海洋活性胶原肽的抗氧化性及对酪氨酸酶的抑制作用与初步分离研究_宋永相

（1）
A 对 照 -A 空 白
式中，A 样品、A 空白、A 对照分别为样品、空白和对
照的吸光值。
-
1.3.2.2 超氧阴离子自由基（O2·）清除率的测定
采用邻苯三酚自氧化法[13-15]。 邻苯三酚在碱性条件
下自氧化生成有色中间产物和超氧阴离子自由基
-
（O2·）， 超氧阴离子自由基对自氧化有催化作用。
由于胶原富含甘氨酸、脯氨酸、羟脯氨酸、赖 氨酸、羟赖氨等亲水性氨基酸，所以其多肽表现出 优良的亲水性，不仅可用于保健食品，还可作为天
收稿日期： 2008-10-28 项目基金： 国家十一五 863 计划项目资助（2007AA09Z441） 作者简介： 宋永相，男，1980 年出生，硕士生 通讯作者： 孙谧
以上、4 000～10 000、1 000～4 000 和 1 000 以 下 的
成分分别测定其羟自由基清除率、 超氧阴离子清
除率和酪氨酸酶抑制率，计算各组分的比活。
1.3.4.2 柱层析分离 对活性分布集中的截留组
分 进 行 葡 聚 糖 凝 胶 DEAE-A25 阴 离 子 交 换 柱 层
析，分离，测定洗脱峰活性，判断分离效果。
值。
1.3.3 酪氨酸酶抑制率的测定 [6，16] 酪氨酸酶抑
制率的测定方法见表 1。
表 1 酪氨酸酶抑制性测定法
Table 1 Method for the inhibition determination of tyrosinase
试剂
组 成 （mL）
A1
A2
A3
A4
磷酸缓冲液（0.05 mol/L，pH6.8）
在超氧阴离子清除率为 50％两侧， 与测定羟 自由基清除活性相同，取不同浓度的抗氧化剂，测 定超氧阴离子清除率。 其浓度关系与自由基的清 除活性变化比较如图 2 所示。 比较 3 种抗氧化剂 与 MACP 对超氧阴离子的清除活性， 结果发现，
-
MACP 比 TBHQ 清除 O2·的活性略高，二者的 IC50 值分别为 14.40 mg/mL 和 17.52 mg/mL。 随着浓度 的增加，二者对超氧阴离子的清除活性接近。 但茶 多 酚 对 超 氧 阴 离 子 的 清 除 活 性 比 MACP 高 ，IC50 值达 4.05 mg/mL，且随着茶多酚浓度的增加，其对
-
O2·清除活性迅速增高，其中异常的超过 100%。其
-
原因在于茶多酚自身所带颜色与 O2·清除试验所 产生的物质颜色相似。 随着茶多酚浓度的升高，茶
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中国食品学报
2009 年第 5 期
多酚自身的颜色会对试验本身产生干扰效应，使 所测结果比实际效果值偏大。 因此在低浓度下测 定，对照参考扣除背景误差，其影响可以忽略；在 高浓度下测定， 背景误差过大而掩盖活性测定所 产生的颜色，比色测定结果偏离实际值。 图 2 中，
2009 年第 5 期
1 材料与方法
1.1 试验材料 MACP，自 制 ；番 红 花 红 O，进 口 分 装 ；VC，东
北 制 药 总 厂 ；GSH， 北 京 索 莱 宝 科 技 有 限 公 司 ；TBHQ，河南金成；茶多酚，歙 县 茶 叶 生 物 碱 厂 ；临 苯 三酚，遵义佳宏化工；酪氨酸酶，Sigma 公司；酪氨 酸，上海康达；熊果苷，百灵威公司；曲酸，百灵威 公 司 ；氢 醌 ，天 津 广 成 ；葡 聚 糖 凝 胶 DEAE-A25， 安 玛 西 亚 （Amersham）； 双 氧 水 、 硫 酸 亚 铁 、Tris、 氢 氧化钠、醋酸、盐酸、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠等均 为分析纯试剂。 1.2 试验仪器
第9卷 第5期 2 0 0 9 年 10 月
中国食品学报
Journal of Chinese Institute of Food Science and Technology
Vol． 9 No． 5 Oct． 2 0 0 9
海洋活性胶原肽的抗氧化性及对酪氨酸酶的抑制作用与 初步分离研究
宋永相 1，2 孙 谧 1 王跃军 1 王海英 1 郑鸿飞 1，3 李 伟 2 （1 中国水产科学研究院黄海水产研究所 山东青岛 266071
然的吸水保水成分[5]，是化妆品的优良原料。 皮肤 内胶原中的酪氨酸被酪氨酸酶作用后形成黑色 素，是皮肤变黑、色斑产生的主要原因[6]。 王奕、王 静凤等[7]研究了相关水产胶原对 B16 黑素瘤 细 胞 黑素合成的影响， 为深入研究活性胶原肽的美白 作用打下一定基础。
近年来具有抗氧化、降血压、抗肿瘤、修复组 织等生理功能的活性胶 原 肽[8]及 胶 原 在 功 能 性 食 品 中 的 应 用 特 性 被 不 断 发 现 [9]， 使 得 胶 原 的 需 求 量 不断增加。 然而疯牛病、禽流感的流行，使得陆生 胶原的来源受阻。 海洋胶原因其特殊的生长、进化 环境，具有更多的陆生胶原没有的生物活性，对其 进行研究并产业化生产有着诱人的前景[10-11]。
茶多酚两条曲线靠得很近，且活性高，其 IC50 值分 别 为 0.375 mg/mL 和 0.382 mg/mL；GSH 和 VC 的 活 性 低 ，GSH 的 IC50 值 为 8.92 mg/mL；VC 的 羟 自 由基清除率随浓度的增加而呈峰状分布， 当 VC 质量浓度增加到 8 mg/mL 时， 自由基清除率达到 最大值。 此后 VC 浓度增加，清除率呈下降趋势， 并逐渐平缓。 其原因有人认为[17]，当 Fe2+、Cu2+、Co2+ 等 过 渡 金 属 离 子 存 在 时 ，VC 具 有 氧 化 增 强 剂 作 用，但若是如此，其对自由基清除活性应该一直下 降，而非呈上升趋势，具体原因待查明。 2.2 MACP 超氧阴离子自 由 基 的 清 除 率 与 常 用 抗氧化剂的比较
2 大连水产学院食品工程系 辽宁大连 116023 3 上海海洋大学食品学院 上海 200090）
-
摘要 以羟自由基（OH·）、超氧阴离子自由基（O2·）的 清 除 率 和 酪 氨 酸 酶 抑 制 率 为 研 究 对 象 ，研 究 从 富 含 胶 原 的 海 产 品 下 脚 料 中 提 取 的 海 洋 活 性 胶 原 肽 （Marine active collagen peptides/MACP）的 体 外 活 性 ，并 进 行 初 步 分 离 。 结 果 表 明 ：MACP 的 OH·清 除 率 （IC501.42 mg/mL） 高 于 谷 胱 甘 肽 （IC50 8.92 mg/mL） 和 VC， 低 于 抗 氧 化 剂
关键词 海洋活性胶原肽； 自由基； 酪氨酸酶； 功能食品； 化妆品 文章编号 1009-7848（2009）05-0007-07
胶原肽是近年来在保健、 美容领域引入的一 个新型活性成分， 由-（Gly-Pro-Y）n-基本结构构 成的 18 种氨基酸组成， 其中 X 为脯氨酸，Y 为羟 脯氨酸、羟赖氨酸及其它氨基酸[1]。 由于胶原肽来 源于生物组织蛋白， 是构建生物机体结构性成分 之一，具有无免疫原性和亲和性，所以被人们视为 安全可靠的生物原料[2-3]。 人体骨骼的老化，皮肤皱 纹的形成等都与其所含胶原因物理或生理原因而 得不到及时修复有很大关系。 如果人体胶原能够 及时得到补充，就可使其 重 新 恢 复 青 春 活 力[4]，消 除皮肤皱纹或延缓皱纹的生成， 使皮肤充满光泽 而富有弹性，人也变得年轻了。
2.0
2.5
1.5
2.0
胶原肽
0
0
0.5
0.5
L-酪氨酸溶液（0.61 μmol/mL）
0.5
0
0.5
0
L-酪氨酸酶溶液（100 U/mL）
0.5
0.5
0.5
0.5
合 计 体 积 （mL）
3.0
3.0
3.0
3.0
注：将前两种体系摇匀，于 30℃水浴中恒温 10min，加入酪氨酸酶溶液，摇匀反应 10min 后立即在 475nm 处测定吸光度值。
mmol/L EDTA-Fe（Ⅱ）1mL（新鲜配制），混匀后 37
℃水 浴 中 反 应 30 min， 在 520 nm 处 测 定 其 吸 光
值。 空白组以 0.5 mL 蒸馏水代替供试样品，对照
组以 1.5 mL 蒸馏水代替 EDTA-Fe（Ⅱ）和供试 样
品。 计算清除率。
清除率（η）= A样品-A空白 ×100%
-
TBHQ（IC50 0.375 mg/mL）和 茶 多 酚 （IC50 0.382 mg/mL）；MACP 的 O2·清 除 活 性 （IC50 14.40 mg/mL）低 于 茶 多 酚 （IC50 4.05 mg/mL）和谷胱甘肽（IC50 0.49 mg/mL），却高于 TBHQ（IC50 17.52 mg/mL）。 MACP 抑制酪氨酸酶的 IC50 为 17.06 mg/mL，为常用美白剂— ——熊果苷的 1/70。酶解液经截流相对分子质量分别为 10 000、4 000、1 000 的超 滤膜分离，其活性随相对分子质量的减小而增大，且清除自由基和抑制酪氨酸酶的最大活性相对分子质量都集 中在 1 000 以下。 对相对分子质量小于 1 000 的 MACP 成分进行葡聚糖凝胶 DEAE-A25 阴离子交换分离，得到 2 个洗脱峰，且活性成分主要集中在第 1 个峰上。 将 MACP 应用于功能食品或美白化妆品中开发前景良好。
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海洋活性胶原肽的抗氧化性及对酪氨酸酶的抑制作用与初步分离研究
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酪氨酸酸抑制率（η）= A3 -A4 ×100%
（3）
A1 -A2
1.3.4 活性成分的分离
1.3.4.1 超滤分离 将酶解液脱色后， 分别用相
对分子质量截留量为 10 000、4 000、1 000 的超滤
膜进行超滤。 对来自原液， 相对分子质量 10 000
本文以富含胶原的海产品下脚料为原料，提 取海洋活性胶原肽，研究其羟自 由 基 （OH·）和 超