第2章 微生物的纯培养和显微技术
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第二章微生物的纯培养和显微技术
高压蒸气灭菌 高温干热灭菌 棉塞 超净工作台等
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•接种操 作
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二、用固体培养基分离纯培养
菌落：单个微生物在 适宜的固体培养基表 面或内部生长、繁殖 到一定程度可以形成 肉眼可见的、有一定 形态结构的子细胞生 长群体。
菌苔：当固体培养基 表面众多菌落连成一 片时，便成为菌苔。
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菌落
无菌水、梯度稀释、50℃左右的琼脂培养基、灭过菌 的培养皿。注意要稀释得当。
分离出单个菌落以后，重复上述操作数次，便可得到 纯培养。
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•稀释倒平板法
Pour plate
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涂布平板法
无菌水、梯度稀释 涂布平板
•Spread plate
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稀释倒平板法和涂布平板法
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平板划线分离法
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稀释摇管法
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第二节 显微镜和显微技术
显微镜的种类及原理 显微观察样品的制备
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一、显微镜的种类及原理
普通光学显微镜 暗视野显微镜 相差显微镜 荧光显微镜 透射电子显微镜 扫描电子显微镜 扫描隧道显微镜
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普通复式光学显微镜
普通生物显微镜由三部分构成： ➢ 照明系统：包括光源和聚光器。 ➢ 光学放大系统：由物镜和目镜组成，是显 微镜的主体，为了消除球差和色差，目镜 和物镜都由复杂的透镜组构成。 ➢ 机械装置：保证光学系统的准确配制，用 于固定材料和观察方便。
主要是指利用不同微生物间生命活动特点的不同，制定特定的环境条件 ，使仅适应于该条件的微生物旺盛生长，从而使其在群落中的数量大大 增加，人们能够更容易地从自然界中分离到所需的特定微生物。
富集条件：物理、化学和生物等。以从土壤中分离能降解酚类化合物对 羟基苯甲酸的微生物的实验为例。
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•接种操 作
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二、用固体培养基分离纯培养
菌落：单个微生物在 适宜的固体培养基表 面或内部生长、繁殖 到一定程度可以形成 肉眼可见的、有一定 形态结构的子细胞生 长群体。
菌苔：当固体培养基 表面众多菌落连成一 片时，便成为菌苔。
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菌落
无菌水、梯度稀释、50℃左右的琼脂培养基、灭过菌 的培养皿。注意要稀释得当。
分离出单个菌落以后，重复上述操作数次，便可得到 纯培养。
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•稀释倒平板法
Pour plate
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涂布平板法
无菌水、梯度稀释 涂布平板
•Spread plate
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稀释倒平板法和涂布平板法
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平板划线分离法
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稀释摇管法
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第二节 显微镜和显微技术
显微镜的种类及原理 显微观察样品的制备
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一、显微镜的种类及原理
普通光学显微镜 暗视野显微镜 相差显微镜 荧光显微镜 透射电子显微镜 扫描电子显微镜 扫描隧道显微镜
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普通复式光学显微镜
普通生物显微镜由三部分构成： ➢ 照明系统：包括光源和聚光器。 ➢ 光学放大系统：由物镜和目镜组成，是显 微镜的主体，为了消除球差和色差，目镜 和物镜都由复杂的透镜组构成。 ➢ 机械装置：保证光学系统的准确配制，用 于固定材料和观察方便。
主要是指利用不同微生物间生命活动特点的不同，制定特定的环境条件 ，使仅适应于该条件的微生物旺盛生长，从而使其在群落中的数量大大 增加，人们能够更容易地从自然界中分离到所需的特定微生物。
富集条件：物理、化学和生物等。以从土壤中分离能降解酚类化合物对 羟基苯甲酸的微生物的实验为例。
微生物学：第2章 微生物的纯培养和显微技术
第一节 微生物的分离和纯培养
分离：从混杂的群体中分离特定的某一种微生物， 是研究和利用微生物的第一步。
一、无菌技术（aseptic technique）
在分离、转接及培养纯培养时防止其被其他微生物 污染，其自身也不污染操作环境的技术（P14）。 器具: 用于分离、培养微生物的器具事先不含任何微生物； 操作过程：在转接、培养微生物时防止其它微生物的污染；
1、微生物培养的常用器具及其灭菌
1、微生物培养的常用器具及其灭菌
常用的器具： 试管、瓶子、培养皿等
1887年，R J Petri 发明
Petri dish
1、微生物培养的常用器具及其灭菌
常用的器具： 试管、瓶子、培养皿等
常用的灭菌方法： 高压蒸汽灭菌 高温干热灭菌
2、接种操作
无菌操作： 火焰附近（酒精灯、煤气灯）进行
二、用固体培养基分离纯培养
菌落（colony）： 单个（或聚集在一起的一团）微生物在适宜的固体
培养基表面或内部生长、繁殖到一定程度可以形成肉眼 可见的、 有一定形态结构的子细胞生长群体。
众多菌落连成一片
菌苔（lawn）
不同微生物在特定培养基上生长形成的菌落或菌苔一般 都具有稳定的特征（形状、颜色等），可以成为对该微 生物进行分类、鉴定的重要依据（见P15 图2-3）。
使待分离的微生物生长“突出”；
直接挑取待分离的微生物的菌落获得纯培养。
五、选择培养分离
1. 利用选择平板进行直接分离
高温下培养：分离嗜热细菌； 培养基中不含N：分离固氮菌； 培养基加抗生素：分离抗性菌；
1）待分离的微生物生长，其它微生物的生长被抑制
五、选择培养分离
1. 利用选择平板进行直接分离
第二章微生物的纯培养和显微技术
第二章微生物的纯培养和显微技术第二章微生物的纯培养和显微技术第一节微生物的分离和纯培养一、无菌技术在分离、转接及培养纯培养物时防止被其他微生物污染，其自身也不污染操作环境的技术被称为无菌技术。
1、微生物培养的常用器具及其灭菌（1）试管、玻璃烧瓶、培养皿。
（2）高压蒸汽灭菌，杀灭所有的微生物，包括休眠体，同时可保持培养基的营养成分不被破坏。
（3）高温干热灭菌。
2、接种操作无菌条件下，用接种环在火焰附近进行操作，或在无菌操作箱或操作室内进行。
二、用固体培养基获得纯培养1、菌落：分散的微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长、繁殖到一定程度可以形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞生长群体。
菌苔：当固体培养基表面众多菌落连成一片时，便成为菌苔。
2、涂布平板法3、稀释倒平板法4、平板划线法5、稀释摇管法对氧气更加敏感的厌氧型微生物。
先将一系列盛无菌琼脂培养基的试管加热，使琼脂融化后冷却，将微生物进行梯度稀释，冷凝后，在琼脂表面倒一层灭菌液体石蜡和固体石蜡的混合物，将培养基隔开。
三、用液体培养基获得纯培养对一些个体大的细菌、许多原生动物、藻类。
稀释法。
接种物在液体培养基中进行顺序稀释，以得到高度稀释的效果，使一支试管中分配不到一个微生物。
经稀释后的大多数试管中没有微生物生长，那么有微生物生长的试管得到的培养物可能就是纯培养物。
只能分离出混杂微生物群体中占数量优势的种类。
四、单细胞（孢子）分离采用显微分离法从混杂群体中直接分离单个细胞或单个个体进行培养以获得纯培养，称为单细胞（单孢子）分离法。
较大的微生物较容易，个体较小的较难。
对较大微生物，用毛细管提取个体，在低倍显微镜下操作；对较小微生物，采用显微操作仪。
五、选择培养根据该微生物的特点，包括营养、生理、生长条件等，采用选择培养分离的方法，或抑制大多数其他微生物生长，或造成有利于该菌生长的环境，培养一段时间后，通过平板稀释等方法进行纯培养分离。
1、选择平板培养2、富集培养制定特定的环境，使仅适应于该条件的微生物生长。
第二章 微生物的纯培养和显微技术
S光滑型菌落 光滑型菌落 R粗糙型菌落 粗糙型菌落
M粘液型菌落 粘液型菌落
菌落类型
粘稠、有光泽、 粘稠、有光泽、似水 珠样， 珠样，多见有厚荚膜 或丰富粘液层的细菌
培养平板： 培养平板：用于获得微生物纯培 养的常用的固体培养基形式， 养的常用的固体培养基形式，它是 冷却凝固后的固体培养基在无菌培 养皿中形成的培养基固体平面， 养皿中形成的培养基固体平面，常 称为平板。 称为；
厌氧微生物分离方法
①物理方法 抽气法——将培养物置真空干燥器中抽真空， 将培养物置真空干燥器中抽真空， A、抽气法 将培养物置真空干燥器中抽真空 再培养。 再培养。 充气法——把培养物放一密闭贮器中充入N2 把培养物放一密闭贮器中充入N B、充气法 把培养物放一密闭贮器中充入 排尽空气） （排尽空气） ②化学方法 化学吸氧法——利用化学反应耗氧达到形成厌 A、化学吸氧法 利用化学反应耗氧达到形成厌 氧环境的目的。 氧环境的目的。 用焦性没食子酸（1g） NaOH（10%） ⑴用焦性没食子酸（1g）与NaOH（10%）反应除氧 100ml空气中的O2） 空气中的O2 （100ml空气中的O2）
Plate） 2、平板划线分离法（Streak Plate） 平板划线分离法（
特点：快速、方便。 特点：快速、方便。 浓度较大的样品 分区划线（适用于浓度较大的样品） 分区划线（适用于浓度较大的样品） 连续划线（适用于浓度较小的样品） 浓度较小的样品 连续划线（适用于浓度较小的样品）
划线分离后平板上显示的 菌落照片（右图） 菌落照片（右图）
一、无菌技术
一、无菌技术 分离—— ——把自然界中以混杂状态生长在一起的 分离——把自然界中以混杂状态生长在一起的 各类微生物单个分开。 各类微生物单个分开。 筛选—— ——根据菌种的形态特征和生理特征的不 筛选——根据菌种的形态特征和生理特征的不 同结合生产实际的要求，灵活地、 同结合生产实际的要求，灵活地、有的放矢 地设计出各种优选方法以便快速而准确地挑 地设计出各种优选方法以便快速而准确地挑 选出所需要的菌种。 选出所需要的菌种。 无菌技术：在分离、 1、无菌技术：在分离、转接及培养纯微生物 时防止其被其它微生物污染， 时防止其被其它微生物污染，其自身也不污 染操作环境的技术。 染操作环境的技术。
第二章 微生物的纯培养与显微技术
4、稀释摇管法（dilution shake culture method）
四 、液体培养基分离纯培养
1、原因
不是所有的微生物都能在固体培养基上生 长 。例如：许多原生动物、藻类、大细胞细菌 等。
2、方法
稀释法 （必须在同一个稀释度的许多平行试 管中，应超过95%表现为不生长）
五、单细胞（孢子）分离
有性繁殖：细菌结合
conjugation
2、放线菌
1）菌丝形态： 营养菌丝、气生菌丝和孢子丝（鉴定指标）
Chain of conidiospores
Aerial hyphae
Agar surface
Substrate mycelium
孢子丝不同形态
3、古生菌
古生菌与细菌具有类似的个体形态，但它们多生活 于一些生存条件十分恶劣的极端环境中，例如高温、 高盐、高酸等 。
直接采取显微分离法从混杂群体中 直接分离单个细胞或单个个体进行培 养以获得纯培养。
六、选择培养分离
（一）原因：
1、单一培养不能满足所有微生物生长。 2、微生物对培养条件的选择。 3、微生物对营养的竟争。
（二）分离方法 1、利用选择平板进行直接分离
依据：利用微生物自身特点选择分离条件，如 耐高温、产特殊酶类等。
高压蒸汽灭菌锅
超净工作台
三、固体培养基分离纯培养
（一）相关概念
1、菌落（colony） ：单个微生物在
适宜的固体培养基表面或内部生长、繁 殖到一定程度可以形成肉眼可见的、有 一定形态结构的子细胞生长群体 。
2、菌苔（lawn） ：当固体培养基表
面众多菌落连成一片时，便成为菌苔 。
细菌菌落形态
（二）微生物分离的手段
第二章微生物的纯培养和显微技术
▲ 子实体
大
侧
型
耳
真
菌
（2）霉菌的形态
分枝或不分枝。管状。
在固体培养基上 营养菌丝：部分菌丝伸入培养基
内吸收养料。
气生菌丝：菌丝伸入空中生长 繁殖菌丝：由气生菌丝发育到一
定阶段分化而成。
（3）与人类的关系
人类实践活动中最早认识和利用的一类微生物。
■制曲、酿酱等发酵食品 ■发酵工业：生产酒精、柠檬酸、酶制剂 ■农业：饲料发酵、生产赤霉素、杀虫农药、除草剂 ■堆肥腐熟 ■引起农副产品、衣物、食品、器材发霉 ■引起动植物体病害：黄曲霉
单细胞
三种基本形态
球状菌 杆状菌 螺旋状菌
弧菌 螺菌
（1） 球状菌
球状或扁圆状
单球菌（尿微球菌） 双球菌（肺炎双球菌） 链球菌（乳酸链球菌） 四联球菌（四联细球菌） 八叠球菌（尿素八叠球菌）
葡萄球菌（金黄葡萄球菌）
▲单球菌
分裂后的细胞分散而单 独存在的球菌. 如尿素微球菌 (Micrococcus ureae
小单胞菌属
形态：只有基质菌丝，上生孢子梗，顶生一 个孢子。
特性：产庆大霉素 繁殖：孢子生殖
弗兰克氏菌属
赤
杨
形态特性：共生菌。与 非豆科木本植物根形成 根瘤。固氮。不易人工
形 成 根 瘤
根 与 弗 兰 克
培养。
氏 菌
繁殖：孢囊孢子生殖。
放线菌属于细菌，在防病治病、工农业生产中 有特殊重要性。
粮食、食物、用具、器材。耐较酸环境。
二 真核微生物的个体形态
1 霉菌（mold） 2 酵母菌（Yeast） 3 大型真菌 4 藻类（Algae） 5 原生动物（Prokaryote）
1 霉菌（mold）
第二章微生物的纯培养和显微摄影技术
数值孔径最大值为1.4，这个数值在理论 上和技术上都达到了极限
数值孔径与其他技术参数有着密切 的关系，它几乎决定和影响着其他各项 技术参数。它与分辨率成正比，与放大 率成正比，与焦深成反比，NA值增大， 视场宽度与工作距离都会相应地变小
二． 分辨率 辨率又称“鉴别率”，“解想力”。是 衡量显微镜性能的又一个重要技术参数。
最经典的复式显微镜:Zeiss实验 室显微镜这种显微镜与我们今天所使 用的一些普通显微镜一模一样.事实上, 我们现在所使用的一些普通型显微镜 的结构都是以它为模板的，由于这种 显微镜性能好,价格低廉(在中国都只卖 400多元,而好的显微镜的价格都在几千 到几万元),所以在一上市的时候就得到 了人的青睐,很快占领了各大实验室和 医院等地方.成为至今为止最畅销的复 式显微镜,为科学的发展作出了巨大贡 献.
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1、稀释倒平皿法
首先把微生物悬液通过一系列稀释， 取一定量的稀释液与熔化好的保持在 40~50°左右的营养琼脂培养基充分混 合，然后把这混合液倾注到无菌的培养 皿中，待凝固之后，把这平板倒置在恒 箱中培养。单一细胞经过多次增殖后形 成一个菌落，取单个菌落制成悬液，重 复上述步骤数次，便可得到纯培养物。
(1) 接种 灭菌
(2) 开启棉 塞
(3)管口灭菌
(4)挑起菌苔
(5) 接种
(6)塞好 棉塞
然后，将接种环从柄部至环端逐渐通过 火焰灭菌，复原。不要直接烧环，以免 残留在接种环上的菌体爆溅而污染空间。 平板接种时，通常把平板的面倾斜，把 培养皿的盖打开一小部分进行接种。在 向培养皿内倒培养基或接种时，试管口 或瓶壁外面不要接触底皿边，试管或瓶 口应倾斜一下在火焰上通过。
放大率也是显微镜的重要参数，但也不 能盲目相信放大率越高越好，在选择时 应首先考虑物镜的数值孔径。
第二章微生物的纯培养与显微技术
生 物 安 全 柜
(二） 用固体培养基分离纯培养
1. 稀释倒平板法 2. 涂布平板法 3. 平板划线分离法 4. 稀释摇管法——厌氧微生物的分离
1. 稀释倒平板法
2. 涂布平板法
将已熔化的培养基倒入无菌平皿，制 成无菌平板，冷却凝固后，将一定量的某 一稀释度的样品悬液滴加在平板表面，再 用无菌玻璃涂棒将菌液均匀分散至整个平 板表面，经培养后挑取单个菌落。
3. 载物台
• 镜臂下端安装的一个向前伸出的平面台叫 做载物台。 • 用于放置观察用的玻片标本，载物台中央 有一圆孔，叫通光孔。 • 通光孔左右两旁一般装有一对弹簧夹，为 固定玻片之用，有的装有移片器，可使玻 片前后左右移动。
镜筒与物镜转换器
• 4. 镜筒：安装在镜臂上端的圆筒叫做镜筒， 上端安装目镜，下端连接转换器。 • 5. 物镜转换器：镜筒下端的一个能转动的 圆盘叫做转换器。 • 其上可以安装几个接物镜，观察时便于调 换不同倍数的镜头。
参考网站
食品伙伴网 食品伙伴网
http://202.116.45.198/wswx/couse
1.目镜：
• 由二、三片透镜组成，安装在镜筒上端， 也叫接目镜。 • 在目镜上方刻有5×、10×、20×等为放大 倍数。 • 从外表上看，镜头越长放大倍数越低。
2.物镜：
• 由数组透镜组成，安装在转换器上，又称接物镜 • 每台显微镜上常备有几个不同倍数的物镜，物镜 上所刻8×、10×、20 ×、40×等就是放大倍 数，习惯上把10－20倍的叫做低倍物镜；40－ 60倍的叫做高倍物镜；90－100倍的叫做油镜。 • 从形态上看，接物镜越长，放大倍数越高。 • 显微镜的放大倍数，粗略计算方法为接目镜放大 倍数与接物镜放大倍数的乘积。 • 如观察时所用物镜为40×、目镜为10×，则物 体放大倍数为40×10＝400倍。
第二章_微生物的纯培养和显微技术——沈萍
菌种保藏原理：用人工方法降低微生物的代谢强度，限制微生 物的生长和繁殖，使其处于休眠状态。
要求：菌种不死，不污染，不变异
第一节 微生物的分离和纯培养
七、微生物的保藏技术
菌种保藏方法
1、传代培养保藏——隔绝空气低温保藏琼脂斜面、半固 体等，橡皮塞封口或用石蜡覆盖，并放置低温保存。
4℃保存。
2、冷冻保藏——保护剂+菌种——零下196度速冻保存， 或-70度冷冻室保存，-20~-30度普通冰箱冷冻室保存。 3、干燥保藏——砂土管保存法和冷冻真空干燥保藏法
单细胞分离法的难度与细胞或个体的大小成反比。个体较大的 可在低倍显微镜下进行，个体较小的则需采用显微操作仪。
第一节 微生物的分离和纯培养
五、选择培养分离
1.
稀释法缺点
分离的优势菌
利用选择培养基直接分离→劣势菌
当某一种微生物所存在的数量与其他微生物相比非常少时，
单采用一般的平板稀释方法几乎是不可能分离到该种微生
接种物在液体培养基中顺序高度稀释后，同一个稀释度的平
行试管中大多数（>95％）表现不生长，那么有微生物的可能 是纯培养，否则可能性下降。
第一节 微生物的分离和纯培养
四、单细胞（单孢子）显微分离
稀释法缺点
分离的优势菌
采取显微分离法从混杂群体中直接分离单个细胞或单个 个体进行培养以获得纯培养
显微操作仪，专业程度高
一. 无菌技术 第二节 显微镜和显微技术
二. 用固体培养基获得纯培养 第三节 显微镜下的微生物 三. 用液体培养基获得纯培养 四. 单细胞（孢子）分离 五. 选择培养 六. 微生物的保藏技术
第一节 微生物的分离和纯培养
一、无菌技术
第二章微生物的纯培养和显微镜技术
第二章微生物的纯培养和显微镜技术2．纯培养和显微技术一、纯培养技术1、无菌技术包括两方面的内容：（1）用于分离、培养微生物的器具事先不含任何微生物；(2)在转接、培养微生物时防止其它微生物的污染，其自身也不污染环境；2、分离纯化技术（1）固体培养基分离纯培养技术微生物个体微小，常以群体混合状态存在，将单个细胞从群体中分离出来，即纯培养。
菌落：单个（或聚集在一起的一团）微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长、繁殖到一定程度可以形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞生长群体。
菌苔：众多菌落连成一片。
获得纯培养的方法有：倾注平板法：操作较麻烦，对好氧菌、热敏感菌效果不好！涂布平板法：使用较多的常规方法，但有时涂布不均匀！平板划线法：厌氧微生物的分离：（2）液体培养基分离纯培养稀释法进行液体分离必须在同一个稀释度的许多平行试管中，大多数（一般应超过95%）表现为不生长。
（3）选择培养分离：抑制大多数其它微生物的生长；使待分离的微生物生长更快；使待分离的微生物在群落中的数量上升，方便用稀释法对其进行纯化。
使待分离的微生物生长“突出”；直接挑取待分离的微生物的菌落获得纯培养。
3、单细胞分离技术用显微操作仪，在显微镜下进行。
难度与细胞或个体的大小成反比，局限于高度专业化的科学研究中。
4、选择培养分离选择平板：抑制大多数微生物不能生长，或具区别特征的直观结果。
富集培养：造成有利于某种菌生长的环境。
（1）利用选择平板进行直接分离高温培养分离嗜热菌，培养基中不含有N，分离固氮菌；培养基中含有抗生素分离抗生菌。
牛奶培养基分离产蛋白酶菌株。
（2）富集培养利用不同微生物之间的生长特性不同，制定特定的环境条件，使仅适合条件的微生物旺盛生长，从而使其在为生物群落中的比率大大增大，易于从群落中间将墓地君主分离出来。
5、二元培养物培养物中只含有二种微生物，而且有意识地保持二者之间的特定关系的培养物。
如病毒与宿主；蛭弧菌与和E.coli.6、微生物的保藏技术影响微生物菌种稳定性的因素：a. 变异；b. 污染；c. 死亡基本要求：在一定时间内使菌株不死，、不变、不乱基本方法生活态：培养基传代培养（斜面、平板、半固体），多见于冰箱4℃培养。
微生物的纯培养和显微技术
6.二元培养物
只含有两种微生物，且有意识保持二者之间关系的培养物， 这是具有寄生、共生关系微生物的最有效保存途径。
选择培养基分离法
1 ml
1.dilute sample
9 ml
10
100 1000 104 105
106
107
高氏培养基 土豆培养基 牛肉膏培养基
7.微生物保藏技术
微生物纯培养物必须通过各种保藏技术使其在一定时间内 不死亡、不被污染、不变异、生物学性状不丢失，以保证微生 物学研究及应用工作顺利进行，因而微生物保藏技术也是保护 微生物资源的一项重要基础工作。
(1）菌种保藏技术的原理：根据微生物生理、生化特点，人 工创造条件，是微生物的代谢处于不活泼，生长繁殖受抑制的 休眠状态；主要三个条件是：低温、干燥和缺氧。
（2）保藏方法 ①传代培养保藏：斜面，半固体穿刺，液体等，可密封后冷 藏。
②沙土保藏：霉菌孢子及产芽孢细菌。
③真空冷冻干燥法保藏
④冷冻法：低温冷冻（-20℃），超低温，液氮；液体培养 物中常加15%左右甘油，速冻后保藏。
日本大阪发酵研究所(IFO)
斜面低温保藏法－－常用保藏法
• 将菌种接种在适宜的斜面培养基上，待菌种生长完全 后，置于4℃左右的冰箱中保藏，每隔一定时间（保藏 期）再转接至新的斜面培养基上，生长后继续保藏， 如此连续不断。 此法广泛适用于各大类微生物菌种的短期保藏
此法的主要保藏措施是低温。一般可保存1～6个月左右。
培养平板（culture plate，也称平板或平皿）：溶化的培 养基倒入无菌空平皿中，冷却凝固后盛有培养基的平皿。
（1）涂布平板法（Spread plate method） 适于大多数好氧微生物。
（2）稀释倒平皿法（Pour plate method）
只含有两种微生物，且有意识保持二者之间关系的培养物， 这是具有寄生、共生关系微生物的最有效保存途径。
选择培养基分离法
1 ml
1.dilute sample
9 ml
10
100 1000 104 105
106
107
高氏培养基 土豆培养基 牛肉膏培养基
7.微生物保藏技术
微生物纯培养物必须通过各种保藏技术使其在一定时间内 不死亡、不被污染、不变异、生物学性状不丢失，以保证微生 物学研究及应用工作顺利进行，因而微生物保藏技术也是保护 微生物资源的一项重要基础工作。
(1）菌种保藏技术的原理：根据微生物生理、生化特点，人 工创造条件，是微生物的代谢处于不活泼，生长繁殖受抑制的 休眠状态；主要三个条件是：低温、干燥和缺氧。
（2）保藏方法 ①传代培养保藏：斜面，半固体穿刺，液体等，可密封后冷 藏。
②沙土保藏：霉菌孢子及产芽孢细菌。
③真空冷冻干燥法保藏
④冷冻法：低温冷冻（-20℃），超低温，液氮；液体培养 物中常加15%左右甘油，速冻后保藏。
日本大阪发酵研究所(IFO)
斜面低温保藏法－－常用保藏法
• 将菌种接种在适宜的斜面培养基上，待菌种生长完全 后，置于4℃左右的冰箱中保藏，每隔一定时间（保藏 期）再转接至新的斜面培养基上，生长后继续保藏， 如此连续不断。 此法广泛适用于各大类微生物菌种的短期保藏
此法的主要保藏措施是低温。一般可保存1～6个月左右。
培养平板（culture plate，也称平板或平皿）：溶化的培 养基倒入无菌空平皿中，冷却凝固后盛有培养基的平皿。
（1）涂布平板法（Spread plate method） 适于大多数好氧微生物。
（2）稀释倒平皿法（Pour plate method）
第二章微生物的纯培养和显微技术
以抑制非需要菌的生长，促进需要菌的生 长，这种培养基叫选择培养基。 • 高氏一号培养基加10%酚数滴，抑制其它 菌的生 长，分离出放线菌 • 马丁氏培养基加链霉素以抑制其它菌生长， 分离出真菌。
33
蛋白酶产生菌的分离
34
具有氨苄青霉素抗性 的大肠杆菌
35
五、选择培养分离
5·2 富集培养：不同微生物间的有不同特点，根据这些特点 制定特定的环境条件，使需要的微生物生长旺盛，数量增 加，从而更容易分离到该微生物。
（3）无菌技术：在分离、转接及培养纯培养物时防止 其被其它微生物污染的技术称为无菌技术。
3
一、无菌技术
1·1微生物培养的常用器具及灭菌 • 常用器具：试管、玻璃烧瓶、平皿等
注：所有器皿使用前都要灭菌！ • 培养基：培养微生物营养物质。
注：配制好后要及时灭菌。 • 常用的灭菌方法：高压蒸汽灭菌、
干热灭菌
待分离的微生物生长，其它微生物的生长被抑制
31
五、选择培养分离
1. 利用选择平板进行直接分离
牛奶平板：分离蛋白酶产生菌； 颜色反应：分离特定的菌株； 利用特定细菌的滑动特点进行
分离纯化；
待分离的微生物的生长特征明显不同于其它微生物
32
5·1用选择培养基进行直接分离 选择培养基：在培养基中加入某种化学物质，
群体。
28
五、选择培养分离 选择培养分离：根据微生物的营养、生理、 生长条件等特点，通过选择培养进行微生物 的分离与纯化技术。
29
五、选择培养分离
微生物群落中数量占少数的微生物的分离纯化：
抑制大多数其它微生物的生长； 使待分离的微生物生长更快；
使待分离的微生物在群落中的数量上升， 方便用稀释法对其进行纯化。
33
蛋白酶产生菌的分离
34
具有氨苄青霉素抗性 的大肠杆菌
35
五、选择培养分离
5·2 富集培养：不同微生物间的有不同特点，根据这些特点 制定特定的环境条件，使需要的微生物生长旺盛，数量增 加，从而更容易分离到该微生物。
（3）无菌技术：在分离、转接及培养纯培养物时防止 其被其它微生物污染的技术称为无菌技术。
3
一、无菌技术
1·1微生物培养的常用器具及灭菌 • 常用器具：试管、玻璃烧瓶、平皿等
注：所有器皿使用前都要灭菌！ • 培养基：培养微生物营养物质。
注：配制好后要及时灭菌。 • 常用的灭菌方法：高压蒸汽灭菌、
干热灭菌
待分离的微生物生长，其它微生物的生长被抑制
31
五、选择培养分离
1. 利用选择平板进行直接分离
牛奶平板：分离蛋白酶产生菌； 颜色反应：分离特定的菌株； 利用特定细菌的滑动特点进行
分离纯化；
待分离的微生物的生长特征明显不同于其它微生物
32
5·1用选择培养基进行直接分离 选择培养基：在培养基中加入某种化学物质，
群体。
28
五、选择培养分离 选择培养分离：根据微生物的营养、生理、 生长条件等特点，通过选择培养进行微生物 的分离与纯化技术。
29
五、选择培养分离
微生物群落中数量占少数的微生物的分离纯化：
抑制大多数其它微生物的生长； 使待分离的微生物生长更快；
使待分离的微生物在群落中的数量上升， 方便用稀释法对其进行纯化。
第二章微生物的纯培养和显微技术
片时,便成为菌苔(lawn)。
菌落
大家应该也有点累了，稍作休息
大家有疑问的，可以询问和交流
9
目前实验室常用固体培养基获得微生物 纯培养物得几种方法:
1、涂布平板法(spread plate method) 2、稀释倒平板法(pour plate method,50℃左右) 3、平板划线法(streak plate method)(如四区划线) 4、稀释摇管法(shake tube method)
除了放大外,决定显微观察效果得还有两个重要 因素,分辨率和反差。分辨率就是指能辨别两点之间 最小距离得能力,而反差就是指样品区别于背景得程 度,她们与显微镜得自身特点有关,也取决于进行显 微观察时对显微镜得正确使用以及良好得标本制作 和观察技术,这就就是显微技术。
现代显微技术不仅仅就是观察物体得形 态、结构,而且发展到对物体得组成成分得定 性和定量,特别就是与计算机技术结合出现得 图像分析、模拟仿真等技术,为探索微生物得 奥秘提供了强大武器。
2、古生菌
与细菌类似得个体形态,但多生活于一 些生存条件十分恶劣得极端环境中,如高盐、 高温、高酸等。如“121株”能在121℃得 条件下繁殖。
3、原核生物得细胞大小
• 细菌大小量度单位:微米(μm) • 亚细胞构造得量度单位:纳米(nm) • 常见细菌得大小:
球菌:直径 0、5~1、0μm 杆菌:宽×长 0、5~1、0×1、0~5、 0μm 螺形菌:宽×长 0、5~1、0×1、 0~50μm
菌种保藏就就是根据菌种特性及保藏目得得不 同,给微生物菌株以特定得条件,使其存活而得以延 续。
保藏得方法: 传代培养保藏 4℃ 冷冻保藏 -196℃,-70℃,-30～-20℃ 干燥保藏法 沙土管,安瓿管(冷冻真
菌落
大家应该也有点累了，稍作休息
大家有疑问的，可以询问和交流
9
目前实验室常用固体培养基获得微生物 纯培养物得几种方法:
1、涂布平板法(spread plate method) 2、稀释倒平板法(pour plate method,50℃左右) 3、平板划线法(streak plate method)(如四区划线) 4、稀释摇管法(shake tube method)
除了放大外,决定显微观察效果得还有两个重要 因素,分辨率和反差。分辨率就是指能辨别两点之间 最小距离得能力,而反差就是指样品区别于背景得程 度,她们与显微镜得自身特点有关,也取决于进行显 微观察时对显微镜得正确使用以及良好得标本制作 和观察技术,这就就是显微技术。
现代显微技术不仅仅就是观察物体得形 态、结构,而且发展到对物体得组成成分得定 性和定量,特别就是与计算机技术结合出现得 图像分析、模拟仿真等技术,为探索微生物得 奥秘提供了强大武器。
2、古生菌
与细菌类似得个体形态,但多生活于一 些生存条件十分恶劣得极端环境中,如高盐、 高温、高酸等。如“121株”能在121℃得 条件下繁殖。
3、原核生物得细胞大小
• 细菌大小量度单位:微米(μm) • 亚细胞构造得量度单位:纳米(nm) • 常见细菌得大小:
球菌:直径 0、5~1、0μm 杆菌:宽×长 0、5~1、0×1、0~5、 0μm 螺形菌:宽×长 0、5~1、0×1、 0~50μm
菌种保藏就就是根据菌种特性及保藏目得得不 同,给微生物菌株以特定得条件,使其存活而得以延 续。
保藏得方法: 传代培养保藏 4℃ 冷冻保藏 -196℃,-70℃,-30～-20℃ 干燥保藏法 沙土管,安瓿管(冷冻真
第二章 微生物的纯培养和显微技术 第一节 微生物的分离和纯培养
单细胞（单孢子）分离法：
• 采用显微分离法从混杂群体中直接分离单 个细胞或单个个体进行培养以得到纯培养， 称为单细胞（单孢子）分离法。
• 单细胞分离法的难度与细胞或个体的大小 成反比，较大的微生物如藻类、原生动物 较容易，个体很小的细菌则较难。
较大的微生物：可使用毛细管提取单个个 体，并在大量的灭菌培养基中转移清洗几 次，除去较小微生物的污染。这项操作可 在低倍显微镜下进行。 个体较小的微生物：需采用显微操作仪， 在显微镜下进行。
六、二元培养物
纯培养物:只有一种微生物的培养物称为纯培养 物。 混合培养物:含有两种以上微生物的培养物称为 混合培养物。
二元培养物:如果培养物中只含有两种微生物，
而且是有意识的保持两者之间的特定关系的培 养物称为二元培养物。
例如病毒－－宿主，原生动物－－细小微生物
微生物纯培养分离方法的比较
方法
涂布平板法（spread plate method)
1、微生物悬液适当稀释 2、稀释液放置在无菌的已经凝固的营养琼 脂平板上 3、用无菌的玻璃刮刀把稀释液均匀地涂布 在培养基表面上 4、恒温培养
涂布平板法 稀释倒平板法
平板划线法（streak plate method）
用无菌的接种环以无菌操作沾取少许待分离 的培养物，在无菌的平板表面上进行划线。 划线的方法很多，常见的比较容易出现单个 菌落的划线方法有扇形划线、连续划线、方 格划线、放射划线、四格划线等。
如果经稀释后的大多数试管中没有微生物 生长，那么有微生物生长的试管得到的培 养物可能就是纯培养物。如果经稀释后的 试管中有微生物生长的比例提高了，得到 的纯培养物的概率就会急剧下降。 因此，采用稀释法进行液体分离，必须在 同一个稀释度的许多平行试管中，大多数 （一般应超过95%）表现为不生长。
• 采用显微分离法从混杂群体中直接分离单 个细胞或单个个体进行培养以得到纯培养， 称为单细胞（单孢子）分离法。
• 单细胞分离法的难度与细胞或个体的大小 成反比，较大的微生物如藻类、原生动物 较容易，个体很小的细菌则较难。
较大的微生物：可使用毛细管提取单个个 体，并在大量的灭菌培养基中转移清洗几 次，除去较小微生物的污染。这项操作可 在低倍显微镜下进行。 个体较小的微生物：需采用显微操作仪， 在显微镜下进行。
六、二元培养物
纯培养物:只有一种微生物的培养物称为纯培养 物。 混合培养物:含有两种以上微生物的培养物称为 混合培养物。
二元培养物:如果培养物中只含有两种微生物，
而且是有意识的保持两者之间的特定关系的培 养物称为二元培养物。
例如病毒－－宿主，原生动物－－细小微生物
微生物纯培养分离方法的比较
方法
涂布平板法（spread plate method)
1、微生物悬液适当稀释 2、稀释液放置在无菌的已经凝固的营养琼 脂平板上 3、用无菌的玻璃刮刀把稀释液均匀地涂布 在培养基表面上 4、恒温培养
涂布平板法 稀释倒平板法
平板划线法（streak plate method）
用无菌的接种环以无菌操作沾取少许待分离 的培养物，在无菌的平板表面上进行划线。 划线的方法很多，常见的比较容易出现单个 菌落的划线方法有扇形划线、连续划线、方 格划线、放射划线、四格划线等。
如果经稀释后的大多数试管中没有微生物 生长，那么有微生物生长的试管得到的培 养物可能就是纯培养物。如果经稀释后的 试管中有微生物生长的比例提高了，得到 的纯培养物的概率就会急剧下降。 因此，采用稀释法进行液体分离，必须在 同一个稀释度的许多平行试管中，大多数 （一般应超过95%）表现为不生长。
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1.传代保藏
• 优点：使用方便，成本低 • 缺点：操作繁琐，易污染，易变异。
2. 冷冻保藏
• 低温冰箱保存 • 液氮保存
3. 干燥保存
• 沙土管保存 • 冷冻真空保藏
沙土管的制作
菌种保藏机构
什么是菌落？
单个微生物细胞在适宜的固体培养基表面或内部生长、繁殖到一定程度形成肉眼 可见、有一定形态结构的字细胞生长群体。
什么是菌苔？
固体菌落培养基表面众多菌落连成一片时所形成的微生物生长群体。
什么是纯培养？
由一种微生物组成的细胞群体，通常是由一个单细胞生长、繁殖所形成。
培养皿
三角瓶/锥形瓶
接种环
超净台
高压蒸汽灭菌锅
第二节 显微镜和显微技术
• 一、 显微镜的种类及原理 • 二、 显微观察样品的制备
一、 显微镜的种类及原理
液体菌种的接种
二、 用固体培养基分离纯培养
• 培养物（culture）：在微生物学中，在人为规定的条件下 培养、繁殖得到的微生物群体。 • 纯培养（pure culture）：只有一种微生物的培养物。 • 菌落：单个微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长、 繁殖到一定程度形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细 胞群体。 • 平板：冷却凝固后的固体培养基在无菌培养皿中形成的培 养基固体平面。
1.细菌的形态和排列
基本形态
球菌
杆菌
螺旋体
排列方式
脑膜炎双球菌
链球菌
四联球菌
葡萄球菌
丝状杆菌
2.古生菌
3.原核生物的细胞大小
病毒 细菌 动物的模式细胞 动物细胞核
二、真菌
1.霉菌 霉菌（mold）是一些“丝状真菌”的统称，不是分类 学上的名词。
2.酵母菌
• 是一群单细胞的真核微生物，无分类学意义。
1. 普通光学显微镜
显微镜的分辨率
• 能辨别两点之间最小距离的能力 最小可分辨距离=λ/2nsinө
sinө
2. 暗视野显微镜
3.倒置显微镜
二、 显微观察样品的制备
• 显微镜观察样品制作的原则： 1.尽量保持样品结构的完整性和原始性； 2.便于不同显微镜的观察。
光学显微镜的制样
1.活体观察法 1）压滴法 2）悬滴法 3）菌丝埋片法 4）扦片法 5）小室法
消毒 禽流感期间，工作人员在对鸡舍进行__________？
防腐 腌肉是一个_________过程？
灭菌
• • • • • 干热灭菌 高压蒸汽灭菌 灼烧灭菌 紫外线灭菌 微孔滤膜除菌
干热灭菌
• 灭菌条件：160 — 170℃；1 — 2 小时 • 灭菌对象：玻璃器皿
高压蒸汽灭菌
• 灭菌条件： 121℃，15— 30分钟 • 灭菌对象：培 养基，玻璃器 皿等
五、 选择培养分离
1.选择平板培养
富集培养
• 利用不同微生物间生命活动特点的不同，制定特 定的环境条件，使仅适应该条件的微生物旺盛生 长，从而使其在群落中的数量大大增加。
六、 微生物的保藏技术
• 微生物保藏的原则：
1. 一定时间内不会死亡； 2. 不会被其他微生物污染； 3. 不会因发生变异而丢失重要的生物学性状。
悬滴法
菌丝埋片法
扦片法
小室法
2.染色观察
简单染色 正染色 鉴别染色 死菌 细菌染色法 负染色：荚膜染色法等 革兰氏染色 抗酸性染色 芽孢染色 姬姆萨染色
活菌：用
• • • • 一、细菌和古生菌 二、真菌 三、藻类 四、原生动物
一、细菌和古生菌
第二章 微生物的纯培养和 显微技术
本章内容
• 第一节 微生物的分离和纯培养 • 第二节 显微镜和显微技术 • 第三节 显微镜下的微生物
第一节 微生物的分离和纯培养
• • • • • • 一、 无菌技术 二、 用固体培养基分离纯培养 三、 用液体培养基分离纯培养 四、 单细胞（孢子）分离 五、 选择培养分离 六、 微生物的保藏技术
一、 无菌技术
• 在分离、转接及培养纯培养物时防止被其 他微生物污染，其自身也不污染操作环境 的技术被称为无菌技术。
1. 微生物培养的常用器具及其灭菌
试管
培养皿
消毒与灭菌
• 消毒：利用某种方法杀死或灭活物质或物体中所有病原微 生物的一种措施，可以起到防止感染或传播的作用。 • 灭菌：是指利用某种方法杀死物体中包括芽孢在内的所有 微生物的一种措施。 • 防腐：在某些化学物质或物理因子作用下，能防止或抑制 微生物生长的一种措施，他能防止食物腐败或其他物质霉 变。
新型隐球酵母，可引 起脑膜炎等疾病
三、藻类
• 是指除苔藓植物和维管束植物以外，基本上有叶绿素，可 进行光合作用，并伴随放出氧气的一大类真核生物。
四、原生动物
• 是一类缺少真正细胞壁，细胞通常无色，具有运动能力， 并进行吞噬营养的单细胞真核生物。
作业
• 第二章 微生物的纯培养和显微技术
如果希望从环境中分离得到厌氧固氮菌，你该如何设计实验？
实验室用固体培养基获得微生物纯培养的几种 常用方法 • • • • 涂布平板法 稀释倒平板法 平板划线法 稀释摇管法
涂布平板法
稀释倒平板法
平板划线法
稀释摇管法
• 培养严格厌氧菌的方法
三、 用液体培养基分离纯培养 • 稀释法
10-3
10-4
10-5
四、 单细胞（孢子）分离
• 用来分离纯化个体较大的微生物。
灼烧灭菌
• 将体积较小的金属物品灼烧，以杀死其表 面的所有微生物。
紫外线灭菌
• 利用波长为 200—300nm 的紫外线杀死 微生物。
紫外灯
微孔滤膜除菌
• 通过机械作用滤去液体或气体中细菌的方法。
2.接种操作
• 在无菌条件下，用接种环或接种针挑取微生物，把它由一 个培养器皿转接到另一个培养器皿中进行培养的操作。