农杆菌介导的植物转基因技术学习资料

六、实验结果
农杆菌侵染时间
8min
10min 12min
15min
20min
25min
10
外植体数量
10
10
10
10
10
染菌情况
分化情况
转化率
七、注意事项
1、在操作过程中，一定要保证无菌，整个操作过程均需要再无菌 的条件下完成。
2、进入超净工作台前，要检查紫外灯是否关闭，避免对皮肤造成 损害。
3、进入超净工做台进行实验时，要进行表面消毒，用酒精喷洒并 擦净台面和双手。
（六）除菌
取出外植体，将其放在无菌
滤纸上，充分吸干菌液，避免菌 液残留在红花子叶上，使其在培 养过程中，菌液过量生长。
（七）侵染后的培养
首先将红花子叶置于共培养上，使其生长。培养一周后，将其转入 分化培养基上，进行培养，待其诱导分化出不定芽后，继续培养，不定 芽分化成苗后，将其移入生根培养基中，培养获得转基因植株。
八、思考题
1、农杆菌转化的基本步骤有哪些？ 2、农杆菌遗传转化的优缺点？ 3、哪些措施可以提高农杆菌介导的转化率？
三、实验原理
根癌农杆菌，属根瘤菌科，为革兰 氏阴性。根癌农杆菌感染双子叶植物时， 可在被感染的伤口形成冠瘿瘤,诱导有 关的质粒为Ti质粒 。Ti质粒上有一段TDNA区，人们将外源基因插入到TDNA区，借助农杆菌的感染使携带外 源基因的T-DNA区转入植物基因组中， 从而实现外源基因向植物细胞的转移和 整合。
（三）离心，收集菌体
将农杆菌离心，2000 rpm，10min，收集菌体, 目的是去除细菌培养基 的高浓度盐。
（四）重悬菌体
用液体MS培养基将菌 体用移液枪吹打起来， 使菌体重新悬浮，其目 的是减少细菌培养基对 植物体的伤害。
（五）侵染转化
将预培养的红花子叶放入
菌液中浸染8-25min，在侵染过 程中轻轻摇晃，确保菌液充分进 入到红花子叶中。
L
phaP
B
Target gene
phaT
35S
Bar
NOS(A)
R
B
PstI
NcoI
HindIII
kpnI
speI
XmnI
五、实验方法
（wk.baidu.com）农杆菌菌液的制备
用牙签蘸取农杆菌，在 YEB培养基上划线，达到纯 化农杆菌的目的。
（二）制备工程菌（摇菌）
用牙签挑取划线得到的 单菌落，将其置于YEB液体 培养基中，进行液体振荡培 养，28℃,180rpm，制备用 于侵染转化的工程菌。
分子生物学操作技术之实验五
农杆菌介导的植物转基因技术
讲课人：杨晶
一、转基因植物概述
转基因玉米
转基因辣椒
转基因玫瑰
日闭幕的东京国际花卉博览会上，全球首批真正的蓝玫瑰首次在公众面前亮相。
二、实验目的
1、学习真核生物的转基因技术及农杆菌介导的转化原理； 2、掌握农杆菌介导转化植物的实验方法，了解转基因技术 的操作流程。
农杆菌 感染柳树
产生 冠瘿瘤
四、实验仪器与试剂
1、仪器：超净工作台，离心机，恒温摇床，组织培养室；
2、试剂：农杆菌EHA105，YEB培养基，MS液体培养基，共培 养基（MS+6-BA+NAA），分化培养基（MS+6-BA） 生根培养基（MS+IBA+NAA）；
3、材料：红花无菌苗。
改造后的农杆菌的T-DNA区，含有目的地基因和Bar筛选基因