农杆菌介导的植物转基因技术学习资料
农杆菌的活化培养及介导的遗传转化
农杆菌的活化培养及介导的遗传转化一、目的要求通过实验掌握农杆菌的活化与培养技术与农杆菌介导获得目的基因的转化植株。
二、基本原理农杆菌共培养法最早是由Marton 等（1979 年）以原生质体为受体建立起来的，经过一系列改进后，目前已经成为最常用的转化方法。
共培养法是利用Ti 质粒系统，将农杆菌与植物原生质体、悬浮培养细胞、叶盘、睫段等共同培养的一种转化方法。
三、材料及方法1.含目的基因共整合载体或双元载体的根癌农杆菌。
2.植物幼苗。
（一）细菌培养液直接浸染法操作︰（1）无菌受体材料的准备︰叶片、睫段、胚轴、子叶等均可做受体材料，有两种来源。
取自无菌试管苗。
取自田间或温室栽培植株︰叶片、睫尖、睫段用蒸馏水冲冼1 遍后，70％乙醇洗45 秒，0.1％升汞消毒6～8 分钟，无菌水冲洗三遍，无菌滤纸吸干水分。
（2）受体材料预培养︰将无菌叶片剪成0.5cm×0.5cm 的小块或用6mm 打孔器凿成圆盘，无菌胚轴、睫切成约0.8～1cm 长的切段，接种在愈伤组织诱导或分化培养基上进行预培养，注意叶片近轴面向下︰预培养2～3 天，材料切口处刚刚开始膨大时即可进行侵染。
（3）农杆菌培养︰从平板上挑取单菌落，接种到20mL 附加相应抗生素的细菌培养液体培养基（pH7.0）中，在恒温摇床上，于27℃, 180r/ min 培养至OD600 为0.6～0.8。
取OD600 为0.6～0.8 的菌液，按1％～2％的比例，转入新配制的无抗生素的细菌培养液体培养基中，可在与上相同的条件下培养6 小时左右，OD600 为0.2～0.5 时即可用于转化；或同时加入100～500μmol/的AS；（4）侵染︰于超净工作台上，将菌液倒入无菌小培养皿中（可根据材料对菌液的敏感情况进行不同倍数的稀释）。
从培养瓶中取出预培养过的外植体，放入菌液中，浸泡适当时间（一般1～5 分钟，不同材料处理时间不同）。
取出外植体置于无菌滤纸上吸去附着的菌液。
20 【终版】农杆菌介导的烟草转gfp基因(叶盘法)
1 实验背景什么是“植物转基因技术”“转基因植物”？植物转基因技术：把从动物、植物或微生物中分离获得的目的基因，或者经过修饰的目的基因，通过各种方法转移重组到植物基因组内，使之稳定遗传并赋予植物新的遗传性状的方法。
转基因植物：通过植物转基因技术获得的、整合有外源基因的植物个体。
1 实验背景为什么要进行植物转基因？优势：◆农业：生产抗逆、高产、优质、抗病虫、除草剂、营养品质改良等优良性状的作物；遗传育种等。
◆制药、化工等：可作为生物反应器，生产药用蛋白和有用次生代谢物，或生产某些有机化合物等。
◆园艺：美化生活等，如蓝玫瑰等。
◆科学研究：生物学、遗传学等多领域基础研究等。
1 实验背景怎样将外源基因转入植物？间接转化法(载体介导)病毒介导法农杆菌介导法（双子叶/单子叶）种质系统介导法胚囊和子房注射法生殖细胞侵染法花粉管通道法直接转化法物理法化学法基因枪法(单子叶植物)显微注射法电击法超声波法PEG 法脂质体法1 实验背景各种转基因方法的区别是什么？（引自崔广荣，2003）1 实验背景针对不同植物，怎样选择转基因方法？目前转基因植株中，约80%以上通过“农杆菌介导转化法”获得。
植株特点首选方法备注对农杆菌敏感农杆菌介导法效率高，方法成熟，转基因植株遗传稳定。
原生质体培养容易直接转化法（如PEG 法）转化率高，可克服转基因植株嵌合体的难题。
多胚珠花粉管通道法提高转化率子房中有较大单胚珠植物(如核果类)显微注射法提高转化率转化难度大的植物基因枪法其它方法不可行时的备选放射性农杆菌发根农杆菌Agrobacterium rhizogenes根瘤农杆菌Agrobacterium tumefaciens旋钩子农杆菌1 实验背景农杆菌为什么能够介导基因转入植物？土壤农杆菌革兰氏阴性菌RiTi 质粒(tumor inducing plasmid ）约150~200 kb向植物细胞传递外源基因Ti1 实验背景农杆菌为什么能够介导基因转入植物？Vir 区:毒性区，包含多个致病基因，能激活T-DNA 的加工、剪切、复制及转入植物细胞，并使农杆菌表现出毒性。
农杆菌介导转化法
它是利用根癌农杆菌的Ti 质粒和发根农杆菌的Ri 质粒上的一段T-DNA区在农杆菌侵染植物形成 肿瘤的过程中,T-DNA可以被转移到植物细胞并 插入到染色体基因中。利用Ti质粒的这一天然的 遗传转化特性,可将外源基因置换T-DNA中的非 必需序列即可使外源基因整合到受体染色体而获 得稳定的表达。
T-DNA区含选择标记基因＋报告基因
农杆菌介导转化法
转基因植物
一、植物转基因技术
• 植物转基因技术是生命科学前沿的重要领域之一。 它是指用人工分离和修饰过的外源基因通过载体、 媒体或其他物理、化学方法导入植物细胞中并得
到整合和表达，并通过对转化植株的鉴定选择，
从而使其遗传性状发生改变的技术。创造出人类
所需要的新品种或新物种。
目的基因的分离和克隆 克隆基因的鉴定与分析
报告基因 选择标记基因
遗传转化预备实验使用载体的T-DNA区
选择标记基因（npt－Ⅱ，hpt）确定选择用抗生素类型，报告基
因（gfp,gus)可以通过快速鉴定，迅速确定材料是否能够表达外源报 告基因，及其统计转化效率，获得最佳诱导因素的梯度，从而优化 目的基因的转化条件，之后进行目的基因转化。 gus基因的表达产物可以与化学试剂发生蓝色反应；gfp基因产物 直接在蓝光下或紫外光下发出绿色荧光。
待改良植物的预处理 受体细胞系统建立
目的基因载体构建
植物细胞的遗传转化 目的基因在受体细胞的整合与表达 转化细胞克隆的筛选 转基因植株的获得与分子鉴定
田间性状鉴定
育成转基因植物新品种
二、植物基因转化方法
（一）外源基因的间接转化法（载体介导法） 农杆菌介导法（双、单子叶植物） （二）外源基因的直接转化法 物理法诱导DNA直接转化： 基因枪法(单子叶植物 )、显微注射 化学诱导DNA直接转化： PEG(原生质体） （三）花粉管通道法介导基因转化（种质系统介导法）
农杆菌介导的植物基因转移机制
农杆菌介导的植物基因转移机制农杆菌是一种常用的细菌工具，用于转移外源DNA到植物细胞中。
这一技术被广泛应用于农作物基因工程，以实现对特定基因的操作和操纵，以便对植物进行改良或对植物进行治疗。
农杆菌是一种典型的土壤细菌，可以通过嗅觉寻找营养物质，进而侵入细胞并获得光合作用所需的糖分和氮源。
农杆菌通过水平基因转移的生物化学机制，在与植物叶片接触的过程中，形成T-DNA复合物并将其传递到寄主细胞核中。
这一过程不仅是一种演化机制，也是一种有用的生物工具，可以通过控制T-DNA的进入和在植物中的表达，对基因进行某些操作和操纵，从而实现对植物的改良和治疗。
农杆菌介导的植物基因转移机制具有多种功能，它可以改善植物的耐受性、营养和生长特性，使得植物变得更加耐旱、耐寒、耐热、抗病等，并有助于提高植物的产量和品质。
农杆菌介导的植物基因转移机制的原理为：使用含T-DNA的负载物质，将DNA片段转化到细胞中，通过使用已浸涂的筛选代理转入细胞，并将T-DNA复制到植物细胞核中。
这样一来，细胞便可以利用这些DNA来进行氨基酸、蛋白质等重要分子的重构和重复组合。
农杆菌介导的植物基因转移机制在操作中需要注意选择不同的菌株、育种材料和先前的基因切割过程。
选用具有高转导率、灵活性和广泛适用性的农杆菌株能够增加基因转移的效率、增强其特异性和避免不必要的毒性反应。
选择合适的育种材料可以增强转基因植物的耐性、生长速度、生产能力和品质。
在进行先前的基因切割过程时，需要注意割断DNA的位置、大小和选择合适的负载载体，以避免过量或不足的载体以及不必要的病原菌受污染。
农杆菌介导的植物基因转移机制为农作物育种的研究和应用提供了前所未有的可能，它不仅能够对抗自然和病症的挑战，也能够为新一代的生物技术和医学研究带来更多的机遇和前景。
在未来，它将成为人类对生物蓝色打印移动痕迹的重要手段之一。
农杆菌介导的植物转基因技术
农杆菌介导的植物转基因技术
农杆菌介导的植物转基因技术（Agrobacterium-mediated plant transformation）是一种常用的植物遗传转化技术。
该技术利用农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）作为载体，将外源基因
导入目标植物细胞，使其产生转基因植物。
农杆菌天然具有植物细胞转化的能力。
当农杆菌感染植物时，其携带的质粒（T质粒）能够在植物细胞中插入外源基因，并
将其转化为转座子形式，随后将其整合入宿主植物基因组中。
转座子通常包含目标基因、转座酶和调控序列，它们共同确保外源基因正确表达。
T质粒还携带有自身所需的发育激素和植
物生长调节物质，以维持转化后细胞的生存和分裂。
农杆菌介导的植物转基因技术具有许多优点。
首先，它可以用于许多不同植物物种的基因转化。
其次，该技术可以实现整株或局部的基因转化，包括细胞、组织、器官或整个植株。
此外，农杆菌介导的转基因技术可实现稳定遗传转化，外源基因可以遗传到植物后代中。
最后，该技术对植物基因组中的特定位点插入外源基因，使得外源基因可以与内源基因进行正常结合。
随着转基因技术的不断发展，农杆菌介导的植物转基因技术仍然广泛应用于研究和农业生产领域。
它为植物功能研究、抗病虫害、提高产量和改善品质等方面提供了有效手段。
然而，农杆菌介导的转基因技术也面临着一些挑战，如转化效率低、插入位点随机性以及响应植物抗性等问题。
因此，研究人员不断探索新的转基因技术和改进农杆菌介导的植物转基因技术的方法，以改善转基因植物的性状和应用。
实验三(1)通过根瘤农杆菌转化拟南芥
4．将沉淀用200ml浸染液重悬，形成均匀的农杆菌悬浮液 （OD600=0.8左右），并将农杆菌悬浮液转移到一个敞口 的器皿中（500ml烧杯）。 5．选取初果期的健壮植株，带盆钵一起倒扣于盛有农杆菌悬 浮液的容器上方，将整个花序浸入上述农杆菌悬浮液中约 20-30秒，注意叶片尽量不与浸染液接触。同一个烧杯中 的农杆菌悬浮液可以转化10株或者更多株拟南芥。在此过 程中，尽量避免将蛭石倒入农杆菌悬浮液中。 6．将盆钵取下，横放于暗箱中约24小时。注意保持一定的 湿度。 7．24小时后将处理过的拟南芥植株放于22～25℃的光照条 件下使其正常生长。 8．大约三周后收取成熟种子。
人工改造后的Ti质粒
1.保留T-DNA的转移功能，去掉T-DNA的致瘤性， 有利于转化体再生植株； 2.在T-DNA左右边界序列之间构建一段DNA序列， 其上含有一系列单个的限制性内切酶的识别位点、 即单克隆位点，以利于插入外源DNA和其后的操 作； 3.具有目的基因表达所需的启动子、终止子以及提 供重组细胞筛选的标记基因等； 4.具有使质粒能够在大肠杆菌中进行复制的DNA复 制起始位点，某些载体还同时带有可在农杆菌中 进行复制的起始位点。
思 考 题
1．目前拟南芥稳定表达有几种基本的方法？ 试分析不同转化方法的优缺点。 2．植物转基因技术有哪些应用? 3．拟南芥作为研究植物发育的重要模式植株 之一，请问有哪些特性？
培养基配制
准备—下周筛转基因种子和萌发实验。每两个人一 组，准备下述平板： （1）1个含有卡那霉素（50 mg/L）的 1/2 MS固体 平板； （2）1个1/2 MS固体平板（不含任何抗生素或者是 激素）； （3）一个加200 mM NaCl 1/2 MS固体平板（不含 抗生素）； （4）一个加1µM ABA 2 MS固体。 灭菌后将平板倒好并再4 ℃保存备用。
简述利用农杆菌介导法进行植物基因转化的具体流程
简述利用农杆菌介导法进行植物基因转化的具体流程农杆菌介导的植物基因转化技术是利用细菌“农杆菌”这一自然载体，将特定的基因从一个植物中转移到另一个植物，或者将外源基因引入到植物体内，以获得期望的新特性。
近年来，越来越多的研究者开始应用农杆菌介导的植物基因转化技术，以获得期望的新基因和新特征。
农杆菌介导的植物基因转化一般可以分为以下步骤：（1）质粒制备：将要进行转化的外源基因连接到质粒上，形成可转化的质粒。
（2）农杆菌介导的转化：使用传统的农杆菌介导转化或者现代的抗性转化技术，将质粒转化到农杆菌中，从而形成转化的农杆菌。
（3）转化的农杆菌的特殊处理：将转化的农杆菌带入植物体内，通过不同的处理，使其能够将外源基因转入植物体内，形成期望的植物体。
（4）细胞内克隆：将转化后的植物细胞放入适当的生长培养基中，使其接受稳定的培养基环境，在此基础上进行细胞内克隆，以获得具备期望特性的植物体。
（5）鉴定特异性植物：为了取得具备期望特性的植物体，对转化过程中获得的基因进行特异性检测，以筛选出具有期望特性的基因组植物。
农杆菌介导的植物基因转化技术能够有效地促进基因转化，提高新基因的成功率。
在植物基因转化过程中，根据转化的具体目标，研究者可以选择不同形式的农杆菌载体来进行转化，具有非常好的灵活性和适应性。
另外，农杆菌介导的植物基因转化技术在植物基因工程应用中占有重要地位。
此外，农杆菌介导的植物基因转化技术还可以改变植物的形态和特性，提高农作物的抗病性和对环境的适应性，改善其营养价值，以提高其品质和市场价值。
例如，可以将外源抗性基因引入到植物体内，使其具有抗病虫性；也可以将外源优生基因引入到植物体内，使其具有高效优良的生产性状；还可以将外源营养基因引入植物体内，使其具备营养价值。
因此，农杆菌介导的植物基因转化技术能够更好地改善农作物的性能，为农业的发展提供重要的帮助。
总之，农杆菌介导的植物基因转化技术是一种新型的植物基因转化技术，它可以有效地将外源基因引入植物体内，以获得期望的新特性，可大大提高农作物的生产效率，在植物育种及农业发展中发挥着重要作用。
植物转基因技术
植物转基因技术植物转基因技术，也被称为植物基因工程技术，是一种利用生物技术手段改造植物基因组的方法。
通过将外源基因导入植物细胞中，植物转基因技术使得植物获得了新的性状或功能，从而在农业、环境保护和医药等领域带来了革命性的变化。
一、植物转基因技术的原理和方法植物转基因技术主要依靠DNA分子的重组和重构完成。
其中，常用的方法包括基因枪法、农杆菌介导转化法和双链RNA法。
基因枪法是将外源基因通过微粒轰击的方式送入植物细胞中，使得外源基因插入目标植物基因组中。
农杆菌介导转化法则通过利用农杆菌将外源基因转移到植物细胞中。
双链RNA法则是通过RNA干扰的方式，引导RNA分子与目标基因互作，从而达到基因沉默的目的。
二、植物转基因技术的应用植物转基因技术在农业领域中有着广泛的应用。
常见的转基因植物作物包括转基因水稻、转基因玉米、转基因大豆等。
这些作物通过引入耐草酮类和杀虫剂抗性基因，提高了作物的抗蚜、抗虫能力，从而减少了农药的使用量。
此外，转基因作物还能够抵抗病毒、细菌和真菌等各类病害，提高了作物的产量和质量。
植物转基因技术在环境保护领域也有重要的应用。
通过转基因技术改造植物的性状，例如增加植物的污染物吸收能力和金属离子富集能力，可以用于修复受到污染的土壤和水源。
此外，转基因技术还可以改善植物的耐旱、抗盐性能，以应对气候变化和土地退化等问题。
植物转基因技术还在医药领域有着巨大的潜力。
通过转基因技术，植物可以成为生产蛋白质药物和疫苗的“生物工厂”。
例如，转基因植物可以表达人类胰岛素、乳制品过敏症患者所需的乳头素等蛋白质，用于治疗糖尿病、乳制品过敏等疾病。
三、植物转基因技术的争议和风险尽管植物转基因技术在农业、环境保护和医药领域带来了巨大的潜力，但它也面临着一些争议和风险。
其中，最主要的争议之一是关于转基因食品的安全性问题。
有人担心转基因食品对人体健康产生潜在影响，而另一些人则认为已有的科学研究没有证明转基因食品有害。
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（三）离心，收集菌体
将农杆菌离心，2000 rpm，10min，收集菌体, 目的是去除细菌培养基 的高浓度盐。
（四）重悬菌体
用液体MS培养基将菌 体用移液枪吹打起来， 使菌体重新悬浮，其目 的是减少细菌培养基对 植物体的伤害。
（五）侵染转化
将预培养的红花子叶放入
菌液中浸染8-25min，在侵染过 程中轻轻摇晃，确保菌液充分进 入到红花子叶中。
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五、实验方法
（一）农杆菌菌液的制备
用牙签蘸取农杆菌，在 YEB培养基上划线，达到纯 化农杆菌的目的。
（二）制备工程菌（摇菌）
用牙签挑取划线得到的 单菌落，将其置于YEB液体 培养基中，进行液体振荡培 养，28℃,180rpm，制备用 于侵染转化的工程菌。
分子生物学操作技术之实验五
农杆菌介导的植物转基因技术
讲课人：杨晶
一、转基因植物概述
转基因玉米
转基因辣椒
转基因玫瑰
日闭幕的东京国际花卉博览会上，全球首批真正的蓝玫瑰首次在公众面前亮相。
二、实验目的
1、学习真核生物的转基因技术及农杆菌介导的转化原理； 2、掌握农杆菌介导转化植物的实验方法，了解转基因技术 的操作流程。
六、实验结果
农杆菌侵染时间
8min
10min 12min
15min
20min
25min
10
外植体数量
10
10
10
10
10
染菌情况
分化情况
转化率
七、注意事项
1、在操作过程中，一定要保证无菌，整个操作过程均需要再无菌 的条件下完成。
2、进入超净工作台前，要检查紫外灯是否关闭，避免对皮肤造成 损害。
3、进入超净工做台进行实验时，要进行表面消毒，用酒精喷洒并 擦净台面和双手。
八、思考题
1、农杆菌转化的基本步骤有哪些？ 2、农杆菌遗传转化的优缺点？ 3、哪些措施可以提高农杆菌介导的转化率？
三、实验原理
根癌农杆菌，属根瘤菌科，为革兰 氏阴性。根癌农杆菌感染双子叶植物时， 可在被感染的伤口形成冠瘿瘤,诱导有 关的质粒为Ti质粒 。Ti质粒上有一段TDNA区，人们将外源基因插入到TDNA区，借助农杆菌的感染使携带外 源基因的T-DNA区转入植物基因组中， 从而实现外源基因向植物细胞的转移和 整合。
（六）除菌
取出外植体，将其放在无菌
滤纸上，充分吸干菌液，避免菌 液残留在红花子叶上，使其在培 养过程中，菌液过量生长。
（七）侵染后的培养
首先将红花子叶置于共培养上，使其生长。培养一周后，将其转入 分化培养基上，进行培养，待其诱导分化出不定芽后，继续培养，不定 芽分化成苗后，将其移入生根培养基中，培养获得转基因植株。
农杆菌 感染柳树
产生 冠瘿瘤
四、实验仪器与试剂
1、仪器：超净工作台，离心机，恒温摇床，组织培养室；
2、试剂：农杆菌EHA105，YEB培养基，MS液体培养基，共培 养基（MS+6-BA+NAA），分化培养基（MS+6-BA） 生根培养基（MS+IBA+NAA）；
3、材料：红花无菌苗。
改造后的农杆菌的T-DNA区，含有目的地基因和Bar筛选基因