包涵体蛋白体外复性的研究进展
包涵体的纯化和复性总结--最全的前人经验
包涵体旳纯化和复性总结ﻫ二、包涵体旳洗涤ﻫ1、包涵体旳洗涤问题ﻫ一般旳洗涤措施一般是洗不干净旳,我此前是这样做旳，先把包涵体用6M盐酸胍溶解充足,过滤除去未溶解旳物质，注意留样跑电泳，然后用水稀释到4M,离心把沉淀和上清分别跑电泳,如此类推可以始终稀释到合适旳浓度，你可以找到一种合适清除杂质旳措施，其实这就是梯度沉淀旳措施，我觉得比一般旳直接洗脱效果好。
ﻫﻫ包涵体一般难溶解,因此你要注意未溶解旳部分,你可以跑电泳对比，由于有时候难溶解旳就是你旳目旳蛋白，因此每次解决都要把上清和沉淀跑电泳对比,免得把目旳蛋白弄丢了。
ﻫ此外刚解决完旳包涵体好溶解。
冷冻后难溶解,溶解也需要长点时间,也需要大量旳溶剂。
如果说是不少不溶解旳不是你要旳，那就不用管了。
２、如何得到比较纯旳包涵体对于包涵体旳纯化,包涵体旳前解决是很重要旳。
ﻫ包涵体中重要具有重组蛋白,但也具有某些细菌成分,如某些外膜蛋白、质粒ＤＮA和其他杂质。
洗涤常用1%如下旳中性去垢剂，如Ｔwｅen、Trｉton、Ｌuｂｅｌ和ＮP40等加ＥDＴA和还原剂２-巯基苏糖醇（DTT）、β-巯基乙醇等反复多次进行,因去垢剂洗涤能力随溶液离子强度升高而加强，在洗涤包涵体时可加5０ mM ＮaCL。
这样提取旳包涵体纯度至少可达50％以上，并且可保持元构造。
也可用低浓度旳盐酸胍或尿素/中性去垢剂/ＥDTＡ/还原剂等洗去包涵体表面吸附旳大部分不溶性杂蛋白。
洗涤液ｐH以与工程菌生理条件相近为宜，使用旳还原剂为0.1-5ｍM。
EDTA为0.1-0.3 mＭ。
去垢剂如Tｒiton X-1０0、脱氧胆酸盐和低浓度旳变性剂如尿素充足洗涤清除杂质，这一步很重要,由于大肠杆菌外膜蛋白Oｍp T(37 KDa)在4-8mｏｌ/L尿素中具有蛋白水解酶活性,在包涵体旳溶解和复性过程中可导致重组蛋白质旳降解。
对于尿素和盐酸胍旳选择:尿素和盐酸胍属中强度变性剂，易经透析和超滤除去。
它们对包涵体氢键有较强旳可逆性变性作用,所需浓度尿素8－10Ｍ，盐酸胍6-8M。
包涵体蛋白的复性研究进展
Ａｂ ｔ ａ ｔ Ｔｈ ｓ ｉ ，ｄ ｎ ｔ ｒｔｏ ｎ ｅ ａｕ ａｉｎ ｍｅｈ ｄ ｆｉｃｕｓｏ ｄ ｒ ｎｒ ｄ ｃ ｄ．Ｃｈ ｏ ｔ ｇａ ｈ ｅ ａｕ ａｉｎ ｍｅｈ ｄ ｏ ｓｒ ｃ ｅ ｗａ ｈｎｇ ｅ ａｕ ａｉｎ ａ ｄ ｒｎ ｔｒ ｔｏ ｔ ｏ ｓ ｏ ｎ ｌ ｉｎ ｂｏ ｙ ｗｅｅ ｉ ｔｏ ｕ ｅ ｒ ｍａｏ ｐ ｙ ｒ ｎ ｔｒ ｔ ｔ ｏ ｆ ｒ ｏ
级键 等原 因形 成 的。 ２ 包涵 体 的前 处 理
由于包 涵体 无 生物学 活 性 ， 因此需 要进 行 复性 。 复性 主 要 是通 过缓 慢 去除变 性剂 使 目标 蛋 白从 变性 的完 全伸 展状 态 恢 复 到 正常 的折 叠 结构 ， 同时 去 除还 原 剂 使 二硫 键 正 常 形成。 还原 剂一 般 和变性 剂 的去 除一 起慢 慢 地氧 化 去除 ， 使 二 硫键慢 慢 形 成 。 常用 的氧 化方 法有 空 气氧 化法 、 谷胱 甘 肽 氧 化法 和混合 二 硫化 物氧 化法 。
为 ５ ～０ ０ １ ０ｍｍ １ － ０／ ２ ＢＭＥ或 Ｄ Ｔｏ Ｌ Ｔ ３ 包涵体 的 复性
供了可能 ， 大肠杆菌因其易于操作 、 遗传背景清楚 、 发酵成 本低和白表达水平高等优点 ， 成为生产重组蛋 白的首选 表达系统。 外源基因在大肠杆 菌中的高表达常常导致包涵
体 的形 成 ， 包涵 体易 于分 离纯 化 ， 能避 免 蛋 白酶对 外源 蛋 并
白的降解 ， 但包涵体不溶且无 生物学活性 。 因此 ， 如何高效 地复性包涵体蛋白是基 因工程技术面临的一个难题。 笔者
对包 涵体 蛋 白的复 性研 究 进展 作 一 综 述 ， 旨在 为 促进 基 因 工 程技 术 的发展 提供 理论 依据 。 １ 包 涵体简 介 包涵 体是 指 细菌 表达 的蛋 白在 细胞 内凝 集 形成 的无 活 性 固体颗 粒 。 一般 含 有 ５ ％以上 的重组 蛋 白， ０ 其余 为核糖 体 元件 、 Ｎ Ｒ Ａ聚合 酶 、 内毒 素 、 膜蛋 白、 外 质粒 Ｄ Ａ以及脂 体 、 Ｎ 脂 多糖 等 ， 般 直径 大 小 为 ０ ～ ． Ｌ 呈 非水 溶 性 。 涵 一 ． １ ｍ， ５ ０Ｌ 包 体 主要 是 因 为重 组蛋 白 的表 达量 过 高 ， 达过 程 中缺乏 某 表 些 蛋 白质 折叠 的辅 助 因子或 环 境 不 适 ， 法 形 成 正确 的次 无
包涵体蛋白复性的方法简介与操作
活性蛋白整体方案包涵体蛋白复性的方法简介与实验操作摘要：本文主要讲解了包涵体蛋白复性的技术的原理及操作方法，并附有相关案例。
包涵体的纯化和复性总结包涵体折叠复性的方法应具备以下几个特点：较高的活性蛋白质回收率；复性产物易于与错误折叠蛋白质分离；折叠复性后能够得到较高浓度的蛋白；折叠复性方法易于放大等。
蛋白复性的过程通常分为以下几个步骤：包涵体的洗涤包涵体在溶解之前需要进行洗涤，包涵体中主要含有重组蛋白，但也含有一些杂质，如一些外膜蛋白、质粒DNA 等，这些杂质会与包涵体粘连在一起，可以通过洗涤去除大多数杂质，但无法将杂蛋白去除干净。
包涵体的洗涤通常选用浓度较低的变性剂，如2M尿素在50mM Tris，pH7.0-8.5，1mM EDTA中洗涤包涵体。
此外可以用温和去垢剂TritonX-100洗涤去除膜碎片和膜蛋白。
同时，因为去垢剂的洗涤能力会随溶液离子强度升高而加强，所以在洗涤包涵体时可加入低浓度的尿素或高浓度的NaCl，使包涵体的纯度达到50%以上。
包涵体的溶解变性剂如尿素、盐酸胍，主要是通过离子间的相互作用，打断包涵体蛋白分子间的各种化学键，使多肽延伸。
盐酸胍是较尿素强的变性剂，它能溶解尿素不溶的包涵体。
SDS、正十六烷基三甲基铵氯化物、Sarkosyl等也可以破坏蛋白内的疏水键，溶解一些包涵体蛋白质。
另外，从某些含有半胱氨酸的蛋白质中分离出的包涵体，通常含有一些链间形成的二硫键和链内的非活性二硫键，这就还需加入还原剂，如巯基乙醇、二硫基苏糖醇（DTT）、二硫赤藓糖醇、半胱氨酸等。
这种还原性试剂能够同半胱氨酸形成各种二硫化物中间体，也会被复性用的二硫化物置换试剂所取代。
二硫键的形成和断裂是可逆的，直到最有利的蛋白二硫键形成，这个平衡才会被破坏。
常用变性剂对比尿素（8-10M）较盐酸胍慢而弱，溶解度为70-90%用尿素溶解具有不电离，呈中性，成本低，蛋白质复性后除去不会造成大量蛋白质沉淀溶解的包涵体可选用多种色谱法纯化盐酸胍（6-8M）溶解能力达95%以上，且溶解作用快而不造成重组蛋白质的共价修饰成本高、在酸性条件下易产生沉淀、复性后除去可能造成大量蛋白质沉淀对蛋白质离子交换色谱有干扰包涵体的复性复性是指通过去除变性剂使目标蛋白从完全伸展的变性状态恢复到正常的折叠结构，同时去除还原剂确保二硫键正常形成。
包涵体蛋白的复性研究进展
基金项目中国热带农业科学院中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金资助。
作者简介夏启玉（１９８３－），女，湖北浠水人，硕士研究生，研究方向：植物基因工程。
＊通讯作者，Ｅ!ｍａｉｌ：ｚｈａｎｇ＿ｃｓ＠ｈｏｔｍａｉｌ．ｃｏｍ。
收稿日期２００８!０３!１７基因工程技术的飞速发展为大规模生产目标蛋白质提供了可能，大肠杆菌因其易于操作、遗传背景清楚、发酵成本低和蛋白表达水平高等优点，成为生产重组蛋白的首选表达系统。
外源基因在大肠杆菌中的高表达常常导致包涵体的形成，包涵体易于分离纯化，并能避免蛋白酶对外源蛋白的降解，但包涵体不溶且无生物学活性。
因此，如何高效地复性包涵体蛋白是基因工程技术面临的一个难题。
笔者对包涵体蛋白的复性研究进展作一综述，旨在为促进基因工程技术的发展提供理论依据。
１包涵体简介包涵体是指细菌表达的蛋白在细胞内凝集形成的无活性固体颗粒。
一般含有５０％以上的重组蛋白，其余为核糖体元件、ＲＮＡ聚合酶、内毒素、外膜蛋白、质粒ＤＮＡ以及脂体、脂多糖等，一般直径大小为０．５～１．０μｍ，呈非水溶性。
包涵体主要是因为重组蛋白的表达量过高，表达过程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子或环境不适，无法形成正确的次级键等原因形成的。
２包涵体的前处理２．１洗涤由于包涵体中的重组蛋白与部分破碎的细胞膜、膜蛋白及脂体粘连在一起，所以在溶解包涵体之前要先洗涤包涵体，通常用低浓度的变性剂如２ｍｍｏｌ／Ｌ尿素在５０ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓｐＨ值７．０～８．５，１ｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ中洗涤。
高浓度的变性剂能使包涵体溶解。
此外可以用温和去垢剂ＴｒｉｔｏｎＸ!１００洗涤去除膜碎片和膜蛋白。
２．２溶解包涵体的溶解常用强的变性剂，如尿素（浓度８ｍｏｌ／Ｌ）和盐酸胍（ＧｄｎＨＣｌ，浓度６～８ｍｏｌ／Ｌ），通过离子间的相互作用，破坏包涵体蛋白间的氢键而使部分包涵体蛋白溶解。
尿素和盐酸胍属中强度变性剂，易经透析和超滤除去。
此外，去垢剂也能溶解部分包涵体。
蛇毒蛋白原核表达包涵体复性研究进展_刘晓飞
中国生物工程杂志China Biotechnology ，2011，31（3）：113-119蛇毒蛋白原核表达包涵体复性研究进展*刘晓飞裴剑竹杜国俊杨章民＊＊（陕西师范大学生命科学学院西安710062）摘要外源基因在大肠杆菌中表达后常形成不溶性的无活性包涵体。
包涵体的形成已经成为研究和应用活性蛋白质生产的主要障碍。
然而，在合适的条件下，包涵体经过溶解、纯化、复性过程后可在体外重新折叠成有活性的蛋白质。
迄今，已对蝰科、眼镜蛇科11种毒蛇的18个基因（包括金属蛋白酶、PLA 2、β-银环蛇毒素、心脏素素、丝氨酸蛋白酶、神经生长因子、C-型凝集素等）成功进行了原核表达，采用稀释复性、透析复性和层析复性三种方法成功进行了包涵体复性。
着重就蛇毒蛋白原核表达后包涵体复性所用的方法予以综述。
关键词蛇毒蛋白包涵体复性方法中图分类号Q786收稿日期：2010-10-08修回日期：2010-12-08*国家自然科学基金（30870303）、陕西省自然科学基金（SJ08C102）、中央高校基本科研业务费专项资金（GK200902029）资助项目＊＊通讯作者，电子信箱：yzhangmin@snnu．edu．cn蛇毒（snake venom ）是多种活性肽及酶组成的混合物，具有多种生物学及毒理学活性，其组分既可作为探索生命科学奥秘的基本工具，也是寻找药物先导化合物的源泉［1］。
采用传统生化分离的方法获得感兴趣的活性组分有其合理的一面，但由于天然蛇毒资源的有限性，以及不同产地、季节的蛇毒在组成方面的差异，使得分离纯化到量产的质量稳定而均一的活性组分的难度较大。
随着DNA 重组技术的发展成熟，运用大肠杆菌表达系统生产不同蛇毒蛋白的报道日趋增多。
然而，蛇毒蛋白在大肠杆菌中表达后常因形成无活性的包涵体而归于失败。
因此如何选择有效的方法，使其在体外复性是成功与否的关键。
迄今，已有很多从不同角度进行包涵体复性的报道［2-3］。
本文着重就蛇毒蛋白原核表达后包涵体的不同复性方法予以综述。
包涵体蛋白复性技术研究进展
件、Ｎ Ｒ Ａ聚合 酶 、 膜蛋 白 ｏ Ｃ、ｍｐ 外 ｍｐ ｏ Ｆ和 ｏ Ａ等 ， ｍｐ 环状 或缺 口的质 粒 Ｄ Ａ， Ｎ 以及 脂 多 糖 等 ， 溶 于 变 只 性剂 如尿 素 、 酸胍 等 。包涵 体形 成 的原 因有很 多 ， 盐 有 时甚 至是多 种 因素 的协 同作 用 。 主要 原 因是 重组
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８ ・ ４
微生物学免疫学进展
２ １ 年第 ４ 卷第 ２ ０２ ０ 期
Ｐｏ ｉ Ｍ ｃ ｂｏ Ｉ ｍ ｎ ｌ ｐ． ０ ２ Ｖ １ ０ Ｎ ． ｒ ｉ ｏ ｉ ｕｏ ｇｎ ｒ ｌｍ Ａ ｒ ２ １ ， ｏ ４ ， ｏ２ ．
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综
述 ・
包 涵体 蛋 白复性技术研究进展
包义风 综述 ； 应莲芳， 蒋琳 审校
白； 第三 ， 复性 ， 逐步去除变性剂， 使蛋白恢复正确折
叠 。前 两 步收率 相 对较 高 ， 三步 收率较 低 ， 第 不正 确 的折叠 蛋 白构 型是 主要 的 限制 因素 。 迄今 为止 ， 还没 有发 现通 用 的蛋 白复性 方法 ， 包
的速 度 、 二硫键 的错 误配 对 、 白质序 列本 身都 可能 蛋 导致 包涵 体 的形成 。 从基 因工 程 菌 中收 获包 涵体 ， 要 通 过 高 压匀 需 浆， 超声 波 ， 溶 等方 法 来 破 碎 菌 体 ， 离 心 除 去可 酶 再 溶性 蛋 白获得 粗制 包 涵 体 ， 种 粗 制 包 涵 体含 有 大 这
包涵体表达的蛋白的复性
包涵体表达的蛋白的复性摘要综述了包涵体形成、包涵体分离和溶解、包涵体折叠复性的方法、复性产率低下的主要因素以及通过分子伴侣、低分子量添加物等的应用而提高了蛋白质复性产率。
关键词包涵体蛋白质复性Abstract Strategies for decreasing the formation of inclusion bodies, isolation and resolution of inclusion bodies, refolding of inclusion body proteins and the cause of decreased refolding yields were included. Renaturation yield of recombinant protein have been improved by using some additives, such as molecular chaperone, small molecules.Key words inclusion body , protein , renaturation外源基因在大肠杆菌中的高表达常常导致包涵体的形成，虽然包涵体具有富集目标蛋白质、抗蛋白酶、对宿主毒性小等优点，但包涵体蛋白质的复性率一般都很低,而分子伴侣、低分子量添加物等在复性过程中的应用及新的复性方法的建立都大大提高了重组蛋白质复性产率。
一、包涵体：1.1包涵体的定义、组成与特性：包涵体是指细菌表达的蛋白在细胞内凝集，形成无活性的固体颗粒。
一般含有50%以上的重组蛋白，其余为核糖体元件、RNA聚合酶、内毒素、外膜蛋白ompC、ompF和ompA等，环状或缺口的质粒DNA，以及脂体、脂多糖等，大小为0.5-1um，具有很高的密度（约1.3mg/ml），无定形，呈非水溶性，只溶于变性剂如尿素、盐酸胍等。
NMR等新技术的应用表明包涵体具有一定量的二级结构，他们可能在复性的启动阶段中具有一定的作用。
包涵体表达的蛋白的复性
包涵体表达的蛋白的复性外源基因在大肠杆菌中的高表达常常导致包涵体的形成，虽然包涵体具有富集目标蛋白质、抗蛋白酶、对宿主毒性小等优点，但包涵体蛋白质的复性率一般都很低,而分子伴侣、低分子量添加物等在复性过程中的应用及新的复性方法的建立都大大提高了重组蛋白质复性产率。
一、包涵体：1.1包涵体的定义、组成与特性：包涵体是指细菌表达的蛋白在细胞内凝集，形成无活性的固体颗粒。
一般含有50%以上的重组蛋白，其余为核糖体元件、RNA聚合酶、内毒素、外膜蛋白ompC、ompF和ompA等，环状或缺口的质粒DNA，以及脂体、脂多糖等，大小为0.5-1um，具有很高的密度（约1.3mg/ml），无定形，呈非水溶性，只溶于变性剂如尿素、盐酸胍等。
NMR等新技术的应用表明包涵体具有一定量的二级结构，他们可能在复性的启动阶段中具有一定的作用。
[1]1.2包涵体的形成：主要因为在重组蛋白的表达过程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子，或环境不适，无法形成正确的次级键等原因形成的。
1.2.1、基因工程菌的表达产率过高，超过了细菌正常的代谢水平，由于细菌的δ因子的蛋白水解能力达到饱和，使之表达产物积累起来。
研究发现在低表达时很少形成包涵体，表达量越高越容易形成包涵体。
原因可能是合成速度太快，以至于没有足够的时间进行折叠，二硫键不能正确的配对，过多的蛋白间的非特异性结合，蛋白质无法达到足够的溶解度等。
1.2.2、重组蛋白的氨基酸组成：一般说含硫氨基酸越多越易形成包涵体，而脯氨酸的含量明显与包涵体的形成呈正相关。
1.2.3、重组蛋白所处的环境：发酵温度高或胞内pH接近蛋白的等电点时容易形成包涵体。
1.2.4、重组蛋白是大肠杆菌的异源蛋白，由于缺乏真核生物中翻译后修饰所需酶类和辅助因子，如折叠酶和分子伴侣等，致使中间体大量积累，容易形成包涵体沉淀。
1.2.5、蛋白质在合成之后，于中性pH或接近中性pH的环境下，其本身固有的溶解度对于包涵体的形成比较关键，即是说，有的表达产率很高，如Aspartase和Cyanase,表达产率达菌体蛋白的30%,也不形成包涵体，而以可溶形式出现。
包涵体蛋白质的复性研究进展
功应用于 生产中的一种复 性方法 , 按 其作 用机 制一般 分成 分子排阻 复性、 介质吸附复性、 疏水色谱复性 3 类。 2. 1 分子排阻复性 分子 排阻复性主要是根据包涵体蛋白质与变 性剂之间 分子质量 大小的差异 , 利 用凝 胶柱使 得变 性剂 与包涵 体蛋 白质分离 从而得以复性。 介质的 分离 范围 和分离 度、 蛋白 质浓度、 进样体积、 蛋白质在 柱内的保留时间以及 凝胶柱的药物生 Nhomakorabea物
技
术
306
P harm aceut ical Biot echno logy
2007, 14( 4) : 306~ 309
包涵体蛋白质的复性研究进展
张婷婷, 叶波平
*
*
( 中国药科大学 生命科学与技术学院 , 江苏 南京 210009)
摘
要
外源基因在大肠杆菌中高效表达时 , 通常会形 成不溶 性、 无活性的 蛋白聚 集体
gu等人6利用尿素和ph梯度的凝胶过滤柱对单链抗体可变区scfv进行了复性与传统的分离方法相比具有高效和省时的优点其复性的原则是选择仅对包涵体蛋白全排阻的树脂预先引入从高到底的尿素梯度和从低到高的ph梯度在层析过程中变性的蛋白沿着尿素梯度向下移至复性缓冲液中为蛋白质提供了一个较温和的环境达到了线性去除变性剂减少聚集产生的目标
包涵 体。包涵
体中 富含表达的重组蛋白质 , 它们经分离、 洗涤、 变性溶解以及复性 等过程才能得到具有生物活性的 蛋白质。近 年来 , 随着对包涵体体外复性机制的深入研究 , 从包涵体中 复性重组蛋 白质已 经有了 很多的策 略和方 法。文章 就有关工作的进展进行了综述。 关键词 包涵体 ; 折叠 ; 蛋白复性 文献标识码 : A 文章编号 : 1005 8915( 2007) 04 0306 04 中图分类号 : Q 7
蛋白质的排阻色谱复性的新进展
蛋白质的排阻色谱复性的新进展3王超展 耿信笃33(西北大学现代分离科学研究所现代分离科学陕西省重点实验室 西安 710069)摘要 外源蛋白在大肠杆菌中高效表达时,常常形成不溶的、无活性的包涵体,包涵体蛋白的复性是重组蛋白生产过程中的一个技术难题。
排阻色谱(size exclusion chromatography ,SEC )用于蛋白复性是一种较新的、适用于任何一种蛋白的方法,与常用的稀释复性法相比,它能在高的起始蛋白浓度下对蛋白进行复性,活性回收率较高,同时又能使目标蛋白得到一定程度的纯化。
对使用SEC 复性的进展进行了评述,其内容包括SEC 复性的原理及其复性过程中的影响因素,并对其未来发展进行了展望。
关键词 包涵体 重组蛋白 蛋白折叠 复性 排阻色谱收稿日期:2004202224 修回日期:20042052113国家自然科学基金资助项目(20175016).33通讯作者,电子信箱:xdgeng @. 重组蛋白在大肠杆菌中的高水平表达经常导致蛋白聚集而形成不溶的、无活性的包涵体。
为此,欲获得天然活性态的目标产物,必须对经过脲或盐酸胍等变性剂溶解后的变性蛋白进行复性。
目前,稀释法是应用最为广泛的复性方法,然而其复性效率很低,一般为5%～20%。
色谱法复性是近年来发展较快的一种蛋白复性方法,具有抑制聚集,活性回收率高,可以在较高蛋白浓度下复性,并且同时可以使蛋白质得到纯化的优点[1,2]。
SEC 由于容易操作和放大,且适用于各种变性蛋白的复性,是目前研究最多的一种色谱复性方法之一[3]。
1992年,G eng 等[4]用排阻色谱(SEC ,在用软基质为固定相时,又称其为凝胶渗透色谱,或简称凝胶色谱,G PC )对溶菌酶(Lys )、核糖核酸酶(RNase )和牛血清白蛋白(BS A )进行了复性并同时进行了分离,虽然当时并不认为SEC 的复性效果会比疏水色谱法(HIC )好,但这是首次对用SEC 法复性蛋白进行报道。
包涵体蛋白的变复性研究
包涵体蛋白的变复性研究高永贵 关怡新 姚善泾(浙江大学化学工程与生物工程学系,浙江杭州 310027)摘 要:针对基因工程蛋白在 E.coli中表达多为无活性包涵体的特点,介绍了包涵体洗涤和去折叠的方法、蛋白质体外折叠的过程和机理、体外复性技术以及复性蛋白的检测,着重讨论了最近发展起来的蛋白质复性新技术.关 键 词:包涵体,去折叠,蛋白质复性中图分类号: 文献标识码:A 文章编号:1001-7119(2003)01-0010-06R efolding of G enetic E ngineering Protein Expressed as I nclusion BodiesG AO Yong-gui,GUAN Yi-xin,YAO Shan-jing(Depart.of Chem.and Biochem.Eng.,Zhejiang Univ.,Hangzhou310027China)Abstract:The genes,of interest are often expressed as inactive inclusion bodies in Escherichia coli,s o the methods for resus2 pending and un folding inclusion bodies,the pathway and technique of protein refolding in vitro and the determination of renatured protein was overviewed.Especially,the new technique of protein refolding recently developed was emphasized.K ey w ords:inclusion body;un folding;protein renaturation 随着基因工程技术的迅猛发展,人们越来越多地通过蛋白质的异源表达为临床和工业生产提供一些蛋白质多肽产品.迄今为止, E.coli以其易于操作、遗传背景清楚、发酵成本低和蛋白表达水平高等优点,依然是生产重组蛋白的首选表达系统,尤其适合表达不经过蛋白质翻译后修饰(如糖基化)就具有生物活性的基因工程蛋白.但是在 E. coli中表达的蛋白常常以包涵体的形式沉积于细胞内,表现为无活性的不溶性聚集物,如何高效地复性包涵体蛋白经常是基因工程技术面临的一个难题.随着人类基因组计划的完成和后基因组计划的实施,人们将会更多地面临这一问题的挑战.因此,本文将着重介绍包涵体蛋白的变复性技术及其最新研究动态,期望能有助于促进这一研究的深入和问题的早日解决.1 基因工程蛋白在 E.coli中的表达革兰氏阴性菌 E.coli被内膜(又称质膜)和外膜分隔成胞内、周质和胞外三个腔室,相应地在E.coli中表达的异源重组蛋白可定位于胞内、周质空间或胞外培养基中[1].有限的周质空间使得产物的表达量仅为0.3%～4%,同时产物容易发生二硫键错配,因此除了作为抗体基因表达的首选策略外,至今以周质分泌途径生产重组蛋白达到工业化规模的应用很少[2].细菌素释放蛋白(Bacterioncin release protein,BRP)系统和α-溶血素(Haem olysin A,HlyA)系统是目前两种主要使外源蛋白分泌到培养基的表达系统,但是前一系统的缺陷是BRP的诱导表达可能会影响工程菌的生长;后者的缺陷则在于融合蛋白C端的HlyA信号序列有时会干扰融 第19卷第1期2003年1月 科技通报BU LLETI N OF SCIE NCE AND TECH NO LOGYV ol.19 N o.1 Jan.2003收稿日期:2001-10-15;修订日期:2002-04-29基金项目:教育部留学回国科研启动基金及浙江省自然科学基金(201099)资助项目作者简介:高永贵,男,1971年生,湖北黄岗人,生物化学工程博士.合蛋白的生物活性,因此迄今只有少数重组蛋白可成功地利用 E.coli进行分泌表达[3].在胞内直接表达蛋白则是研究最早、采用最多的表达策略,目前已经积累了许多成功的经验.采用较强的启动子(如λP L、T7或串联启动子),外源基因可在胞内获得高效表达,一般占细菌总蛋白的10%～50%.胞内表达的最大问题是产物形成不溶性的包涵体,虽然这可为后续的分离纯化带来方便,但包涵体必须经过体外复性才有可能获得生物活性[1].2 包涵体的去折叠的,任何影响中间体稳定的因素(如pH值、离子强度、温度等)都可导致包涵体的形成.鉴于包涵体蛋白无活性及复性困难的缺点,在表达外源基因的同时,人们试图采用共表达分子伴侣或折叠酶以及调[1],但效果并不理想,因此面临的挑战是既能利用包涵体蛋白的高表达,又能对其进行很好地复性.为了成功地对包涵体蛋白复性,应先对包涵体进行分离纯化及去折叠(即变性溶解),然后采用合适的复性方法促进变性蛋白再折叠进而恢复活性.2.1 包涵体的分离纯化常用高压匀化或机械、化学和酶相结合的方法破碎含包涵体的宿主菌细胞,再将破碎液通过低速离心或过滤除去可溶蛋白后获得包涵体.包涵体中除了目的蛋白外还含有脂类、脂多糖、核酸和杂蛋白等其它成分,而这些成分会影响包涵体蛋白的复性,故去折叠前应洗涤包涵体,以去除杂质.常用E DT A、低浓度的变性剂(尿素、盐酸胍)、弱去污剂Trion X-100、脱氧胆酸等洗涤包涵体,洗涤后包涵体的主要成分为聚合态的目的蛋白[4].2.2 包涵体的去折叠极端pH值、高温、去污剂、高浓度的无机盐或有机溶剂均可用于溶解包涵体.从已发表的文献看,绝大多数是采用6m ol/L盐酸胍或8m ol/L脲并结合还原剂来溶解包涵体.但是高浓度的变性剂可能会严重破坏蛋白质的二级结构,产生不可逆变性,导致无法复性.因此,包涵体溶解时不仅要采用尽可能低的变性剂浓度,还要注重其它包涵体溶解方法的研究.极端pH和变温就被用来溶解包涵体,以替代高浓度的变性剂.G avit et al.采用低pH(≤2.6)和高温(85℃)溶解抗真菌重组肽的包涵体[5].高pH (≥12)结合低浓度的变性剂(如20%～40%异丙基或n-丙基乙醇溶液)用于溶解生长激素包涵体非常有效[6].去污剂用于蛋白质去折叠,其优点是蛋白质去折叠后即具生物活性.采用此方法洗涤包涵体时,应尽可能除去与膜结合的蛋白酶,避免包涵体溶解后即被降解;另外去污剂会干扰蛋白质下游层析过程,因此层析前必须除去复性混合物中的去污剂[4].当蛋白表达量很高时,包涵体的在位溶解质复性的收率下降[8].这些方法的选择与体系和基因工程蛋白的性质有关,虽然有许多方法可用来溶解包涵体,但不同溶解方法将极大地影响后续的复性和整个加工过程的成本,所以对具体的包涵体蛋白,进行去折叠过程的方法学研究仍具有实用价值.3 蛋白质体外折叠复性的过程 与机理 An finsen在研究RNase A时发现一种蛋白质的结构、稳定性和功能的全部信息均来源于其氨基酸组成和排列,多肽链的折叠是一个自发的过程,主要取决于给定氨基酸的序列[7].这一规律被称作生物体内的第二遗传密码.虽然第二遗传密码如何控制蛋白质高级结构形成的机制至今仍不明了,但已经清楚的是变性蛋白质的再折叠同时受热力学和动力学控制,三级结构形成的动力来自去折叠蛋白质暴露在外的疏水基团逐步被包埋而引起的自由能变化.常用图1所示的模型来描述蛋白质折叠的过程[8].在折叠起始阶段,去折叠蛋白质(U)的疏水性氨基酸暴露在分子表面,产生大量非极性基团,热力学的驱动力使它们聚集在一起形成幼稚的二级结构(I1…I i为中间态),幼稚的二级结构很不稳定,与U之间存在着平衡.在中间态I i向天然状态(N)转变过程中,存在更加有序、结构致密、几乎与天然态相似的熔球态(M olten globule,I n),I n与N之间存在着较大的自由能屏障,两者的转化是整个折 第1期高永贵等.包涵体蛋白的变复性研究11 叠途径的限速步骤.中间体正确折叠是分子内的一级反应,而中间体的聚集则是发生在分子间的二级或高级反应,中间体的浓度对聚集反应影响大,必须控制中间体的浓度以有利于反应向正确折叠的方向进行.变性蛋白质的空间结构被破坏,疏水侧链外露,而复性后的蛋白质具有致密的空间结构,疏水基团包埋使得蛋白质疏水性逐渐减小而亲水性增强,因此这一特性的变化对进行蛋白质复性方法学探究、建立监测蛋白质复性动态过程和复性蛋白质的定量分析大有裨益.图1 蛋白质再析叠的动态模型Fig.1K inetic m odel of protein refolding4 去折叠包涵体蛋白的体外 复性方法 包涵体蛋白的体外复性是基因工程蛋白生产过程中最关键和最困难的一步,已成为产业化的瓶颈之一.蛋白质体外复性的一般策略就是考虑影响复性收率的各种因素(如蛋白质浓度、温度、pH 值、适宜的氧化—还原体系等)和应用实际,尽量抑制蛋白质的聚集而促进折叠中间体向天然态的方向折叠.在实验室少量蛋白需要复性时,一般采用传统的稀释和透析复性,复性时蛋白质初浓度为10～100μg/m L 或更低,但工业上采用此复性方法需要很多的容器及大量的复性缓冲液,同时复性蛋白回收困难,因此,笔者着重探讨最近发展起来的包涵体复性技术,以促进这一问题的早日解决.4.1 分子伴侣介导的复性法分子伴侣(M olecular Chaperone )是抑制伸展肽链及部分折叠肽链的聚集、协助蛋白质折叠复性的一类蛋白,目前已经确认的分子伴侣主要为Hsp60、Hsp70以及Hsp90三个高度保守的家族.当变性蛋白进入分子伴侣中空环状的疏水空腔后,在空腔的“An finsen Cage ”分隔下可部分或完全避免蛋白分子间的聚集,使变性蛋白在疏水环境下进行“结合-释放-再结合”的循环直至恢复到天然构象状态,从而防止多肽链的错误折叠或聚集.分子伴侣与变性蛋白相互作用的特异性很低或不具特异性,这为体外分子伴侣介导的复性提供了更多的选择对象.剑桥大学Fersht et al.对分子伴侣介导的蛋白折叠复性的研究最为出色,他们不仅研究了分子伴侣G roE L 促进蛋白折叠的机理及高效复性的协同条件,如与G roES 配对使用、ATP 的需求,而且用E.coli 表达制备了起作用的Minichaperone(G roE L191-345片断),并建立了一套固定化的、可以循环使用的分子伴侣重折叠系统[9,10].该系统由固定在琼脂糖凝胶上的三部分组成,即能阻止蛋白聚合的Minichaperone (G roE L191-345)、能催化二硫键重排和形成的DsbA 以及起顺反异构作用的肽基脯氨酸异构酶(PPI ).用此系统对蝎毒Cn5进行复性,活性收率达87%,解决了蝎毒Cn5复性困难的问题.徐明波等利用PDI (二硫键异构酶)、PPI 和分子伴侣催化重组人I L -2和G M -CSF 包涵体的再折叠,也获得了较好的复性收率[11].天然分子伴侣来源有限,对那些价格相对低廉的蛋白质,人工分子伴侣的应用或许更具实际意义.David 和Samuel 研究发现采用小分子的去污剂和环糊精(β-C D )可引导蛋白质折叠,并把这些低分子量的助剂称为人工分子伴侣,其协助的蛋白质折叠过程为:先将高浓度的盐酸胍溶液快速稀释,去污剂捕获非天然状态的蛋白质形成蛋白质-去污剂复合物,从而阻止了蛋白质的凝聚,当加入环糊精使去污剂从蛋白质上剥离后,蛋白质就逐渐复性[12].最近,刘晓光等利用阳离子表面活性剂CT AB 和环糊精联合作用协助变性溶菌酶的复性[13],也取得较好的效果.分子伴侣的实用性取决于其稳定性、重复利用率及与复性蛋白分离的难易,固定化Minichaperone 技术及人工分子伴侣的应用是今后分子伴侣介导的复性方法的发展方向.4.2 反向微团复性法反向微团是由表面活性剂在有机溶剂中形成的水相液滴,微团中表面活性剂极性头部向内,疏水尾部向外.在含有增溶剂的水溶液中,将去折叠的蛋白引入到含有反向微团的溶液中时,蛋白将会插入到微团中,并与活性剂的极性头作用,逐渐进行复性.反向微团复性蛋白质的主要过程如图2所示,通过相转移使变性溶解的蛋白进入到反向微团中,然后交换缓冲液而逐渐降低反向微团中的变性剂浓度,同时加入氧化还原剂使变性蛋白的二硫键再氧化重排而获得天然构象,最后将复性蛋白从微团中抽提到水相溶液中.利用反向微团可使盐酸胍变性的RNase A 在24h 内获得100%的复性率[14],表明反向微团是一种很有前景的蛋白复性方法.要形成反向微团并促使变性蛋白进入微团内的条件苛刻,而微团内的微环境很难与蛋白质复性的最适 12 科 技 通 报19卷条件一致,因此该法的实际操作复杂,同时复性对象仅限极少数蛋白.图2 反向微团中的蛋白折叠技术更是日益备受关注.与传统的稀释法或透析法相比,层析折叠复性的优势在于:1)在进样后可很快脱除变性剂,操作效率高;2)层析固定相对变性蛋白的吸附可减少变性蛋白在脱除变性剂后形成聚集体,这不仅提高了蛋白质复性的活性收率,而且可提高蛋白质复性的初始浓度;3)在复性的同时可使目标蛋白与杂质分离,特别适合包涵体蛋白的复性;4)便于回收变性剂,以降低废水处理成本.目前,用于蛋白质复性的层析折叠复性法主要有凝胶G FC 基于蛋白质S tokes 半径的差异和凝胶排阻作用,通过“Bu fferExchange ”逐渐脱除变性剂而使蛋白质复性 操作简单,可对所有蛋白质进行复性,介质可多次使用,但易造成样品的过度稀释和引起柱堵塞,样品处理量较小,纯化效果稍差carbonic anhydrase E.coli integration host factor ,rhETS -1,RNase A Heterodimeric platelet -derived growth factor u -PA 171819HIC 基于蛋白质与介质的疏水性相互结合,实现蛋白质与极性变性剂的分离而促使蛋白质复性 复性与纯化的集成,同时可检测活性蛋白的量,但仅限部分蛋白的折叠分析,无工业应用实例,易造成柱堵塞rhIFN -γ,rhIFN -βRecombinant human G C -CSF2021IEC 蛋白质与介质间存在电荷作用力,梯度洗脱时脱除变性剂而逐步复性蛋白质 对蛋白质具有浓缩作用,柱容量高,但变性剂易在柱上保留而影响蛋白吸附,只限一些蛋白,介质较贵Papiloma virus HPVE7MS2fusion protein Recombinant human secretory leukocyte2223AFC 蛋白与配体的特异性亲和吸附,洗脱时使变性剂与蛋白分离,促使蛋白复性,固定化配体有金属、脂质体和分子伴侣 复性与纯化的集成,复性后蛋白浓度较高,但介质昂贵且寿命较短,仅限具H istine T ag 等少数蛋白rhPrion bovine carbonic anhydrase2425 蛋白质层析折叠复性是一种处于发展阶段的方法,不仅需要从理论方面对复性的机理进行深入研究,而且应该关注合成高性能(对蛋白质复性和分离效果好)价格比的层析介质的研究.无论如何,层析方法在蛋白质复性方面已发挥着越来越大的作用,尤其是操作简单的G FC 复性蛋白质技术,已被许多厂家大规模地应用于工业化生产.但液相层析技术用于蛋白质的复性,一个最为主要的问题就是复性过程中会产生蛋白质聚集体,这些聚集体沉聚在柱上造成堵塞,降低了分辨率,并引起柱压升高.谷振宇等人发展的一种脲梯度凝胶过滤复性蛋白质的新方法,即蛋白质在脲由高到低的无级变化浓度下逐渐复性,复性后再与脲等小分子变性剂分开,从而更好地避免蛋白质聚合[26],当然该法对操作和设备要求较高.笔者进行复性液中添加适量脲的凝胶复性溶菌酶的研究,结果表明,即使变性溶菌酶的初始浓度高达100mg/m L 也很少有蛋白质沉淀,同时采用等盐洗脱,操作简单.还可采用连续上样操作进而提高功效.4.4 其它复性方法近年来折叠促进剂协助的复性方法也取得长足发展.我们把能够促进蛋白再折叠的化学物质统 第1期高永贵等.包涵体蛋白的变复性研究13 称为折叠促进剂,折叠促进剂的作用原理在于稳定复性蛋白质的天然结构、优先去除错误折叠蛋白质的稳定性、增加折叠复性中间体的溶解性等,进而抑制或减少了导致蛋白质无活性的聚集.应用于蛋白质复性并具有显著效果的折叠促进剂有表面活性剂[27]、聚乙二醇(PFG)[28,29]、L-精氨酸[30]、抗体等[31].折叠促进剂协助的复性也存在溶液稀释的过程,因此与传统的稀释复性一样具有活性蛋白浓度低、目标产物回收困难的缺点,尤其是表面活性剂可与蛋白质结合或形成胶束,很难去除.虽然如此,但聚乙二醇还是一种较有前景的折叠促进剂. PEG不仅能显著增加包涵体蛋白的复性效率,同时还是双水相的成相聚合物,因此利用双水相技术可以实现蛋白质复性与分离的耦合.此外,由于分子印迹技术提供了制备具有分子识别功能的模板聚合物,所以利用这一模板,在缓慢复性的同时可分离变性态和天然态的蛋白质,避免蛋白质聚集,而且还可采用亲和折叠过渡态的模板,起到类似酶的诱导协和作用而促进蛋白质的折叠.迄今为止,虽然分子印迹技术主要用于分离,但分子印迹介导蛋白质复性的诱人前景值得人们探索.5 复性蛋白质的检测研究蛋白质的复性,必须建立适当的检测方法,以鉴定复性蛋白质的生化、免疫学、物性以及蛋白变性态与天然态的区别,从而对复性方法进行评价和条件优化.主要有:1)凝胶电泳 其中最为常用的是还原和非还原的S DS-PAGE,适于鉴定产物的纯度及复性蛋白质的聚集状态;2)光谱学方法 主要有紫外光谱、荧光光谱和圆二色谱C D等,这些方法可用来研究蛋白质分子复性过程中构象的变化,特别用于鉴定折叠中间体和复性蛋白质的构象[12].3)色谱学方法 近几年人们利用蛋白质天然态和变性态色谱行为的差异来研究复性并用于复性蛋白质的检测如天然态、变性及复性蛋白质、折叠中间体等SEC上色谱保留体积的差异[15,18],反相高效液相色谱(RP-HP LC)检测活性和变性重组人粒细胞集落刺激因子包涵体蛋白的含量进而监测复性动态过程[32];4)粘度与浊度 蛋白质折叠状态不同,其溶解性存在一定差异,从而影响其粘度的变化,因此可通过测定溶液的浊度(常以600或400nm的光吸收值表示)来反映蛋白质聚集的快慢与程度;5)免疫学方法 利用酶联免疫、蛋白印迹法可以测定不同状态蛋白质的抗体-抗原结合力的差异,从而说明其空间构象状态;6)生物学活性及比活性测定 这是作为对最后的折叠状态评价的一个重要指标,一般是通过采用动物或细胞模型直接测定复性蛋白质所具有的生物学效应来表示.6 结束语随着越来越多的功能基因被发现和克隆,蛋白质异源表达将会越来越受到重视,如何使表达产物具有生物活性是决定该产物能否服务于人类健康和上游生物学家的努力是否有意义的根本条件,因此蛋白质体内外折叠机理的差异和体外高效复性技术必将倍受关注.参考文献:[1] 龙建银,王会信.外源基因在大肠杆菌中表达的研究进展[J].生物化学与生物物理进展,1997,24(2):126～131.[2] Wulfing C,Pluckthun A.Protein folding in the periplasm ofEscherichia coli.[J].M ol M icrobiol,1994,12(5):685～692.[3] Blight M A,H olland I B.Heterologus protein secretion and the ver2satile Escherichia coli haem olysin translocator[J].T rends in Biotech, 1994,12(11):450～455.[4] De Bernardez Clark E.Protein refolding for industrial process[J].Current Opinion in Biotechnology,2001,12:202～207.[5] G avit P,Better M.Production of antifungal recombinant peptides inE schericia coli[J].J Biotechnol,2000M,79:127～136.[6] Patra A K,Mukhopadhyay R,Muhhija R,et al.Optimization of in2clusion body s olubilization and renaturation of recombinant human growth horm one from Escherichia coli.[J].Protein Express Purif, 2000,18:182～192.[7] An finsen C B.Principles that g overn the folding of protein chains[J].Science,1973,181:223～230.[8] G oldberg M E,Rudolph R,Jaenicke R.A kinetic study of the com2petition between renaturation and aggregation during the refolding of denatured-reduced egg white lys ozyme[J].Biochemistry,1991,30: 2790～2797.[9] Ralph Z ahn,Ashley M B,Sarah P,et al.Chaperone activity andstructure of m onomeric polypeptide binding domains of G roE L[J].Proc Natl Acad Sci US A,1996,93:15024～15029.[10] M yriam M A,C onsuelo G,Lourival D P,et al.Oxidative refoldingchromatography:folding of the scorpion toxin Cn5[J].NatureBiotechnology,1999,17:187～191.[11] 徐明波,孟文华,马贤凯.PDI、PPI和分子伴侣催化重组人I L-2和G M-CSF的再折叠[J].中国科学B辑,1994,24:717～723.[12] R ozema D,G allman S H.Artificial chaperone-assisted refolding of 14 科 技 通 报19卷Denatured-reduced lys ozyme:m odulation of the com petition be2 tween renaturation and aggregation[J].Biochemistry,1996,35:15760～15771.[13] 刘晓光,董晓燕.分子伴侣与蛋白质复性的简介[J].化学工业与工程,2000,17(2):120～124.[14] Hagen A J,Hatton T A,W ang D I C.Protein refolding in reversemicelles[J].Biotech and Bioeng,1989,35:955～965.[15] Batas B,Chaudhuri J B.Protein refolding at high concentration us2ing size-exclusion chromatography[J].Biotech and Bioeng,1996,50:16～23.[16] Batas B,Chaudhuri J B.C onsideration of sam ple application and e2lution during size-exclusion chromatography-based protein refold2 ing[J].J Chromatography A,1999,864:229～236.[17] W emer M H.Refolding proteins by gel filtration chromatography[J].FE BS Lett,1994,345(2):125～130.[18] Müller C,Rinas U.Renaturation of heterodimeric platelet-derivedgrowth factor from inclusion bodies of recombinant Escherichia coliusing size-exclusion chromatography[J].J Chromatography A,1999,855:203～213.[19] Fahey E M,Chaudhuri J B.Refolding of low m olecular weighturokinase plasminogen activator by dilution and size exclusion chro2matography-a com parative study[J].Separation Science andT echnology,2000,35(11):1743～1760.[20] G eng X D,Chang X Q.H igh-performance hydrophobic interactionchromatography as a tool for protein refolding[J].J Chromatogra2 phy,1992,599:185～194.[21] Liu T,G eng X D.The separation efficiency of biopolymers withshort column in liquid chromatography[J].Chinese Chemical Let2ter,1999,10(3):219～212.[22] Suttnar J.Procedure for refolding and purification of recombinantfrom Escherichia coli inclusion bodies using a strong anion exchanger[J].J Chromatography B,1994,656(1):123～126.[23] Hamaker K H.Chromatography for rapid bu ffer exchange and refold2ing of secreatory leukocyte protease inhibitor[J].Biotech Prog,1996,12(2):184～189.[24] Z ahn R.Human prion proteins expressed in Escherichia coli and pu2rified by high affinity column refolding[J].FE BS letters,1997,417(3):400～404.[25] Y oshim oto M.Imm obilized lipos ome chromatography for studies ofprotein-membrane interactions and refolding of denatured bovinecarbonic anhydrase[J].J Chromatography B,1998,712:59～71.[26] 谷振宇,苏志国.蛋白质的层析折叠复性[J].化工学报,2000,51(S):325～329.[27] Z ardeneta G,H orowitz P M.Detergent,lipos ome and micelle-as2sisted protein refolding[J].Anal Biochem,1994,223:1～6. [28] Cheland J L,Builder S E,S wartz J R,et al.P olyethylene glycolenhanced protein refolding[J].Bio/T ech,1992,10:1013～1019.[29] 凌明圣,许祥裕,施凤霞,等.聚乙二醇增加重组人粒-单系集落刺激因子复性效率的研究[J].药物生物技术,1997,4(1):5～8.[30] K ohno T,Carmichael D F,S ommer A,et al.Refolding of recom2binant proteins[J].M ethods Enzym ol,1990,185:187～195. [31] Carls on J D,Y armush ML.Antibody assisted protein refolding[J].Bio/T ech,1992,10:86～91.[32] 钟 英.RP-HP LC监测重组人粒细胞集落刺激因子复性动态过程[J].中国药学杂志,1999,34(12):834～836.【上接第9页】参考文献:[1] Hayashi T.Research and development of micromechanisms[J].Ul2tras onic,2000,38(1):6～14.[2] K iy oshi I.A m obile micro-robot using centrifugal forces[A].IEEE/AS ME Int C on f on Advanced Intelligent M echantronics[C].Atlanta,US A,1999,736～741.[3] H irofumi M,T akashi Y,Isao S.Insect-m odel based microrobot[J].R obotics and Autonom ous Systems,1997,21(3):317～322.[4] Hayashi I,I watsuki N.M icro m oving robotics[A].IEEE MHS’98[C].日本名古屋,1998,41～50.[5] Y amaguchi T,K agawa Y,Hayashi I,et al.Screw principle micro2robot passing steps in a small pipe[A].IEEE MHS’99[C].Nag oy2 a,Japan,1999.149～152.[6] G uo S X,Fukuda T,Oguro K.Development of an artificial fish mi2crorobot[A].IEEE MHS’99[C].日本名古屋,1999,135～140.[7] Ikuta K,N okata M.T w o-lead-wire drive for multi-micro actua2tor[A].IEEE Int C on f on R obotics&Automation[C].Detroit, M ichigan,1999,2378～2384.[8] Ishiyama K,Arai K I.S piral-type micro-machine for medical ap2plications[A].IEEE MHS’2000[C].日本名古屋,2000,65～69.[9] Zhou Y S,He H N.S tudy on the locom otion speed of intestine robot[J].T ribology,1999,19(4):299～303(in Chinese).[10] Lkeuchl K,Y oshinaka K,Hashim oto S,et al.Locom otion of med2ical micro robot with spiral ribs using mucus[A].IEEE MHS’96[C].日本名古屋,1996,217～222.[11] Paolo D,M aria C C.A m obile microrobot actuated by a new elec2tromagnetic w obble microm otor[J].IEEE/AS ME T ran.on M echa2 tronics,1998,3(1):9～16.[12] Nishikawa H,Sasaya T,Shibata T,et al.In-pipe wireless microlocom otive system[A].IEEE MHS’99[C].Nag oya,Japan.1999,141～147.[13] Shibata T,Sasaya T,K awahara N.M icrowave energy supply systemfor in-pipe micromachine[A].IEEE MHS’98[C].日本名古屋,1998,237～242.[14] E llenby S B.Safety issues concerning medical robot[A].IEEC oll.on Safety and Reliability of C om plex R obotic System[C].London,UK,1994,3/1-3/4. 第1期高永贵等.包涵体蛋白的变复性研究15 。
包涵体蛋白体外复性的研究进展
17卷6期2001年11月生 物 工 程 学 报Chinese Journal o f Biotechnology V ol.17 N o.6N ovember 2001收稿日期:2001204213,修回日期:2001207220。
基金项目:国家863项目(8632102209204201)资助。
3通讯作者。
T el :86210264889350;Fax :86210264857285;E 2mail :hlhuang @ 包涵体蛋白体外复性的研究进展方 敏 黄华 3(中国科学院遗传研究所,北京100101)摘 要 外源基因在大肠杆菌中高水平表达时,通常会形成无活性的蛋白聚集体即包涵体。
包涵体富含表达的重组蛋白,经分离、变性溶解后须再经过一个合适的复性过程实现变性蛋白的重折叠,才能够得到生物活性蛋白。
近年来,发展了许多特异的策略和方法来从包涵体中复性重组蛋白。
最近的进展包括固定化复性以及用一些低分子量的添加剂等来减少复性过程中蛋白质的聚集,提高活性蛋白的产率。
关键词 重组蛋白,包涵体,重折叠,复性,二硫键形成中图分类号 Q51 文献标识码 C 文章编号100023061(2001)0620608205 DNA 重组技术的发展使得蛋白质的生产进入了一个新时代。
大肠杆菌表达体系因其具有低廉性、高效性和稳定性等优点在科研生产中被广泛应用。
然而,重组蛋白在大肠杆菌中的高水平表达经常导致蛋白聚集而形成不溶的、无活性的包涵体。
因此,自从应用大肠杆菌体系表达基因工程产品以来,人们就一直通过以下两个方向的研究以期望得到高活性、高产量的重组蛋白:(1)促进重组蛋白在大肠杆菌中的可溶表达:改变大肠杆菌的生长条件,或使重组蛋白与其它蛋白(如分子伴侣、折叠酶等)融合表达或共表达,或使重组蛋白分泌表达至细菌周质腔中等策略使重组蛋白在大肠杆菌中表达成可溶的生物活性形式。
(2)优化复性过程,将包涵体蛋白在体外复性得到生物活性蛋白。
重组包涵体蛋白的变性溶解及复性研究
表达重组包涵体蛋白的变性溶解及复性研究概述高应瑞（译）目前，由于基因组序列数据库的快速扩增，重组蛋白的规模化生产已经成为迫切需要。
因此，通过基因重组生产蛋白质，必须考虑其蛋白特性和活性构象，以确定它们的生物学功能。
如果蛋白质的功能以及其基因的生物学功能未知，无论该蛋白质是在天然结构或在非天然结构，都不能通过生物活性评估来对其进行评估。
至今为止,有越来越多的异源重组蛋白成功得到表达。
其中大肠埃希氏菌（大肠杆菌）是最常使用的表达系统。
然而, 在大肠杆菌中异源表达外源基因往往会导致表达蛋白形成不溶性包涵体（IBS）。
包涵体必须经过变性溶解及复性过程后才会恢复其蛋白的生物活性。
包涵体复性过程的是一个非常复杂的过程，往往需要经过大量的反复试验才能确定其复性工艺参数。
在无活性的包涵体到具有生物活性蛋白的过程中，有两个最重要的影响因素:即包涵体的变性与复性。
包涵体蛋白的溶解必须使其蛋白肽链单分子进行分散并使最大程度减少蛋白质分子肽链内以及肽链之间的相互作用。
溶剂的选择，如尿素，盐酸胍，或洗涤剂等，在包涵体溶解过程中起关键作用，蛋白质变性溶解之后进行复性。
包涵体蛋白溶解后,即可进行蛋白复性。
蛋白复性过程不是单一反应,而蛋白的正确折叠与错误折叠和蛋白聚集的竞争过程。
在蛋白复性的竞争过程中,蛋白的复性率主要取决于变性剂的最终浓度以及溶剂的条件。
本文主要讨论的重点是复性工艺中对变性剂去除方式、溶剂、小分子添加剂以及工艺条件。
小分子添加剂的作用来自其在体内的功能定位。
小分子添加剂能够在生物体缺水的情况下维持体内蛋白质的稳定性，因此被命名为渗透剂[1,2]。
在另一个实例中，基因突变，蛋白的错误折叠常常导致蛋白的失活，从而导致机体生长的异常或某些细胞功能的异常。
实验已证明在某些小分子添加剂的存在时，这些失活蛋白质能够恢复正常功能，而且细胞能够生长正常。
由于小分子能够帮助蛋白质正确折叠，因此他们也被称为化学伴侣。
许多小分子添加剂都是渗透剂和化学伴侣。
包涵体蛋白复性的研究进展
包涵体蛋白复性的研究进展付明娟;林接玉(综述);谢捷明(审校)【摘要】Inclusion bodies are the inactive solid particles agglutinating by exogenous recombinant pro-tein in cells.After separation and washing to remove some pieces of membrane proteins or film,they can be dissolved by appropriate reagent,for example the buffer with high pH value and low concentration of urea, alcohol with different hydroxyl or denaturant containing small molecule .The renaturation efficiency traditional renaturation method such as dilution,dialysis is generally low.At present,we can improve refolding efficiency through high pressure, high throughput screening of zeolite and high-throughput screening combined with experimental design software.We wish to find an efficient renaturation method suitable for all recombinant proteins,so as to realize large-scale production of recombinant proteins which are difficult to obtain .%包涵体是指外源重组蛋白在细胞内凝集的无活性的固体颗粒。
包涵体蛋白体外复性的研究进展
包涵体蛋白体外复性的研究进展
方敏;黄华
【期刊名称】《生物工程学报》
【年(卷),期】2001(017)006
【摘要】外源基因在大肠杆菌中高水平表达时,通常会形成无活性的蛋白聚集体即包涵体.包涵体富含表达的重组蛋白,经分离、变性溶解后须再经过一个合适的复性过程实现变性蛋白的重折叠,才能够得到生物活性蛋白.近年来,发展了许多特异的策略和方法来从包涵体中复性重组蛋白.最近的进展包括固定化复性以及用一些低分子量的添加剂等来减少复性过程中蛋白质的聚集,提高活性蛋白的产率.
【总页数】5页(P608-612)
【作者】方敏;黄华
【作者单位】中国科学院遗传研究所,;中国科学院遗传研究所,
【正文语种】中文
【中图分类】Q51
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大肠杆菌表达的包涵体的纯化与复性研究
【实验技术】大肠杆菌表达的vMIP2Ⅱ包涵体的纯化与复性研究张少恩 孙晗笑 张光 杨清玲 沙文琼 刘俊云 龚莉桂【摘要】 目的 纯化、复性大肠杆菌表达的vMIP2Ⅱ包涵体蛋白。
方法 用8m olΠL尿素缓冲液变性溶解vMIP2Ⅱ包涵体,然后加入十二烷基磺酸钠(S DS)进一步促溶,利用金属亲和层析和分子筛层析纯化,再利用柱层析去除S DS,纯化后透析复性;通过荧光和单核淋巴细胞趋化抑制实验检测复性蛋白的结构和抑制单核淋巴细胞趋化的活性。
结果 重组vMIP2Ⅱ纯化和复性后,仍具有完整的高级结构和抑制单核细胞趋化的活性。
结论 已获得了重组vMIP2Ⅱ活性蛋白,为进一步研究应用奠定基础。
【关键词】 vMIP2Ⅱ包涵体;十二烷基磺酸钠;环氧糊精Purification and R enaturation of vMIP2ⅡI nclusion Body Expressed in E.coliZH ANG Shao2en,S UN Han2xiao,ZH ANG G uang,et al(Institute for G enomic Medicine,Jinan Univer sity,Guangzhou 510632,China)【Abstract】 Objective T o purify and re2naturalize the vMIP2Ⅱinclusion body protein expressed in E.coli.Methods The vMIP2Ⅱinclusion body expressed in E.coli was diss olved with8m olΠL urea,then further diss olved with S DS and purified by metal affinity chroma2 tography and m olecular sieve chromatography.Revm ove the S DS bound to protein m olecules by affinity column chromatography and re2naturalize the vMIP2Ⅱinclusion body by dialysis.Examine the structure of renaturalized protein by fluorometric assay and determine its activity by che2 m otaxis2inhibiting test of m ononuclear lymphocytes.R esults The recombinant vMIP2Ⅱwith intact higher2order structure was purified,re2natu2 ralized,and showed activity in inhibiting the chem otaxis of m ononuclear lymphocyte.Conclusion The recombinant vMIP2Ⅱprotein with activ2 ity was obtained.It laid a foundation of further application of the protein.【K ey w ords】 vMIP2Ⅱinclusion body;S DS;Cyclodextrins 病毒巨噬细胞炎症蛋白Ⅱ(Virus macrophage in2 flammation protein2Ⅱ,vMIP2Ⅱ)是由人疱疹病毒8编码的蛋白,全基因编码95个氨基酸,成熟蛋白为74个氨基酸,与人的MIP同源性高达41%,其中8种非极性氨基酸占40%,具有较强的疏水性[1]。
用层析法分离、复性包涵体
用层析法分离、复性包涵体谷振宇Jan-Christer Janson 苏志国中国科学院过程工程研究所摘要这里提出了一种用柱层析直接从Ecoli破碎原浆中分离纯化及复性包涵体的新方法。
将传统的离心分离一步凝胶过滤所取代。
分离的原则是选择合适的介质，使之仅排阻包涵体颗粒，而其它的组份都可以进入并穿过凝胶介质。
在新的复性方法中，逐步递减的变性剂(urea或Gu-HCl) 梯度与逐步递增的pH梯度相结合，通过凝胶过滤(排阻上限小于蛋白质分子量) 层析来进行复性。
溶解在高浓度变性剂及低pH中的变性样品，然后加入到梯度形成好的层析柱中。
在层析过程中，变性蛋白质的下行速度大约是变性剂下行速度的3 倍。
因此，变性蛋白会经过已经形成好的变性剂和pH梯度，并逐步脱除变性剂，逐步地升高pH，这样可以促进正确的折叠。
梯度的形状和程度，及流速都会影响复性率，而且可以针对不同蛋白质进行调节，以得到优化的条件。
我们在此实验中选择的目标蛋白质为大肠杆菌表达的scFv 融合蛋白包涵体。
Rudolph和Lile的综述已经对蛋白质的体外复性做详细的介绍[1]。
传统的分离、复性方法如：分步离心，稀释和透析通常很耗时且复性率低。
本文中介绍了以凝胶过滤为基础发展起来的分离及复性方法。
此方法的一个优势是变性剂的脱除，流速及pH的变化可以很容易的调节。
大肠杆菌表达的scFv 融合蛋白质包涵体。
ScFv 片段在Eocli 中表达量很高，但经常会形成包涵体。
因此需要进行复性。
材料与方法脲(urea )、DTT、PMSF、溶菌酶(lysozyme)、精氨酸(arginine)、Triton X-100和DNAse购于Sigma。
GSSG，GSH购于Roche。
Berol 185 购于Akzo Nobel 表面化学公司，Sweden。
所有层析介质均为Amersham Pharmacia Biotech公司产品。
其它试剂均为分析纯。
实验用水为Millipore 纯水系统生产。
基因重组蛋白包涵体的复性研究
蛋白质与介质的疏水 性相互结合
rhIFN-γ，rhIFN-β， 重组人粒细胞集落刺激因子rhGC-CSF
离子交换色谱 蛋白质与介质间存在 Papiloma virus(HPV)， E7MS2 fusion protein，
（IEC）
电荷作用力
重组白细胞分泌抑制因子rSLPI，抗原疫苗蛋白
亲和色谱 （AFC）
需要进行蛋白质翻译后修饰（如糖基化）就具有生物 活性的基因工程蛋白
基因重组蛋白包涵体的复性研究
51％
基因重组蛋白包涵体的复性研究
8.2 包涵体的形成
在大肠杆菌中表达的基因工程蛋白常常以包涵体的形式 沉积于细胞内，表现为无活性的不溶性聚集物
包涵体：外源目的基因在宿主系统中高水平表达时，因各 种原因导致基因表达产物的一级结构（即氨基酸序列）虽 然正确，而其高级结构是错误的，即：没有生物活性的包 涵体。包涵体直径约0.5-1μm，具有很高的密度（约1.3 mg/ml），相差显微镜下有折光性，呈非水溶性，只溶于高 浓度变性剂如尿素、盐酸胍等。
• 由于I向N转化是一个慢的过程，当蛋白质在此时放置较长 的一段时间，I就可以慢慢地向N转化
基因重组蛋白包涵体的复性研究
影响复性效率的因素
• 4）氧化还原环境
• 复性不仅要降低或去除变性剂，同时必须提供SH-氧化形 成S-S的环境→合适的氧化还原环境
• 采用配对的氧化型和还原型巯基物质 • 配对低分子量巯基试剂包括GSSG/GSH、半胱氨酸或巯基
基因重组蛋白包涵体的复性研究
包涵体形成的几种可能性
• 研究发现：低表达时很少形成包涵体，表达量越高越易形成包涵体。 • 1）少量蛋白产生时是可溶的，表达量过高，积聚量超过其在细胞
内溶解度时沉淀； • 2）合成速度太快，以至于没有足够的时间进行折叠，二硫键不能
包涵体蛋白的纯化及复性讨论专贴
包涵体蛋白的纯化及复性讨论专贴！zbbnet wrote:最近实验遇到了大麻烦，说出来大伙帮忙想想法。
实验所用菌株为BL21，载体pMAL-p2X，与MBP融合表达，目的蛋白有三对二硫键。
最初的设计思想是想通过MBP的信号肽实现可分泌表达，但实验发现主要是包涵体表达。
菌体超声破碎后12000rpm离心，所获得的沉淀不能很好的贴在离心管底，而是处于部分溶解状态，对沉淀再作如下处理：1、2M尿素洗涤，pH8.5，12000rpm离心，获得的上清不是澄清透明而是略显混浊，这次的沉淀能够牢固的贴在管底。
2、4M尿素洗涤，pH9.0，12000rpm离心，获得的上清不是澄清透明而是略显混浊，这次的沉淀为半溶状态的冻状物。
3、8M尿素溶解上述2中的沉淀，几乎不见不溶的颗粒，但溶液还是略显混浊。
上述三溶液取样电泳，均见较多的目的蛋白。
对3中的溶液取样调pH至12溶液依然混浊。
0.22um过滤，无法去除混浊物。
考虑到混浊物是多聚体，样品中加入1％SDS和0.2％β-Me，都无法改善。
做上述处理，主要考虑到混浊物是目的蛋白，因为目的蛋白设计了6HIS但不能成功的结合Ni柱。
主要想请教这样几个问题：1、有没有那位战友也碰上我上述的问题，这种问题是如何解决的？2、我所描述的包涵体的状态说明了什么问题？3、对与蛋白溶液混浊有什么好的处理方法？暂不讨论分泌表达的问题。
回答：1. 你的情况很正常，根据三次沉淀处理情况，应该可以肯定你的蛋白在8MUrea中是完全可以裂解的。
并且该蛋白如若作复性应该可溶性较佳。
但根据我个人的经验。
如果MBP融合蛋白还是以包含体表达的话是很没有意思的，建议作单独表达，除非单独表达不行。
否则即使完全复性，目的蛋白活性也大打折扣。
另可优化表达条件，有可能可容表达的，不要放弃，你的破菌上清也可以跑胶看看有没有目的蛋白。
2. 说明蛋白蔬水性不强。
3。
有些蛋白裂解后有浑浊非常正常，尤其是MBP融合的，即使做到可容也会有白乎乎浑浊的现象，只要不影响使用就行，没必要在意。
[原创]工程菌生产的蛋白包涵体的复性与纯化-秦
![[原创]工程菌生产的蛋白包涵体的复性与纯化-秦](https://img.taocdn.com/s3/m/b6184610ef06eff9aef8941ea76e58fafbb04554.png)
[原创]工程菌生产的蛋白包涵体的复性与纯化-秦第八章工程菌生产的蛋白包涵体的复性与纯化分子生物学的发展使蛋白质的表达和生产进入到一个新的时代。
大肠杆菌由于遗传背景清晰，容易培养，可以大规模发酵，以及大量可供选择利用的克隆和高效表达载体而成为目前人们克隆和表达外源基因的首选菌株。
但是，在实际操作中重组蛋白质在大肠杆菌中的高水平表达往往导致蛋白质聚集形成不溶性的包涵体。
包涵体的形成虽有不少优点，如可溶性形式存在的外源蛋白在细胞内容易受到蛋白酶的攻击，而包涵体形式存在的外源蛋白则不易被蛋白酶降解;包涵体的形成降低了细胞内外源蛋白的浓度，有利于表达量的提高;包涵体中杂蛋白含量较低，且只需要简单的低速离心就可以与可溶性蛋白分离，有利于分离纯化;包涵体对机械搅拌和超声破碎不敏感，易于破壁，并与细胞膜碎片分离等。
但是，无活性的包涵体蛋白质需经过复性使其折叠成为具有天然构象和生物活性的蛋白质，这通常是一件很困难的事情，而且不同的蛋白质其复性方法也各不相同，因此基因重组蛋白质的复性一直是生物工程下游纯化技术的研究热点之一。
现有的生物技术研究和产业化过程表明，重组蛋白包涵体的变性及复性是重组蛋白类药物生产中最为关键的技术之一，是基因工程产品商业化的瓶颈，也是一个世界性难题。
第一节包涵体形成的原因,(什么是包涵体所谓包涵体是指由于表达部位低电势及外源蛋白质分子的特殊结构(如Cys含量高)，如低电荷，无糖基化等，使得重组蛋白质与核酸，周围杂蛋白质(如核糖体元件、RNA聚合酶、内毒素、外膜蛋白质ompC、ompF和ompA等)，以及脂体、脂多糖等形成的聚合体(图8-1)。
包涵体一般大小为0.1~3.0 μm，具有很高的密度(约1.3 mg/ml)，无定形，呈非水溶性，只溶于尿素、盐酸胍等变性剂。
包涵体中重组蛋白质一般占包涵体总成分的50%以上，它们没有生物学活性，因为蛋白质分子没有形成正确的构象。
有报道表明成熟的分子相比包涵体内蛋白质含有更多的β结构而较少的,结构，也有报道表明包涵体中的肽链已获得与天然蛋白质分子非常接近的空间构象。