核酸凝胶电泳.终PPT课件
核酸凝胶电泳.终
二· 聚丙烯酰胺凝胶电泳（分辨范围为 1~1000kb）
三· 脉冲电场凝胶电泳（分离到高达107bp的 DNA大分子）
前言；核酸凝胶电泳是分子克隆技术之一，用于 分离· 鉴定和纯化DNA或 RNA片段。
核酸凝胶电泳的基本原理
凝胶电泳的原理比较简单。当一种带电分子放在电场 当中时，它们就会以一定的速度移向适当的电极。带点 分子在电场作用下的移动速度，称之为电泳迁移率，它 同电场的强度和电泳分子本身携带的静电荷数成正比。 也就是说，电场强度越大，电泳分子所携带的静电荷越 多，其移动速度也就越快，反之则慢。在哪电泳中，使 用无反应活性的琼脂糖与聚丙烯酰胺凝胶作支持介质， 从而将电泳分子的对流运动降低到极低，使电泳分子的 移动速度与其分子的摩擦系数成反比。已知摩擦系数是 分子大小、极性及介质黏度的函数，因此根据分子大小 的不同、构型或形状的差异，以及所带净电荷的多寡， 便可以通过电泳将核酸或蛋白质分子混合物中的各种成 分彼此分离开来。
2.限制酶消化
（1）25ul 10x反应缓冲液，30U 限制酶，加 双蒸馏水至250ul混匀。
（2）取一个凝胶块置其中，合适温度下过夜 后，用TE缓冲液洗涤并贮存。
3.应用PFGE对样品DNA进行分析
（1）用0.5xTBE缓冲液制备一个0.8%SeakemHGT琼脂 糖凝胶，胶的厚度尽量与样品凝胶块相符。若用 Wide Mini-Sub Cell进行电泳的话，50ml该溶液即 可。
2.非变性聚丙烯酰胺凝胶（native-PAGE）
非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native-PAGE)或称为 活性电泳是在不加入SDS 和疏基乙醇等变性剂的条件 下，对保持活性的蛋白质进行聚丙烯酰胺凝胶电泳， 常用于酶的鉴定、同工酶分析和提纯。使生物大分子 在电泳过程中保持其天然的形状和电荷，尤其是在电 泳分离后仍能保持蛋白质和酶等生物大分子的生物活 性，对于生物大分子的鉴定有重要意义，用于双链DNA 片段的分离于纯化。
(色谱分析)凝胶电泳
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凝胶干燥器
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凝胶成像系统
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SDS－PAGE测定蛋白质 相对分子质量
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实验过程
安装电泳槽
凝胶制备
电泳
样品处理与加样
剥胶与固定
染色与脱色
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实验过程流程图
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考马斯亮蓝染色法
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蛋白质组学和双向电泳技术
一、蛋白质组学产生背景 1. 20世纪中后期，生命科学研究进入了分子生物学时代。随 着人类基因组全序列测定，生命科学跨入了后基因组时代。 2. 因mRNA的表达情况不能直接反应蛋白质的表达水平。 3. 蛋白质有自身特有的活动规律，如动态修饰、加工、转运 定位、结构形成、代谢等，均无法从基因组水平上的研究获 知。蛋白质构象更难于只靠DNA序列来解释。 4. 蛋白质才能动态反映生物系统所处的状态。 20世纪90年代中期，国际上萌发了蛋白质组学。
稳定的线性pH梯度中电泳，结果导致每种 蛋白质分子迁移到等于其pI的pH处（此时蛋
白质分子的净电荷为零），最终聚集形成一 个很窄的蛋白区带
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+
pH 3
+
pH 3
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+
pH 3
+
pH 3
pH 7.5 pH 7.5 pH 7.5 pH 7.5
–
pH 10
–
pH 10
–
465nm
棕红色
在酸性酸条性溶件液下中，蛋白质与考 马斯亮兰R-250结合形成蓝 色复合物（595nm处最大吸 收与峰蛋）白质，疏蓝水色区结的合深浅与蛋白 质浓度成正比关系
核酸凝胶电泳
引言： 核酸是带均匀负电荷的生物大分子， 引言： 核酸是带均匀负电荷的生物大分子， 在电场中向正极移动， 在电场中向正极移动，不同大小和构象的核酸分 子的电荷密度大致相同，在自由泳动时， 子的电荷密度大致相同，在自由泳动时，各核酸 分子的迁移率区别很小，难以分开。 分子的迁移率区别很小，难以分开。以适当浓度 的凝胶介质作为电泳支持介质，具有分子筛效应， 的凝胶介质作为电泳支持介质，具有分子筛效应， 使得分子大小和构象不同的核酸分子泳动率出现 较大差异，达到分离的目的。此为分离、鉴定、 较大差异，达到分离的目的。此为分离、鉴定、 纯化核酸片段的标准方法。 纯化核酸片段的标准方法。用低浓度的荧光嵌入 染料溴化乙锭（EB）进行染色， 染料溴化乙锭（EB）进行染色，可直接在紫外灯 下确定DNA在凝胶中的位置。 DNA在凝胶中的位置 下确定DNA在凝胶中的位置。
影响核酸电泳的因素： 影响核酸电泳的因素：
• • • • 1．核酸的性质 2．凝胶孔径的大小 3．电场强度和电场方向 4．电泳环境 缓冲液的组成和离子强度 直接影响迁移率。 直接影响迁移率。
核酸电泳的指示剂 ：
• 核酸电泳常用的指示剂有两种： 核酸电泳常用的指示剂有两种： • ⑴溴酚蓝 • ⑵二甲苯青， 二甲苯青，
【实验材料】 实验材料】
• • • • 1．电泳仪。 电泳仪。 电泳槽。 2．电泳槽。 紫外透射仪。 3．紫外透射仪。• 1．琼脂糖凝胶板的制备 将1～2%琼脂糖凝胶加热溶化 2%琼脂糖凝胶加热溶化 均匀，冷却到60 70℃ EB至浓度 60～ 至浓度0.5 µg/ml， 均匀，冷却到60～70℃加EB至浓度0.5 µg/ml，倒入封 好的凝胶槽，厚度约3 mm，在距底板0.5 0.5～ mm的 好的凝胶槽，厚度约3～5 mm，在距底板0.5～1 mm的 位置放置样品梳，检查梳子齿间有无气泡， 位置放置样品梳，检查梳子齿间有无气泡，可用吸管小心 吸出气泡，待冷却成形后取出梳子及隔板， 吸出气泡，待冷却成形后取出梳子及隔板，放入水平电泳 槽中，缓冲液淹没过胶1 mm为止 为止。 槽中，缓冲液淹没过胶1～2 mm为止。 • 2．加样 样品中加1/5体积的上样缓冲液，混匀，取10～ 样品中加1/5体积的上样缓冲液，混匀， 10～ 1/5体积的上样缓冲液 µl加入凝胶点样孔中 同时要设立合适的DNA 加入凝胶点样孔中， DNA相对分 15 µl加入凝胶点样孔中，同时要设立合适的DNA相对分 子质量标准物。 子质量标准物。 • 3．电泳 电压＜10 V/cm，电泳至溴酚蓝移出样品槽到 电压＜ V/cm， 凝胶板的2/3距离时，关闭电源。 2/3距离时 凝胶板的2/3距离时，关闭电源。 • 4．取出凝胶块，置紫外透射反射分析仪上观察，即可见 取出凝胶块，置紫外透射反射分析仪上观察， 桔红色DNA区带。 桔红色
电泳技术(共21张PPT)
优点：分辨率高，区带清晰、窄，加样部位自由，重现性好，可测定P或多肽的等电点。
蛋白：溴酚兰、氨黑10B、偶氮胭脂红B 根据要分离物质的相对分子质量选择合适的单体浓度。
机械强度好，透明有弹性，稳定，无吸附作用和电渗作用，可制成不同孔径的凝胶。
第4页，共21页。
2 滤纸的选择与处理 层析用滤纸，纸宽2～3cm/样品组分，长短影响电场强度。
3 点样
分1 电离泳胶：：带小电孔粒径点子，在p圆H电8场.点中向（着与量其本少身电）荷相、反的点电极条移动状的过（程。一般），点中间（未知样品）、 点一边（已知样品） 点圆点（量少）、点条状（一般），点中间（未知样品）、点一边（已知样品）
凝胶（如聚丙烯酰胺凝胶） 4 操作要点
pH梯度支持介质的制备
聚焦电泳 检测 两性电解质载体的除去
第20页，共21页。
电泳技术思考题
1名词解释
电泳、电泳分离技术、泳动度、电渗、区带电泳、 相对迁移率、不连续凝胶电泳
2 影响泳动度的主要因素有哪些？
3 区带电泳的操作步骤一般有哪些？
4 如何制备聚丙烯酰胺凝胶？
CH2(NH2)COOH → (样品胶、浓缩胶pH6.7~6.8） →
CH2(NH2)COO－（0.1％～1.0％）泳动速度最慢（慢离子） 蛋白质（P）泳动速度介于快慢离子之间 电泳时， Cl －超过P走在最前面，其后形成一个离子浓度较
低的低电导区→较高电位梯度→P和慢离子加速移动→P 压缩成层
Aa：茚三酮、靛红
干法、湿法 分类：垂直管型盘状电泳、垂直板型电泳；
1 电泳：带电粒子在电场中向着与其本身电荷相反的电极移动的过程。
核酸检测技术ppt精选课件
Which are transgenic?
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多重PCR（multiplex PCR）
Nested Multiplex PCR
Primary Multiplex RT-PCR
1F 3F
4F
6F
2F 5F
1R 3R
4R
6R
2R 5R
2nd Stage PCR
Dilute 100 fold Between 1st & 2nd stage reactions
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1. PCR的基础
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Polymerase
PCR Chain
Reaction
The only enzyme used in this reaction is DNA polymerase.
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Polymerase
PCR Chain
Reaction
The products of the first reaction become substrates of the following one, and so on.
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机械 （匀浆、超声破、研磨等）
破碎细胞的方法
非机械（化学处理、生化法）
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6
沉淀是浓缩核酸最常用且高效的方法。
乙醇 异丙醇
优点
缺点
对盐类沉淀少， 需要量大，低温操 易挥发除去，不 作 影响后续实验
需体积小，速度 易使盐类、糖类与 快，一般不需低 DNA共沉淀；异丙 温长时间放置 醇难以挥发除去
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荧光定量PCR技术：
核酸质量检测——琼脂糖凝胶电泳
核酸质量检测——琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳是用琼脂糖作为介质的一种电泳方法，其兼具“分子筛”和“电泳的双重作用。
琼脂糖(Agarose)是一种线性多糖聚合物，是从红色海藻产物琼脂中提取而来的，当琼脂糖溶液加热到沸点后冷却凝固便会形成良好的电泳介质，其密度是由琼脂糖的浓度决定的。
经过化学修饰的低熔点的琼脂糖，在结构上比较脆弱，因此在较低的温度下便会熔化，可用于核酸片段的电泳检测。
琼脂糖凝胶电泳检测的主要是核酸的完整性和大小，只要核酸不是太小或者太大(超出电泳分离范围)，该方法的可信度非常高。
琼脂糖凝胶电泳的原理荧光染料检测核酸的存在观察琼脂凝胶中核酸的最简单方法是利用荧光染料溴化乙锭(EB) 进行染色，所用的荧光染料含有一个可以嵌入核酸的堆积碱基之间的荧光基团，当染料与核酸结合后呈现荧光。
核酸吸收254nm处的紫外辐射并传递给染料，被结合的染料本身在302nm和366nm有光吸收，这两种情况下，被吸收的能量可在可见光谱红橙区的590nm处重新发射出来，因此，当凝胶中含有游离的EB时即可以检测到DNA和RNA的存在。
注1：由于EB具有很强的毒性，因此在操作时一定要戴手套，并且最好有专门的区域进行电泳检测实验。
注2：可以使用GoldView染料代替EB，其具有相同的检测效果，同时毒性要低很多。
电泳区分核酸大小核酸会根据pH不同带有不同电荷，在电场中受力大小不同，因此跑的速度不同，琼脂糖凝胶电泳即根据这个原理对核酸进行区分。
核酸分子在pH高于其等电点的溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。
由于核酸的戊糖-磷酸骨架在结构上具有重复性，长度相同的核酸链几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速率向正极方向移动。
此外，含有琼脂糖的凝胶具有网状结构，物质分子通过时会受到阻力，大分子物质在涌动时受到的阻力大，因此在琼脂糖凝胶电泳中，带电颗粒的分离不仅取决于净电荷的性质和数量，而且还取决于分子大小，这就大大提高了分辨能力。
核酸凝胶电泳的技术
Made by lionchp
一 原理 • 电荷效应：Q↑→V↑（可忽略） • 分子筛效应：M↑→V↓（主要） • 电ห้องสมุดไป่ตู้：不计 →M↑ V↓ ※核酸显酸性，在缓冲液中带负电：向正极 电泳
• 电泳速率影响因素：DNA大小、形状、带电 量 ※三种质粒电泳速率
二 三种凝胶电泳 • 琼脂糖凝胶电泳： 特点：平躺式、 影响因素 DNA构象： 镶入染料：
四 电泳缓冲液要求 • 有缓冲液，DNA才电离：带负电，向正极移 动
• 三种常用缓冲液： TAE：Tris-乙酸+EDTA TBE：Tris-硼酸+EDTA TPE：Tris-磷酸+EDTA
五 对照物-Marker
※本章总结
• SDS-PAGE： 特点：竖式电泳，精确 SDS的作用：
• 脉冲场电泳： 优点：分离能力更强 原理：
三 电泳后的观察-EB染色 • EB：溴乙锭，可镶嵌入，核酸的碱基对平 面间对DNA染色，300nm紫外灯下发出橘黄 色荧光 ※EB嵌入碱基对间，可引起DNA框移：有毒， 可破坏DNA
• 观察方法：电泳后，300nm紫外线照射，发 荧光处为DNA ※DNA量越大，荧光越强
最新细胞凋亡的DNA琼脂糖凝胶电泳_图文ppt课件
EDTA（乙二胺四乙酸二钠）：抑制DNA酶活性，确保目的DNA 不再降解
Proteinase K：使染色质上蛋白质与DNA分离，并进一步降解为小 肽/氨基酸
酚、氯仿：抽提除去蛋白质 异丙醇：沉淀DNA Goldview：DNA萤光染料，与DNA结合形成一种光络合物，在紫
方法
一、胸腺细胞的制备： 小鼠摘眼球并断椎处死，取胸腺，浸入含5－
10%小牛血清的1640培养液中，置铜网上研磨， 将研磨好的细胞悬液用尼龙网过滤。2000rpm， 离心5min，制成1×107细胞悬液备用。
二、提取胸腺细胞DNA：
⑴裂解细胞阶段（使用到的试剂：裂解液=L液、 RNaseA/蛋白酶K液=A液）
线粒体的改变
• 线粒体检测： 激光扫描共聚焦显微镜检测1）线粒体通透性转
换（MPT），2）线粒体内膜去极化， 3）钙离子 流改变，4）线粒体氧化还原状态等。 缺陷：不能区分凋亡和坏死
• 细胞色素C释放： 荧光显微镜/电镜观测
缺陷：细胞色素C释放到胞浆后不稳定。
• 发育
凋亡的生理学意义
凋亡的生理学意义
• 将细胞离心后小心倒出液体，离心管中加入 100μlL液和20μlA液，充分混匀，置于55℃温浴 20分钟，其间来回颠倒离心管3-5次。
(2) 结合DNA阶段(使用到的试剂: 结合缓冲液=B液、 3MNaAC, pH4.8)
• 加入10μl 3MNaAC，随后加入1250μl B液，充分 振荡混合均匀（重要！），12000rpm离心3min。 将上清分2次加入到离心吸附管。静置1分钟， 12000rpm离心30s，倒掉收集管中废液。第二次 同上，静置1分钟，离心30s。
核酸凝胶电泳技术
核酸凝胶电泳技术哎呀，核酸凝胶电泳技术，这玩意儿听起来挺高大上的，其实呢，就是把DNA或者RNA这些小分子给分开的小技巧。
你可能会想，这跟我有啥关系？别急，听我慢慢道来。
我还记得第一次做这个实验的时候，那叫一个手忙脚乱。
实验室里，那些试管、烧杯、各种颜色的液体，还有那个看起来像是外星人科技的电泳仪，都让我有点头晕。
不过，我得说，这玩意儿真的挺神奇的。
首先，你得准备你的样本，也就是那些DNA或者RNA。
我那时候用的是一种叫做琼脂糖的凝胶，它看起来就像是果冻，但是比果冻硬多了。
你把样本和一些染料混合在一起，然后小心翼翼地滴到凝胶上。
这时候，你可得小心，别手抖，不然你的样本就可能跑偏了。
接下来，就是把凝胶放到电泳仪里。
这个电泳仪，说白了，就是个通电的大盒子。
你一通电，那些DNA或者RNA就会因为带电而开始移动。
它们就像是在跑步比赛，但是速度不一样，因为分子大小不同。
小的分子跑得快，大的分子跑得慢。
我记得我那时候，眼睛都贴在那个显示器上了，就等着看那些DNA条带慢慢出现。
你别说，看到那些条带一点点清晰起来，心里那个激动啊，就像是在看一场精彩的比赛。
最搞笑的是，有一次，我不小心把染料弄多了，结果整个凝胶都变成了紫色，看起来就像是外星人的血液。
我导师看了，差点没笑翻过去。
不过，那次实验结果倒是出奇的好，条带清晰得不得了。
说到这儿，你可能会觉得，这玩意儿离我们的生活挺远的。
但其实不是。
比如说，医生用这个技术来检测遗传病，或者研究人员用它来研究病毒。
这就像是给了我们一把钥匙，去打开生命奥秘的大门。
所以，核酸凝胶电泳技术，虽然听起来有点枯燥，但它其实就像是生活中的小插曲，有时候还能带来意想不到的乐趣。
就像那次紫色凝胶的意外，虽然看起来有点滑稽，但它让我对实验充满了好奇和热情。
总之，核酸凝胶电泳技术，就是那种看似普通，实则充满魔力的小技术。
它让我们能够更细致地观察生命的微观世界，也让我们的实验生活多了几分色彩。
下次你再听到这个词，不妨想想我今天给你讲的这个故事，说不定你会对它有新的认识呢。
PCR扩增和电泳检测(共28张PPT)
（ Polymerase Chain Reaction,聚合酶链反应） 是指在体外，通过特异DNA引物扩增核酸分子中 某个特定区域的技术。
PCR的反应体系
DNA模板 原料： dNTP(dATP、dGTP、dCTP、TTP) ；
酶： Taq聚合酶（嗜热细菌中分离得到） 引物：（单链DNA片段） Mg2+（维持酶活性所必需） PCR缓冲液：维持pH，保护Taq酶
混样
2μL载样缓冲液、 2μL 核酸荧 光染料，10μLPCR产物混匀。
点样
将上步混好的样10 μL加到凝胶 孔中。
电泳 90V电压下电泳10~20min。
制胶
将琼脂糖加入电泳缓冲液, 在微波炉中加热溶解至透明。
将凝胶倒入制胶器的槽中
（60oC）
将梳子从制胶槽中拔出
取出凝胶板放入电泳槽中
向电泳槽中加入电泳缓冲液至没过凝胶
PCR技术原理
变性 退火 延伸
PCR三步曲
预变性
变性 90~95℃
退火 40~60℃Fra bibliotek延伸 70~75℃
保温
PCR仪
用于PCR的预混液（ 500L 体系）：
ddH2O
10×butter
MgCl2 dNTP混合液
引物1 引物2
模板DNA Taq DNA聚合酶
310 L
50 L 40 L 20L
25L 25L
循环次数 35
琼脂糖凝胶电泳
1、基本概念 以琼脂糖凝胶作为介质,DNA在外加电场的 作用下泳动的技术。
2、实验原理 琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以 形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决 定于琼脂糖的浓度。
琼脂糖凝胶电泳基本原理
核酸凝胶电泳的原理
核酸凝胶电泳的原理
核酸凝胶电泳是一种常用的分子生物学技术，用于分离和检测核酸分子，如DNA 和RNA。
其原理如下：
1. 凝胶制备：通常使用琼脂糖或者聚丙烯酰胺作为凝胶基质。
将这些基质溶解在缓冲液中并聚合形成固体凝胶，在凝胶中形成一系列微小孔隙。
2. 样品加载：将待测样品中的核酸分子混合物经过处理后，加入到凝胶的孔隙中。
3. 电泳：在凝胶两端连接正负电极，通以电流。
由于DNA和RNA带有负电荷，它们会随电场的作用从负极向正极移动。
4. 分离：由于不同的核酸分子在凝胶中的孔隙中移动的速度不同，较小的分子移动速度较快,在一段时间内就可以移动到凝胶中较远的位置，而较大的分子则移动速度较慢,停留在较接近起点位置。
5. 可视化：在核酸凝胶电泳结束后，可以使用DNA染料或核酸探针等方法对凝胶进行染色，从而可视化核酸分子位置。
常用的染色剂包括乙溴化乙锭（EtBr）、SYBR Green等。
通过比较待测核酸与已知大小的分子量标准的迁移距离，可以确定待测核酸的大
小。
核酸凝胶电泳在DNA测序、基因突变分析、DNA指纹图谱等领域都有广泛的应用。
核酸凝胶电泳的原理
核酸凝胶电泳的原理核酸凝胶电泳（agarose gel electrophoresis）是一种常用的分离和分析核酸分子的技术方法。
其原理基于核酸分子在电场中的运动速度与其分子大小和电荷量之间的关系。
本文将详细介绍核酸凝胶电泳的原理、步骤和应用。
核酸凝胶电泳的原理：核酸凝胶电泳是基于核酸分子的带电性质和凝胶的分子筛效应来实现分离的。
核酸分子在电泳的过程中，根据它们的分子大小和电荷量的不同，在电场中具有不同的迁移速度。
核酸分子带负电：DNA和RNA分子都是由带负电的核苷酸通过磷酸二酯键所连接而成的。
由于核酸分子的磷酸基团带负电，核酸分子在电场中迁移的方向是由负极向正极。
凝胶的分子筛效应：核酸凝胶电泳使用的凝胶通常是琼脂糖（agarose gel），其由高分子链状结构组成。
琼脂糖分子链间存在微小的孔隙，可以形成分子筛效应。
较小的核酸分子可以更容易地穿过凝胶的孔隙，迁移速度较快；而较大的核酸分子则受到凝胶孔隙的阻碍，迁移速度较慢。
核酸凝胶电泳步骤：1. 准备凝胶：将琼脂糖加入缓冲液中，加热溶解并冷却，形成一层凝胶。
2. 加载样本：将待分析的核酸样本加入样品槽中。
3. 施加电场：将电泳槽连接至电源，打开电源，施加电场。
通常，电场的方向是由负极向正极，使核酸分子向阳极迁移。
4. 分离与可视化：在经过一段时间的电泳后，核酸分子会分离成不同的带状。
使用染料如乙溴乙酸（ethidium bromide）染色或荧光标记的核酸进行可视化。
核酸凝胶电泳应用：1. 分离和鉴定核酸：核酸凝胶电泳可用于分离DNA和RNA，用于鉴定某个样品是否含有特定的核酸序列。
2. 估算核酸大小：通过核酸凝胶电泳可以估算核酸的大小，通过与已知大小的DNA分子进行比较。
3. 检测突变和多态性：核酸凝胶电泳可以用于检测基因突变和多态性的存在与否，例如用于遗传病的检测和基因型分析。
4. DNA指纹图谱：核酸凝胶电泳可用于建立DNA指纹图谱，用于个体识别、亲子鉴定和犯罪现场的分析。
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常见的电泳仪
水平电泳仪
垂直电泳仪
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脉冲电泳
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电 泳 的 梳 子
电泳槽
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电泳仪
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一·琼脂糖凝胶电泳
琼脂糖凝胶电泳是用琼脂或琼脂糖作支持介质的一种 电泳方法。对于分子量较大的样品，如大分子核酸、病毒 等，一般可采用孔径较大的琼脂糖凝胶进行电泳分离。琼 脂糖凝胶具有网络结构，物质分子通过时会受到阻力，大 分子物质在涌动时受到的阻力大，因此在凝胶电泳中，带 电颗粒的分离不仅取决于净电荷的性质和数量，而且还取 决于分子大小，这就大大提高了分辨能力。 凝胶的分辨 能力 同凝胶的类型和浓度有关。分辨DNA片段范围 0.2~50kb；而要分辨较小分子质量的DNA片段，则要用 聚丙烯酰胺凝胶，其分辨范围为1~1000bp。凝胶浓度的 高低影响凝胶介质孔隙的大小，浓度越高，孔隙越小，其 分辨能力也就越强；反之，浓度越低，孔隙就增大，其分 辨能力也就越弱。
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4、电泳
点完样后连接电源，设置好电源的参数，开始 电泳。当溴酚蓝的带（蓝色）的移动至一定长 度即可停止电泳。 电压要求：≤20V/CM胶，在样品出孔用低压 （3V/CM，15min）,然后调回标准电压，跑出 的条带较好。
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成像拍照
20胶图分析21源自意事项22一、配胶
1.电子称的使用，要时刻注意保持电子称的精确性， 保持清洁，根据不同的浓度的胶称取琼脂糖。 2.加TAE的量要适当，以避免配出来的胶太薄导致胶 孔太浅或浓度太低。 3.倒胶前胶托一定要洗干净，并檫干。倒胶时要待 胶冷到一定温度摇匀尽量不要产生气泡。若胶液的 温度太高胶托容易变形。
二·聚丙烯酰胺凝胶电泳（分辨范围为 1~1000kb）
三·脉冲电场凝胶电泳（分离到高达107bp的 DNA大分子）
前言；核酸凝胶电泳是分子克隆技术之一，用于 分离·鉴定和纯化DNA或 RNA片段。
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核酸凝胶电泳的基本原理
凝胶电泳的原理比较简单。当一种带电分子放在电场 当中时，它们就会以一定的速度移向适当的电极。带点 分子在电场作用下的移动速度，称之为电泳迁移率，它 同电场的强度和电泳分子本身携带的静电荷数成正比。 也就是说，电场强度越大，电泳分子所携带的静电荷越 多，其移动速度也就越快，反之则慢。在哪电泳中，使 用无反应活性的琼脂糖与聚丙烯酰胺凝胶作支持介质， 从而将电泳分子的对流运动降低到极低，使电泳分子的 移动速度与其分子的摩擦系数成反比。已知摩擦系数是 分子大小、极性及介质黏度的函数，因此根据分子大小 的不同、构型或形状的差异，以及所带净电荷的多寡， 便可以通过电泳将核酸或蛋白质分子混合物中的各种成 分彼此分离开来。
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二、EB染色
1.碰到EB的手套要及时丢弃。 2.加量要适当，加EB至终浓度 0.5μ g/ml 3抹布要严格区分，不可交叉使用。
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三、点样电泳
1.加样时，枪头要上紧，吸样均一准确，排液 时吸头不要有残留。 2.点完样后及时盖上胶垫，注意不要盖反。 3.点电泳前最好检查待用胶是否合格，点电泳 时要对准胶孔，尽量点完所有的样。 4.点完样勿忘marker,并摆正胶位，电泳仪正 负极不要插反，电泳槽的盖子要盖紧。
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在生理条件下，核酸分子的糖-磷酸骨架中的磷酸 基团，是呈离子状态的。从这种意义上讲，DNA和RNA 的多核苷酸链可称为多聚阴离子。因此，当核酸分子 被放置在电场当中时，它们就会向正极的方向迁移。 由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相当数量的 双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样 的速度向正极方向迁移。在一定的电场强度，DNA分 子的这种迁移速度，亦即电泳迁移率，取决于核算分 子本身的大小和 结构。分子质量较小的DNA分子比分 子质量较大的DNA分子，具有较紧密的构型，所以其 电泳迁移率也就比同等分子质量的的松散型的开环 DNA分子或线性分子要快些。这就是应用凝胶电泳技 术分离DNA片段的基本原理。
核酸凝胶电泳
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什么是电泳？
带点颗粒在电场作用下，向着与 其电性相反的电极移动，称为电泳。 生物大分子如蛋白质，核酸，多糖 等大多都有阳离子和阴离子基团， 称为两性离子在电场中，带电颗粒 向正极或负极迁移，迁移的方向取 决于它们带点的符号。
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凝胶电泳有几类？
一·琼脂凝胶电泳（分辨DNA范围为 0.2~50kb)
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DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛 效应。DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷， 在电场中向正极移动。由于糖-磷酸骨架在结构上的 重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电 荷，因此它们能以同样的速率向正极方向移动。
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琼脂糖凝胶电泳的操作
操作步骤：
配胶
EB染色
点样
胶图分析
成像拍照
电泳
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1、配胶
按所要分离的DNA分子的大小，称取适量 的琼脂糖粉末，放入锥形瓶，加适量1×TAE 电泳缓冲液；
然后置微波炉内加热摇匀至完全溶化成 透明状，适当冷却后倒入胶托；胶完全冷凝 后放入电泳槽，电泳槽里的缓冲液必须没过 胶面。
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铺胶
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凝胶凝固后取出梳子
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加缓冲液
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二·聚丙烯酰胺凝胶电泳
聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺(简称Acr)和交联剂N，N’一亚甲 基双丙烯酰胺(简称Bis)在催化剂过硫酸铵(AP)，N，N，N’，N’ 四甲基乙二胺(TEMED)作用下，聚合交联向成的具有网状立体结 构的凝胶，并以此为支持物进行电泳。
聚丙烯酰胺凝胶电泳可根据不同分子所带电荷的差异及分子 大小的不同所产生的不同迁移率将DNA或蛋白质分离成若干条区 带，如果分离纯化的样品中只含有同一种DNA蛋白质，样品电泳 后，就应只分离出一条区带。SDS是一种阴离子表面活性剂能打 断蛋白质的氢键和疏水键，并按一定的比例和蛋白质分子结合成 复合物，使蛋白质带负电荷的量远远超过其本身原有的电荷，掩 盖了各种蛋白分子间天然的电荷差异。因此，各种蛋白质 SDS 复合物在电泳时的迁移率，不再受原有电荷和分子形状的影响， 只是棒长的函数。这种电泳方法称为SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 (简称SDS—PAGE)。
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2、EB染色
溴化乙锭是一种扁平分子，可以嵌入核 酸双链的配对碱基之间。在在紫外照射 EB-DNA复合物时，出现不同的效应。 注意：严格区分污染区和非污染区，不 把污染区的物品拿到非污染区碰过EB的 手套要及时丢弃！
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3、点样
根据样品不同可分两种点样体系： A、样品+6Xloading buffer B、样品可以直接点样