNA是以两个分开的独立片段形式存在，即T-DNA左边区段和T-DNA右边区段。研究表明，插入在T-DNA边界序列之间的任何DNA都可被转到植物染色体中。因此Ti质粒可用做外源目的基因的载体。
农杆菌介导转化法

植物农杆菌介导的外源基因转移技术及其应用

植物农杆菌介导的外源基因转移技术及其应用近年来，随着生物学和生物技术的不断发展，基因转移技术也得到了重要的突破。

植物农杆菌介导的外源基因转移技术（agrobacterium-mediated transformation）成为了一种非常常见的基因转移方法，被广泛应用于农业、植物生理学、生物技术等领域。

本文将详细介绍这一技术及其应用。

一、植物农杆菌介导的外源基因转移技术原理植物农杆菌是一种生活在土壤中的细菌，广泛存在于自然环境中。

该细菌有着自身特殊的基因转移系统，能够将其自身的T-DNA（转移DNA）序列转移到宿主植物的染色体中。

这一转移系统是由植物农杆菌在与宿主植物接触的过程中产生的，它通常被称为“水平基因转移”。

agrobacterium-mediated transformation技术就是通过利用植物农杆菌的这一转移系统，将人工构建的外源DNA序列转移到宿主植物的DNA中，实现基因转移的过程。

一般而言，该技术可以分为以下几个步骤：1.构建转化载体。

将外源DNA与植物农杆菌的转化载体pTi（T-DNA合成区）组装成转化载体，在该载体上加入适当的激活元件和标记元件，以便对转化结果进行筛选和鉴定。

2.感染宿主植物。

将构建好的转化载体稀释至适当的浓度后，在适当的营养条件下，静置一段时间使之与宿主植物接触，从而实现转移。

3.筛选转化率。

应用适当的筛选方法，对转化结果进行筛选，得到所需的转化率。

二、应用1.基因研究植物农杆菌介导的基因转移技术已被广泛应用于生物学领域中的基因研究。

该技术可以使研究人员将人工合成的DNA序列导入到宿主植物中，从而构建各种生物表型。

利用该技术，可以对特定的基因进行定向研究，解析其特性及功能。

2.品种改良与其他农业生产方法相比，植物农杆菌介导的基因转移技术拥有一些独特的优势。

例如，它可以方便地实现外源基因的稳定表达，并且可以避免其他基因编辑技术可能带来的副作用。

因此，该技术已被广泛应用于植物品种的改良中，使得研究人员可以进行一些关键基因的定向编辑，以实现农业产业的高效生产。

农杆菌介导转化法的概述完整版

农杆菌介导转化法的概述完整版农杆菌介导转化法（Agrobacterium-mediated transformation）是生物技术领域中常用的一种基因转化技术，它是利用植物病原细菌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens 或 Agrobacterium rhizogenes）在哺乳动物细胞和植物细胞之间转移DNA的过程.Ti质粒在不同的农杆菌株中具有普遍性，主要包含两个部分，一部分是右边界（RB）和左边界（LB）之间的T-DNA区域，另一部分是辅助基因的区域。

T-DNA区域是真正起作用的区域，它包含多个基因，其中最重要的是含有颠倒重复序列的两个直接重复序列（Direct Repeat，DR）以及插入块（Insert）。

在农杆菌内部，T-DNA区域通过辅助基因的编码产物，如细菌激素合成生物合成酶（enzymes），被剪切出来。

剪切后的T-DNA区域携带着颠倒重复序列的两个直接重复序列（DR），与全身黑素瘤疫斑细菌的Direct Repeat（DR）高度相似，它作为单链向外产生（unidirectional）的。

Ti质粒上还存在两个移去片段（Removal Sequences）的辅助基因，它们能够结合T-DNA的两个断点，从而使T-DNA脱离质粒。

1.选择合适的农杆菌菌株：选择具有较高转化效率且对目标植物亲和性强的农杆菌株。

2.制备适宜的载体：选择合适的Ti质粒载体，可根据需要进行修饰和改造，添加目标基因、标记基因和选择基因等。

3.构建转化质粒：将目标基因和其它所需基因与农杆菌Ti质粒进行重组，得到构建好的转化质粒。

4.培养农杆菌：将重组后的质粒转化到农杆菌中，然后利用适宜的培养基进行培养和增殖，以形成菌液。

5.感染植物细胞：将培养好的农杆菌菌液与目标植物细胞接触，通过创伤组织或利用组织培养等方式实现细菌进入植物细胞内部。

6.培养转化物：将感染的组织培养在适宜的培养基上，培养一段时间，以使转化进行进一步发展，形成完整的植株。

发根农杆菌介导的植物基因转化.优秀PPT资料

E D C
G vir
B A
T-DNA
LB
RB Hairy root genes and opine synthase
Ri
opine
catabolism
ori
Ri 质粒感染过程
1. 发根农杆菌感染植物伤口后，受伤的植物细胞合成特殊的小分子化合物，诱导 Ri 质粒的Vir区基因群活化；
2. 在Vir区基因表达产生的酶作用下T－DNA被切下； 3. T－DNA转移进细胞并整合到植物基因组DNA中； 4. T－DNA在细胞中转译，使宿主植物产生发根
发根农杆菌介导的植物基因转化
发根（hairy root）是什么？
发根是发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes)感染整体
植株或其某一器官、组织、单个细胞甚至原生质体后，产生的一种形态上与植物气生根类似的根状器官.
什么是发根农杆菌 ?
发根农杆菌（A. rhizogenes）来自土壤, 呈棒(杆) 状, 细胞质内有一种质粒(plasmid）, 叫诱根质粒（root inducing plasmid）, 简称 Ri 质粒, 与发根的诱导有关. 发根农杆菌能侵染大多数双子叶植物和少数单子叶植物 .
将菌株、植物、外植体进行不同的组合，会导致发根发根农杆菌能侵染大多数双子叶植物和少数单子叶植物 .
对Ri质粒的敏感性：双子叶植物 >单子叶植物，草本植物>木本植物
一般为每月增殖数十倍，最高可达上千倍（如天仙子发根每月增殖2500～5000倍）
诱导率的变化培养基：基本培养基、碳源、氮源、pH值等
光照
4. 其它
感染前高渗处理、诱导培养时添加生长素等
影响发根培养及次生代谢物合成的因素

农杆菌转化法基本操作与理论

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三、操作方法
1、获取目的基因。用限制酶切割下目的基因。 2、基因表达载体的构建。将目的基因与载体（大多数选用质粒）用DNA连接酶连接起来。 3、将目的基因导入受体细胞。将含目的基因的重组质粒导入农杆菌（农杆菌为受体细胞）。 4、目的基因的检测与鉴定。用DNA分子杂交技术/分子杂交技术/抗原-抗体杂交/个体生物学几种方法进行检验（根据要求选取不同方法）。 5、最后将成功表达的细胞导入植物体内，对植物体进行个体生物学水平鉴定。
农杆菌介导转化法
生物技术08-1 梁荣洪
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一、简介
农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌，它能在自然条件下趋化性地感染大多数双子叶植物的受伤部位，并诱导产生冠痪瘤或发状根。根想农杆菌和发根农杆菌细胞中分别含有Ti质粒和Ri质粒，其上有一段T—DNA，农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将T—DNA插入到植物基因组中。因此，农杆菌是一种天然的植物遗传转化体系。人们将目的基因插入到经过改造的T—DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，然后通过细胞和组织培养技术，再生出转基因植株。农杆菌介导法起初只被用于双子叶植物中，近年来，农杆菌介导转化在一些单子叶植物(尤其是水稻)中也得到了广泛应用。
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二、原理
农杆菌主要有两种：根癌农杆菌和发根农杆菌。
根癌农杆菌能在自然条件下趋化性地感染140多种双子叶植物或裸子植物的受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤。引发冠瘿瘤的原因是，Ti质粒上的T-DNA上有8个左右的基因在植物细胞内表达，指导合成一种非常寻常的化合物冠瘿碱，进而引起转化细胞癌变。而发根农杆菌则诱导产生发状根，其特征是大量增生高度分支的根系。根癌农杆菌的Ti质粒和发根农杆菌的Ri质粒上有一段T-DNA，农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将T-DNA插入到植物基因组中。因此，农杆菌是一种天然的植物遗传转化体系，被誉为“自然界最小的遗传工程师”。可以通过将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移和整合，然后通过细胞和组织培养技术，得到转基因植物。