二轮复习 单克隆抗体的过程
单克隆抗体的制备原理及方法
单克隆抗体的制备原理及方法
单克隆抗体的制备原理及方法是通过以下步骤来实现的：
1. 免疫原的选择：选择一个目标抗原，并将其注入到免疫宿主中，例如小鼠。
2. 免疫应答：免疫宿主的免疫系统会识别并产生抗体来应对免疫原的存在。
3. 融合细胞的制备：从免疫宿主中取得抗体产生的细胞，并与癌细胞（如骨髓瘤细胞）融合，形成杂交瘤细胞。
4. 杂交瘤细胞的筛选：采用适当的培养基，筛选出那些能够生存和增殖的杂交瘤细胞。
这些细胞具有与原先抗体产生细胞相同的生长特性。
5. 单克隆抗体的筛选：将培养基中的每个细胞与免疫原进行反应，然后用酶联免疫吸附试验（ELISA）或流式细胞术等方法筛选出特异性抗原结合的细胞。
6. 单克隆抗体的扩增：将特异性抗原结合的细胞分离并培养，使其增殖，形成一个与原始细胞相同的细胞群。
除了以上的制备原理，还可以使用其他的方法来制备单克隆抗体，例如基因工程方法、人源化方法等。
这些方法可以通过人工改造的方式来制备单克隆抗体，以满足特定需求。
单克隆抗体的过程
单克隆抗体的过程
单克隆抗体的过程是指从单一的淋巴细胞中制备出一种特异性
很高、只与一种抗原结合的抗体。
这种抗体被称为单克隆抗体，是研究和应用领域中非常重要的工具。
单克隆抗体制备的过程主要包括以下几个步骤：
1. 免疫原注射：将一种抗原注射到小鼠或大鼠体内，以激发其
免疫系统产生特异性抗体。
2. 淋巴细胞分离：从小鼠或大鼠的脾脏或淋巴结中取出特异性
抗体产生的淋巴细胞。
3. 融合细胞制备：将淋巴细胞与骨髓瘤细胞进行融合，得到一
种能够长期生长和分泌抗体的杂交瘤细胞。
4. 筛选杂交瘤：通过对杂交瘤进行筛选，筛选出只分泌与所需
抗原结合的单克隆抗体的杂交瘤细胞。
5. 培养单克隆抗体：将根据筛选结果得到的杂交瘤细胞进行培养，得到单克隆抗体。
6. 纯化单克隆抗体：采用各种化学和生物学方法，将得到的单
克隆抗体进行纯化和加工处理。
单克隆抗体制备的过程需要经过多个阶段，其中淋巴细胞的分离、杂交瘤的筛选和单克隆抗体的培养是关键步骤。
随着技术的不断发展，单克隆抗体制备的效率和质量也在不断提高，为生命科学和医学研究提供了更加可靠的工具。
- 1 -。
单克隆抗体的制备流程
单克隆抗体的制备流程介绍在免疫学领域，单克隆抗体制备是一项重要的研究工作。
通过制备单克隆抗体，可以获得对特定抗原高度特异性的抗体，具有广泛的应用价值。
本文将详细介绍单克隆抗体的制备流程。
单克隆抗体制备的基本原理单克隆抗体的制备基于B细胞免疫学的原理。
B细胞是免疫系统中的一类淋巴细胞，具有抗体分泌的能力。
当机体暴露于外来抗原后，B细胞会被激活，并分化为两种类型的细胞：浆细胞和记忆B细胞。
浆细胞能够产生大量的抗体，但其分泌的抗体种类较为杂乱，无法特异性地与目标抗原结合。
而记忆B细胞则保存了对特定抗原的记忆，并可以长期存活。
单克隆抗体的制备即是利用记忆B细胞的特性，将其从免疫动物中分离出来，并通过细胞融合等技术手段获得对特定抗原高度特异的抗体克隆株。
单克隆抗体制备流程1. 免疫动物的免疫与抗原刺激•选择适当的免疫动物，如小鼠、大鼠、兔子等。
•将免疫动物注射所需抗原，通常包括纯化的蛋白质或抗原表位含有的多肽片段。
•观察免疫动物的免疫反应，收集其血样。
2. 浆细胞的分离与筛选•从免疫动物的血样中分离出含有浆细胞的细胞组分。
•利用细胞表面特定抗原分子，如CD138等，通过细胞分选技术选择性地富集浆细胞。
3. B细胞的分离与筛选•从免疫动物的脾脏等淋巴组织中分离出B细胞。
•利用B细胞特异的抗原表面标记物，如CD19等，进行细胞分选，选择性地获取B细胞群体。
4. B细胞与浆细胞的细胞融合•将B细胞和浆细胞以特定比例混合。
•利用细胞融合剂（如聚乙二醇）促使B细胞与浆细胞融合，形成受体细胞。
5. 杂交瘤细胞的筛选与生长•将融合后的受体细胞接种在富含肿瘤细胞的培养基中。
•利用培养基中肿瘤细胞的恶性增殖特性，筛选出杂交瘤细胞。
•杂交瘤细胞具有稳定的细胞倍体数和持久的增殖能力，适合大规模抗体的制备。
6. 单克隆抗体的筛选与鉴定•将杂交瘤细胞进行分离和延养，获得单个克隆细胞系。
•通过酶联免疫吸附试验（ELISA）、免疫组化等方法筛选出对目标抗原高度特异的单克隆细胞系。
单克隆抗体制备步骤及注意事项
单克隆抗体制备步骤及注意事项一、脾细胞的准备：1.将Balb/c小鼠拉颈脱臼处死，浸泡于75%酒精3～5min。
无菌操作取出脾脏，置于盛有5mL不完全培养液的平皿中，洗涤3次去除脾脏表面的脂肪和结缔组织。
2.将洗好的脾脏用剪刀剪成3～5个小块，然后将脾脏研碎，过细胞筛，收集细胞。
3.将脾脏细胞悬液在1000r/min条件下，离心5min，弃上清。
再以同样的方法洗涤离心一次。
4.将沉淀细胞重新悬浮于10mL不完全培养液中，计活细胞数，取108个脾淋巴细胞悬液备用。
注意事项：➢免疫脾细胞一般取最后一次加强免疫3天以后的脾脏，制备成细胞悬液，因为此时B淋巴母细胞比例较大，融合的成功率较高。
二、骨髓瘤细胞的准备：1.选好骨髓瘤细胞株，取体外培养对数生长期细胞或体内生长的肿瘤分离骨髓瘤细胞。
2.取对数生长骨髓瘤细胞离心，用无血清培养液洗2次。
3.制备细胞悬液，计活细胞数。
4.调整细胞浓度，取107细胞悬液备用。
注意事项：➢常用的骨髓瘤细胞系有：NS1、SP2/0、X63、Ag8.653等。
➢骨髓瘤细胞系应和免疫动物属于同一品系，这样杂交融合率高，也便于接种杂交瘤细胞在同一品系小鼠腹腔内生产大量McAb。
➢骨髓瘤细胞的培养适合于一般的培养液，如RPMI-1640基础培养液，DMEM培养基。
小牛血清的浓度一般在10～20%。
细胞的最大密度不得超过106个/mL。
➢一般扩大培养以1:10稀释传代，每3～5天传代一次。
细胞的倍增时间为16～20小时。
➢一般准备融合前的两周就应开始复苏骨髓瘤细胞，为确保该细胞对HA T的敏感性，每3～6个月应用8～AG（8氮杂鸟嘌呤）筛选一次，以防止细胞的突变。
➢保证骨髓瘤细胞处于对数生长期，良好的形态，活细胞计数高于95%，也是决定细胞融合的关键。
三、细胞融合：1.将骨髓瘤细胞与脾细胞按1:10 或1:5的比例混合，加入20～50mL RPMI-1640培养液。
2.在1000r/min条件下离心8min，弃上清，用滴管轻轻吸净残留液体。
高中生物高考解 克隆技术和胚胎工程(讲义)-【高频考点解密】2021年高考生物二轮复习讲义+分层训练
解密27 克隆技术和胚胎工程核心考点一体内受精和早期胚胎发育1．精子的发生（1）不同种动物精子的形态相似，大小略有不同，但与动物的体型大小无关。
（2）精子的发生中两次减数分裂是连续的，是在睾丸的曲细精管内进行的。
卵子的发生中两次减数分裂是不连续的，减数第一次分裂在卵巢内完成，产生一个次级卵母细胞和第一极体，进入输卵管在与精子的结合过程中完成减数第二次分裂，产生一个成熟的卵子和第二极体。
当原核融合时，第一极体完成分裂，形成2个第二极体。
有的哺乳动物的第一极体不再分裂。
2．卵子的发生（1）哺乳动物卵泡的形成和在卵巢内的储备，是在出生前（即胎儿时期）完成的，这是精子和卵子在发生上的重要区别。
（2）哺乳动物卵巢、卵泡和卵子的关系：卵巢是卵子形成、卵泡存在的场所，内部包含许许多多不同发育阶段的卵泡，而成熟的卵泡中可释放出卵子，其中卵子的外面有辅助结构——透明带，由卵丘细胞（卵泡细胞）形成放射冠。
3．受精过程中的“三大反应”和防止多精子入卵受精的“两道屏障”（1）顶体反应：精子释放的顶体酶可直接溶解卵丘细胞间的物质，形成精子穿越放射冠的通路。
（2）透明带反应：在精子触及卵细胞膜的瞬间，会产生阻止后来的精子进入透明带的生理反应，它是防止多精子入卵受精的第一道屏障。
（3）卵细胞膜反应：精子入卵后，卵细胞膜拒绝其他精子再进入卵内，这是防止多精子入卵受精的第二道屏障。
4．胚胎发育过程（1）起点是受精卵分裂，在输卵管内完成受精作用时即已开始，直至发育成为成熟的胎儿。
（2）卵裂期的特点：细胞有丝分裂使细胞数目增加，但胚胎总体积并不增加或略缩小，因此每个细胞的体积会随分裂的进行不断缩小，但核内遗传物质并未减少。
（3）桑椹胚以前的细胞均未分化，细胞全能性最高，是胚胎分割的最佳时期。
（4）桑椹胚至囊胚的发育过程中，细胞开始分化，但其全能性仍很高，也可用于胚胎分割。
【易错警示】受体及胚胎发育的2个易错点（1）受精过程的三个易混点①精子获能是指精子获得受精“能力”，而不是获得能量。
复习_单克隆抗体的过程
单克隆抗体的制备 1、怎样获得能分泌专一抗体的B淋巴细胞？
反复注射特定的抗原，免疫小鼠。
2、从何处获得较多的B淋巴细胞？ 小鼠的脾脏 3、用什么方法可以使B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合？
PEG、灭活的病毒等
4、怎样筛选出杂交瘤细胞？利用HAT选择培养基培养，筛选
5、怎样获得只产生特异性抗体的杂交瘤细胞？
不断分裂增殖。
你想到筛选杂交瘤细胞的方案了么？
在培养基中加入氨基嘌呤，收集增殖细胞！ 3种杂交细胞：①B-B融合细胞、②杂交瘤细胞 ③瘤-瘤融合细胞
未融合的细胞：④单个的B细胞、⑤单个的骨髓瘤细胞
这五种细胞中， ① ④没有分裂能力，逐渐衰老死亡； ③ ⑤的DNA复制只有D途径， 加入氨基嘌呤后，使 D 合成途径阻断，也逐渐衰老死亡， 但②的DNA复制有D、S两条途径，虽然D途径被氨基嘌呤阻断， 但是还可以通过 S 途径进行DNA的复制，使细胞有分裂能力。
（3）大量制备单克隆抗体的方法主要有两种： ①体外培养法，可获得10μg/mL的抗体；②动物体内 诱生法可获得5~20mg/mL的抗体。你选择的方法及原 因是 大量生产选①，小规模生产选② 。
（4）用本法制备出的单克隆抗体仍具有局限性，因 效应B 为它是用小鼠的_______细胞制备的，其化学本质是 蛋白质 ___________，应用于人体，会作为 异物 产 生 免疫反应，解决这个问题的方法是 采用人的效应B细胞制备 _____________________________。
5.整个制备过程为何要经过两次筛选? 第一次筛选用特定的选择培养基， 筛选出杂交瘤细胞（多种）
第二次用多孔培养板，
筛选出能产生特异性抗体的杂交瘤细胞。
单克隆确有单个细胞克隆的含义，只不过克隆的 不是B淋巴细胞，而是杂交瘤细胞。
简述单克隆抗体的制备过程
简述单克隆抗体的制备过程
单克隆抗体是由单一的细胞克隆所产生的一种抗体，具有高度的特异性和亲和力。
其制备过程主要包括以下几个步骤：
1. 免疫原制备：首先需要准备纯化的免疫原，可以是蛋白质、多肽、糖、脂类等生物大分子或小分子。
2. 动物免疫：将纯化的免疫原注射到动物体内，激发其免疫系统产生抗体。
一般常用小鼠、大鼠、兔子等动物作为免疫体。
3. 细胞融合：将免疫体中的B细胞与肿瘤细胞进行融合，形成杂交瘤细胞。
此类细胞具有B细胞的抗体产生能力和肿瘤细胞的无限增殖能力。
4. 筛选和克隆：通过细胞培养和筛选，筛选出产生特定抗体的杂交瘤细胞，并进行单克隆化处理，即从单一细胞中分离出单一抗体。
5. 抗体纯化：将单克隆抗体进行纯化，去除杂质，得到高纯度的单克隆抗体。
这些单克隆抗体可以广泛用于生物医学研究、诊断和治疗等领域。
总之，单克隆抗体制备过程需要精确的技术和细致的操作，同时需要对免疫原、动物和培养条件进行深入了解和优化，才能获得高质量的单克隆抗体。
- 1 -。
制备单克隆抗体的原理
制备单克隆抗体的原理单克隆抗体是一种高度特异性的抗体，它可以识别并结合到特定的抗原上。
制备单克隆抗体的原理是通过克隆单个B细胞，使其产生同一种特异性的抗体。
这种方法可以获得高度特异性和高亲和力的抗体，因此在医学、生物学和生物技术领域得到了广泛的应用。
制备单克隆抗体的过程可以分为四个步骤：免疫、细胞融合、筛选和扩增。
第一步是免疫。
在这一步中，动物（通常是小鼠）被注射一种特定的抗原，以刺激其免疫系统产生抗体。
这些抗体会被B细胞产生并分泌到血液中。
第二步是细胞融合。
在这一步中，从免疫小鼠的脾脏中收集B细胞，并与一种特殊的癌细胞（称为骨髓瘤细胞）融合。
这种融合产生的细胞称为杂交瘤细胞，它们具有两种细胞的特性：B细胞的抗体产生能力和骨髓瘤细胞的无限增殖能力。
第三步是筛选。
在这一步中，杂交瘤细胞被分配到96孔板中，每个孔中只有一个细胞。
然后，每个孔中的细胞被检测其是否产生特定的抗体。
这种检测通常使用酶联免疫吸附试验（ELISA）或免疫荧光染色法。
只有产生特定抗体的细胞才会被保留下来。
第四步是扩增。
在这一步中，产生特定抗体的杂交瘤细胞被扩增，以获得足够的单克隆抗体。
这些抗体可以通过培养杂交瘤细胞或通过收集细胞培养液来获得。
制备单克隆抗体的原理是利用B细胞的特异性和骨髓瘤细胞的无限增殖能力，通过细胞融合和筛选，获得同一种特异性的抗体。
这种方法可以获得高度特异性和高亲和力的抗体，因此在医学、生物学和生物技术领域得到了广泛的应用。
单克隆抗体的应用非常广泛。
它们可以用于诊断、治疗和研究。
例如，单克隆抗体可以用于检测病原体、肿瘤标志物和药物残留物。
它们还可以用于治疗癌症、自身免疫性疾病和传染病。
此外，单克隆抗体还可以用于研究蛋白质结构和功能，以及开发新的生物技术产品。
制备单克隆抗体的原理是通过克隆单个B细胞，使其产生同一种特异性的抗体。
这种方法可以获得高度特异性和高亲和力的抗体，因此在医学、生物学和生物技术领域得到了广泛的应用。
单克隆抗体研制的详细步骤
单克隆抗体研制的详细步骤一、单克隆抗体的概念抗体是机体在抗原刺激下产生的能与该抗原特异性结合的免疫球蛋白。
常规的抗体制备是通过动物免疫并采集抗血清的方法产生的，因而抗血清通常含有针对其他无关抗原的抗体和血清中其他蛋白质成分。
一般的抗原分子大多含有多个不同的抗原决定簇，所以常规抗体也是针对多个不同抗原决定簇抗体的混合物。
即使是针对同一抗原决定簇的常规血清抗体，仍是由不同B细胞克隆产生的异质的抗体组成。
因而，常规血清抗体又称多克隆抗体（polyclonal antibody），简称多抗。
因为常规抗体的多克隆性质，加之不同批次的抗体制剂质量差异很大，使它在免疫化学试验等使用中带来很多麻烦。
所以，制备针对预定抗原的特异性均质的且能保证无限量供应的抗体是免疫化学家长期梦寐以求的目标。
随着杂交瘤技术的诞生，这个目标得以实现。
1975年，Kohler和Milstein建立了淋巴细胞杂交瘤技术，他们把用预定抗原免疫的小鼠脾细胞与能在体外培养中无限制生长的骨髓瘤细胞融合，形成B细胞杂交瘤。
这种杂交瘤细胞具有双亲细胞的特征，既像骨髓瘤细胞一样在体外培养中能无限地快速增殖且永生不死，又能像脾淋巴细胞那样合成和分泌特异性抗体。
通过克隆化可得到来自单个杂交瘤细胞的单克隆系，即杂交瘤细胞系，它所产生的抗体是针对同一抗原决定簇的高度同质的抗体，即所谓单克隆抗体（monoclonal antibody），简称单抗。
与多抗相比，单抗纯度高，专一性强、重复性好、且能持续地无限量供应。
单抗技术的问世，不但带来了免疫学领域里的一次革命，而且它在生物医学科学的各个领域获得极广泛的应用，促动了众多学科的发展。
Kohler和Milstein两人由此杰出贡献而荣获1984年度诺贝尔生理学和医学奖。
二、杂交瘤技术（一）杂交瘤技术的诞生淋巴细胞杂交瘤技术的诞生是几十年来免疫学在理论和技术两方面发展的必然结果，抗体生成的克隆选择学说、抗体基因的研究、抗体结构与生物合成以及其多样性产生机制的揭示等，为杂交瘤技术提供了必要理论基础，同时，骨髓瘤细胞的体外培养、细胞融合与杂交细胞的筛选等提供了技术贮备。
单克隆抗体的制备过程及研究进展
单克隆抗体的制备过程及研究进展首先，在制备单克隆抗体前需要选择一个具有高抗原性和纯度的免疫原。
免疫原可以是蛋白质、多肽、碳水化合物等。
通常选择具有免疫原性强和抗体反应性好的免疫原进行实验。
然后，将免疫原通过适当方法（如注射、免疫泵等）在动物体内进行免疫。
免疫后，动物会产生抗原特异性抗体。
融合细胞形成后，需要通过选择性培养条件（如含有抗生素的培养基）和限制性稀释法来产生单克隆细胞。
单克隆细胞会分泌特异性抗体。
单克隆细胞即可通过ELISA、免疫组织化学、流式细胞术等方法进行筛选和鉴定。
筛选后的单克隆细胞，可以进行大规模扩增生产，并通过细胞培养、培养基的优化来实现高产量的单克隆抗体的产生。
最后，对扩增的单克隆细胞进行纯化和鉴定。
纯化过程通常包括离心、柱层析、亲和层析等分离技术，以获得高纯度的单克隆抗体。
近年来，单克隆抗体的研究进展如下：1.重组单克隆抗体技术的发展：传统的单克隆抗体制备需要通过动物免疫，难以实现大规模的制备。
而重组单克隆抗体技术通过将抗体基因序列克隆到合适的表达载体中，通过细胞培养和表达技术来制备大量单克隆抗体，大大提高了单克隆抗体的生产效率。
2.新的单克隆抗体制备方法的出现：近年来，不断有新的单克隆抗体制备方法被提出，包括全人源化单克隆抗体制备技术、体外生成单克隆抗体技术等。
这些新的方法不仅能够避免动物免疫的问题，还能够提高单克隆抗体的稳定性和特异性。
3.单克隆抗体在治疗和诊断领域的应用：单克隆抗体在治疗和诊断领域有着广泛的应用。
例如，一些单克隆抗体已经成功用于治疗癌症、炎症性疾病等，比如肿瘤靶向药物帕妥珠单抗。
同时，一些单克隆抗体也被广泛应用于生物学研究和临床诊断，如免疫组织化学、流式细胞术等。
总之，单克隆抗体的制备过程经过多次改进和优化，从开始的动物免疫到现在的重组技术，使得单克隆抗体的开发和应用达到了一个新的高度。
未来，随着技术的不断进步，单克隆抗体在疾病治疗、疾病诊断和药物研发等领域的应用前景将更加广阔。
高中生物单克隆抗体的原理
高中生物单克隆抗体的原理
单克隆抗体的原理是利用体外克隆技术生产出一类能够特异性结合特定抗原的抗体分子。
具体步骤如下：
1. 免疫动物注射抗原：首先，将目标抗原注射到小鼠或兔子等动物体内，激发其免疫系统产生特异性抗体。
2. 细胞融合：从免疫动物体内提取免疫细胞，如B淋巴细胞，与癌细胞（如骨髓瘤细胞）进行体外融合。
这样的细胞融合可以获得与抗原结合能力高，并具有无限增殖潜能的细胞，称为杂交瘤细胞。
3. 杂交瘤细胞筛选：将融合细胞培养于含有选择性培养基的培养皿中，只有杂交细胞能够在该培养基生存下来并继续增殖。
通过限制性稀释法，将细胞稀释至单个细胞，使每个细胞在培养皿上分离，形成单个克隆，也就是单克隆细胞。
4. 鉴定和筛选：对每个克隆细胞进行鉴定和筛选，以确定其产生的细胞株能够特异性结合目标抗原。
常用的方法有酶联免疫吸附试验（ELISA）和免疫组化等技术，筛选出特异性和高亲和力的单克隆抗体。
5. 扩增和纯化：选定特异性的单克隆抗体细胞株，进行大规模培养，通过培养
液中的抗体进行纯化，得到可供生物医药应用的单克隆抗体产品。
总结：单克隆抗体的原理是通过将免疫细胞与癌细胞进行融合，形成能够无限增殖并产生抗体的杂交瘤细胞，然后通过鉴定和筛选，选择出特异性和高亲和力的单克隆抗体细胞株，并进行扩增和纯化，最终得到可供应用的单克隆抗体。
高三二轮复习回归课本细节生物选修三填空(含答案)【rkaili资料】
高三二轮复习回归课本细节生物选修三填空(含答案)【rkaili资料】1.限制酶主要来源于原核生物，其特点是能够识别DNA分子中特定的脱氧核苷酸序列。
2.T4 DNA连接酶能够连接平末端和黏性末端。
3.天然质粒通常需要经过人工改造才能用作载体。
4.如果目的基因较小并且核苷酸序列已知，则可以通过人工化学合成获取。
5.PCR技术所使用的酶是耐高温的DNA聚合酶Taq酶。
6.在PCR扩增目的基因之前，需要已知一段目的基因的核苷酸序列，以便合成引物。
7.基因工程的原理是基因重组，而PCR技术的原理是DNA复制。
8.构建基因表达载体是基因工程的核心步骤。
9.在构建基因表达载体时，通常会使用相同的限制酶处理目的基因和载体。
10.使用两种不同的限制酶同时处理质粒和含目的基因的片段，可以防止质粒和含目的基因的外源DNA片段自身环化，同时也能防止反向连接。
11.启动子位于基因首端的一段具有特殊结构的DNA片段，是RNA聚合酶识别和结合的部位，它能够驱动基因转录成mRNA。
12.外源基因能在受体细胞内表达的原因是生物界共用同一套遗传密码。
13.真核生物的糖蛋白基因导入原核生物一般不能成功表达的原因是原核细胞缺少内质网。
14.在基因工程中的农杆菌转化法过程中，双子叶植物会分泌酚类化合物来吸引农杆菌。
15.农杆菌在农杆菌转化法中的作用是感染双子叶植物和裸子植物，其Ti质粒上的T-DNA可以转移并整合到受体细胞染色体的DNA上。
16.钙离子处理受体细胞，使其成为感受态细胞后，将重组表达载体DNA分子溶于缓冲液中与感受态细胞混合，在一定的温度下促进其转化，吸收DNA分子。
17.原核生物作为转基因受体细胞的优点是繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少。
18.为了检测转基因幼苗是否具有抗除草剂特性，可以对幼苗喷施除草剂，并与未喷施的对照组进行对照观察其生长情况。
19.培育体型巨大或生长速度加快的动物，通常是导入了其他动物的生长激素基因。
高中生物精品课件：(新教材)二轮复习：单克隆抗体的制备流程
拓展：筛选分泌特异性杂交瘤细胞的具体流程
将培养一段时间后， 有活细胞的孔转移到
另一多孔板
对阳 性孔 稀释
细胞融合
融合细胞的铺板（提前做好 饲养细胞的铺板），一段时 间后换成含HAT的培养基。培 养一段时间观察各个孔的细
胞生长情况
相当于稀释，也是提前 铺好饲养细胞的
根据检 测结果 找出阳 性孔
阳性对照孔 （加免疫血清）
①
②
③
多次抗体检验
单克隆抗体的制备流程
基础知识回顾 • 1、什么是单克隆抗体？ • 2、为什么要制备单克隆抗体？
①制备 抗原
⑤取骨 髓瘤细 胞
②取免 疫小鼠
③注射 抗原
④取脾 细胞
⑥Hale Waihona Puke ⑦⑧细2
扩
胞
次
大
融
筛
培
合
选
养
思考：
1、过程①制备的抗原有什么要求？ 2、过程②所取的免疫小鼠有什么要求？ 3、过程③注射抗原要注意什么？ 4、过程④为什么取脾脏获取脾细胞？怎样获取单细胞悬液？ 5、过程⑤所取的骨髓瘤细胞有什么要求和特点？ 6、过程⑥融合的手段或技术有哪些？为了提高融合的效率除了考虑融合的技术还需要考虑哪些因素？ 7、过程⑦2次筛选分别筛选什么？怎样筛选？其中第二次筛选利用了什么原理？ 8、过程⑧培养的途径有哪些？ 9、为了提高体外培养的成功率，需要注意什么？ 10、你认为这两种培养的途径各自的优缺点是什么？
4.取小鼠甲脾脏剪碎，用胰蛋白酶处理使其分散成单个细胞，加入培养液制成单 细胞悬液；
DNA合成途径
再接着思考： • 利用小鼠制备的单克隆抗体有什么缺点？为什么？从临床应用的角度思考 • 鼠源性单抗作为治疗制剂反复使用后会引起人体免疫系统的排斥，产生人
单克隆抗体制备流程
单抗制备流程1975年，Kohler和Milstein发现将小鼠骨髓瘤细胞和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合,形成的杂交细胞既可产生抗体,又可无限增殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术。
这一技术上的突破不仅为医学与生物学基础研究开创了新纪元，也为临床疾病的诊、防、治提供了新的工具。
制备单克隆抗体包括动物免疫、细胞融合、选择杂交瘤、检测抗体、杂交瘤细胞的克隆化、冻存以及单克隆抗体的大量生产,要经过几个月的一系列实验步骤,下面按照制备单克隆抗体的流程顺序，逐一介绍其实验方法。
一、细胞融合前准备(一）免疫方案选择合适的免疫方案对于细胞融合杂交的成功,获得高质量的McAb至关重要。
一般要在融合前两个月左右确立免疫方案开始初次免疫,免疫方案应根据抗原的特性不同而定。
1。
颗粒性抗原免疫性较强，不加佐剂就可获得很好的免疫效果.下面以细胞性抗原为例的免疫方案:初次免疫1×10７／0。
5ml ip （腹腔内注射）↓2～3周后第二次免疫1×10７／0.5ml ip↓3周后加强免疫（融合前三天）1×10７／0。
5ml ip或iv(静脉内注射）↓取脾融合2.可溶性抗原免疫原性弱,一般要加佐剂，常用佐剂：福氏完全佐剂，福氏不完全佐剂.要求抗原和佐剂等体积混合在一起，研磨成油包水的乳糜状，放一滴在水面上不易马上扩散呈小滴状表明已达到油包水的状态.商品化福氏完全佐剂在使用前须振摇，使沉淀的分枝杆菌充分混匀。
初次免疫 Ag 1～50μg 加福氏完全佐剂皮下多点注射│(一般0.8~1ml 0.2ml／点）↓3周后第二次免疫剂量同上，加福氏不完全佐剂皮下或ip│（ip剂量不宜超过0。
5ml)↓3周后第三次免疫剂量同上，不加佐剂，ip│（5～7天后采血测其效价,检测免疫效果）↓2～3周后加强免疫，剂量50～500μg为宜,ip或iv↓3天后取脾融合目前,用于可溶性抗原（特别是一些弱抗原)的免疫方案也不断有所更新，如①将可溶性抗原颗粒化或固相化，一方面增强了抗原的免疫原性,另一方面可降低抗原的使用量.②改变抗原注入的途径,基础免疫可直接采用脾内注射.③使用细胞因子作为佐剂，提高机体的免疫应答水平,促进免疫细胞对抗原反应性.（二）饲养细胞在制备单克隆抗体过程中，许多环节需要加饲养细胞,如：在杂交瘤细胞筛选、克隆化和扩大培养过程中,加入饲养细胞是十分必要的。
【高中生物】高中生物知识点：单克隆抗体
【高中生物】高中生物知识点：单克隆抗体单克隆抗体：1、抗体：一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体。
从血清中分离出的抗体产量低、纯度低、特异性差。
2、单克隆抗体的制备（1）制备产生特异性抗体的B淋巴细胞：向免疫小鼠体内注射特定的抗原，然后从小鼠脾内获得相应的B淋巴细胞（2）获得杂交瘤细胞①将鼠的骨髓瘤细胞与脾细胞中形成的B淋巴细胞融合；②用特定的选择培养基筛选出杂交瘤细胞，该杂种细胞既能够增殖又能产生抗体。
（3）克隆化培养和抗体检测（4）将杂交瘤细胞在体外培养或注射到小鼠腹腔内增殖（5）提取单克隆抗体：从细胞培养液或小鼠的腹水中提取3、单克隆抗体的应用(1)作为诊断试剂，具有准确、高效、简易、快速的优点。
(2)用于治疗疾病和运载药物。
血清抗体与单克隆抗体的比较：名称产生特点血清抗体由B淋巴一般从血清中分离，产量低、纯度低、特异性差单克隆抗体由杂交瘤细胞分泌特异性强，灵敏度高，能大量制备知识点拨：1、融合的结果是有很多不符合要求的；如有2个B淋巴细胞融合的细胞等，所以要进行筛选。
2、筛选出能够分泌所需抗体的杂种细胞。
3、杂交瘤细胞的特点：既能大量繁殖，又能产生专一的抗体。
4、单克隆抗体的优点：特异性强，灵敏度高，并能大量制备。
5、单克隆抗体的作用：作为诊断试剂：准确识别各种抗原物质的细微差异，并跟一定抗原发生特异性结合，具有准确、高效、简易、快速的优点。
用于治疗疾病和运载药物：主要用于治疗癌症治疗，可制成“生物导弹”，也有少量用于治疗其它疾病。
知识拓展：制备单克隆抗体过程中的筛选：筛选是将未融合的B淋巴细胞、骨髓瘤细胞以及BB融合、瘤瘤融合的细胞通过选择培养基淘汰，筛选出B瘤融合的细胞。
筛选是将产生特定抗体的B瘤细胞通过细胞培养用相应抗原检测的办法筛选出来。
因为从体内取免疫过的B淋巴细胞时取出很多种，形成的杂交瘤细胞有很多种，所以需筛选出产生特定抗体的杂交瘤细胞。
相关高中生物知识点：植物体细胞杂交技术植物体细胞杂交技术：1、植物体细胞杂交技术：就是将不同种的植物体细胞原生质体在一定条件下融合成杂种细胞，并把杂种细胞培育成完整植物体的技术。
单克隆抗体制备的原理
单克隆抗体制备的原理以单克隆抗体制备的原理为标题，我将为您简要介绍单克隆抗体制备的原理和步骤。
单克隆抗体制备是一种从单一细胞分离出的抗体，具有高度特异性和亲和力。
它是通过对抗原刺激免疫细胞产生的抗体进行筛选和鉴定，从而获得特定单克隆抗体。
下面是制备单克隆抗体的主要步骤：1. 免疫原的制备：首先需要获得目标抗原，可以是蛋白质、多肽、糖类或其他小分子。
然后将抗原纯化并与佐剂混合，以增强其免疫原性。
佐剂可以激活免疫系统，促使机体产生更多的抗体。
2. 免疫动物的免疫：将免疫原注射到小型实验动物（如小鼠）的体内，以激发其免疫系统产生抗体。
为了增强免疫效果，通常需要多次免疫，间隔一定时间。
3. 细胞融合：在免疫动物产生足够的抗体后，需要收集其脾脏或骨髓细胞。
这些细胞中包含了产生抗体的B淋巴细胞。
将这些B细胞与骨髓瘤细胞（如骨髓瘤细胞SP2/0或NS0）进行融合，形成杂交瘤细胞。
4. 杂交瘤细胞的筛选：杂交瘤细胞具有无限增殖的能力，但它们只会产生一种类型的抗体。
为了筛选出目标抗体的单克隆细胞株，通常需要使用肿瘤细胞和抗生素来选择出只产生目标抗体的杂交瘤细胞。
5. 单克隆细胞的扩增：经过筛选后，单克隆细胞需要进行扩增，以获得足够多的细胞用于后续实验。
这些细胞可以在体外培养基中继续增殖，以产生大量的单克隆抗体。
6. 单克隆抗体的纯化和鉴定：通过培养单克隆细胞，可以获得细胞培养上清液，其中含有单克隆抗体。
然后可以使用各种纯化技术，如亲和层析、离子交换层析和凝胶过滤等，将目标抗体从上清液中纯化出来。
最后，通过鉴定技术，如酶联免疫吸附测定（ELISA）或免疫组化等，确定单克隆抗体的特异性和亲和力。
单克隆抗体制备是一项复杂而精细的工作。
通过对抗原的选择、免疫动物的免疫、细胞融合、筛选、扩增和纯化等步骤，可以获得具有高度特异性和亲和力的单克隆抗体。
这些抗体在医学诊断、药物研发和科学研究等领域具有广泛的应用前景。
单克隆抗体的制备为生物医学领域的研究和应用提供了强有力的工具，也为疾病的早期诊断和治疗提供了新的途径。
老高考新教材适用2023版高考生物二轮复习知识对点小题练12生物技术与工程(含答案)
2023版高考生物二轮复习知识对点小题练：12.生物技术与工程1.三糖铁(TSI)培养基中含有牛肉膏、蛋白胨、蔗糖、乳糖、微量葡萄糖、硫酸亚铁、氯化钠、酚红、琼脂等成分,可根据观察单一细菌对三种糖的分解能力及是否产生硫化氢来鉴别细菌的种类。
三糖铁(TSI)琼脂实验方法是:使用笔直的接种针挑取待测菌落,将接种针平稳刺入三糖铁固体斜面培养基内,然后沿原穿刺途径慢慢抽出接种针,最后在斜面上进行“之”字划线,36 ℃下培养18~24 h,观察实验结果。
酚红在酸性条件下显黄色,在碱性条件下显红色。
细菌产生的硫化氢与铁盐反应生成黑色沉淀。
下列叙述不正确的是( )A.穿刺或划线的目的是将纯培养物进行二次传代培养,须严格控制交叉污染B.若培养基出现黑色沉淀,可推测该细菌能够分解牛肉膏、蛋白胨C.若细菌能分解乳糖和葡萄糖而产酸、产CO2,推测斜面为黄色、底层为红色且有气泡D.若底层穿刺线四周出现扩散生长现象,可推测细菌是可以运动的2.肠出血性大肠杆菌(EHEC)是一种毒性较强的致病菌,患病或带菌动物往往是食品污染的根源。
检测人员对被污染的食物进行EHEC的分离、计数,以确定食物的污染程度。
已知该大肠杆菌在添加血液的血平板上生长时会破坏菌落周围的红细胞,使其褪色形成透明圈。
下列说法正确的是( )A.肉汤培养基可为EHEC提供的主要营养成分为碳源、氮源、水、无机盐B.在血平板上进行菌体分离、计数,使用的接种方法可以是划线法C.透明圈都是由单个EHEC经过多次细胞分裂产生的菌体形成D.在分离和计数之前,为了避免其他细菌的干扰,要对所取样品进行选择培养3.(2022江苏扬州三模)如图为单克隆抗体制备过程的示意图。
下列有关叙述错误的是 ( )A.每个脾B淋巴细胞都可产生多种抗体B.灭活的病毒促融合的效率一般不能达到100%C.细胞筛选和细胞融合时所用的培养液在成分上有差异D.克隆化培养过程中杂交瘤细胞不会出现接触抑制的现象4.(2022辽宁二模)下图表示利用基因工程技术生产人血清白蛋白的两条途径,下列有关叙述正确的是( )A.若A基因是由从人细胞内提取的mRNA经逆转录形成的,则基因A中不含启动子序列B.扩增目的基因时,利用耐高温的DNA连接酶从引物a和引物b起始进行互补链的合成C.接受人血清白蛋白基因的绵羊受体细胞是乳腺细胞D.为了大量生产人血清白蛋白,还必须将含目的基因的植物受体细胞培养成完整植株5.Cre-loxP系统能实现特定基因的敲除(如图1)。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
方法——抗原 方法——抗原-抗体杂交法 抗原-
阳性孔 用多孔细胞培养板培养，稀释度要保证每个孔内 多孔细胞培养板培养 稀释度要保证每个孔内 培养， 不多于一个细胞。 不多于一个细胞。 抗原抗体杂交法检测——呈阳性反应 抗原抗体杂交法检测——呈阳性反应
如何得到大量的单克隆抗体？ 如何得到大量的单克隆抗体？
用多孔细胞培养板培养，稀释度要保证每个孔内不多于一个细胞。 用多孔细胞培养板培养，稀释度要保证每个孔内不多于一个细胞。 保证每个孔内不多于一个细胞 抗原抗体杂交法检测——呈阳性反应 抗原抗体杂交法检测——呈阳性反应 怎样获得大量的单一抗体？ 7、怎样获得大量的单一抗体？ 体内或体外大量培养特异的杂交 瘤细胞，从中提取单一抗体。 瘤细胞，从中提取单一抗体。
反复注射特定的抗原，免疫小鼠。 反复注射特定的抗原，免疫小鼠。
2、从何处获得较多的B淋巴细胞？ 小鼠的脾脏 从何处获得较多的B淋巴细胞？ 3、用什么方法可以使B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合？ 用什么方法可以使B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合？
PEG、 PEG、灭活的病毒等
4、怎样筛选出杂交瘤细胞？利用HAT选择培养基培养，筛选 怎样筛选出杂交瘤细胞？利用HAT选择培养基培养 选择培养基培养， 5、筛选出的杂交瘤细胞产生的抗体都一样吗？ 否 筛选出的杂交瘤细胞产生的抗体都一样吗？ 6、怎样获得只产生特异性抗体的杂交瘤细胞？ 怎样获得只产生特异性抗体的杂交瘤细胞？
5.整个制备过程为何要经过两次筛选? 5.整个制备过程为何要经过两次筛选? 整个制备过程为何要经过两次筛选 第一次筛选用特定的选择培养基， 第一次筛选用特定的选择培养基， 筛选出杂交瘤细胞（多种） 筛选出杂交瘤细胞（多种） 杂交瘤细胞 第二次用多孔培养板， 第二次用多孔培养板， 筛选出能产生特异性抗体的杂交瘤细胞。 筛选出能产生特异性抗体的杂交瘤细胞。 能产生特异性抗体的杂交瘤细胞
一
杂交瘤细胞系 单克隆抗体
特定的选择培养 基
多孔细胞培养板
高考热点： 高考热点：
1.此过程中的 淋巴细胞是经过免疫的，实际 此过程中的B淋巴细胞 经过免疫的 此过程中的 淋巴细胞是 上就是浆细胞 浆细胞。 上就是浆细胞。 2.融合后形成的杂交细胞有多种，考虑两两 融合后形成的杂交细胞有多种， 融合后形成的杂交细胞有多种 考虑两两 融合，共有三 融合，共有三种： B-B、B-瘤(杂交瘤细胞) 、瘤-瘤 杂交瘤细胞) 3.单克隆抗体制备中用到的技术手段： 3.单克隆抗体制备中用到的技术手段 单克隆抗体制备中用到的技术手段： 动物细胞融合、动物细胞培养。 动物细胞融合、动物细胞培养。 4.原理：细胞膜的流动性、细胞增殖 4.原理 细胞膜的流动性、 原理：
1.传统的生产方法 传统的生产方法: 传统的生产方法
主要分布血清， 主要分布血清， 还有的分布在组织液，外 还有的分布在组织液， 分泌液
反复注射某种抗原， 向动物体内反复注射某种抗原 向动物体内反复注射某种抗原，使动物产 生抗体，然后从动物血清 血清中分离所需要的 生抗体，然后从动物血清中分离所需要的 抗体。 抗体。 2.缺陷：产量低、纯度低，而且制备的抗体 缺陷：产量低、纯度低， 缺陷 特异性差。 特异性差。
单克隆抗体
一个B 一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体 骨髓瘤细胞（癌细胞） 骨髓瘤细胞（癌细胞）能无限增殖
单克隆 抗体
动物细胞培养技术
杂交瘤细胞
动物细胞融合
既能在体外大量繁殖， 既能在体外大量繁殖， 又能产生特异性抗体
融合 浆细胞
第一次筛选用特定的选择培养基 帅选出杂交瘤细胞
小资料： 小资料： ①细胞合成DNA有D和S两条途径，其中D途径能被 细胞合成DNA DNA有 两条途径，其中D途径能 氨基嘌呤阻断。 氨基嘌呤阻断。 阻断 ②人淋巴细胞中有这两种DNA的合成途径，但一般 淋巴细胞中有这两种DNA的合成途径， 中有这两种DNA的合成途径 不分裂增殖。 不分裂增殖。 ③鼠骨髓瘤细胞中只有D途径，没有S途径，但能 骨髓瘤细胞中只有D途径，没有S途径， 不断分裂增殖。 不断分裂增殖。 你想到筛选杂交瘤细胞的方案了么？ 你想到筛选杂交瘤细胞的方案了么？
单克隆抗体
1.概念： 概念： 概念 单个B淋巴细胞经过无性繁殖 克隆）， 淋巴细胞经过无性繁殖（ 由单个 淋巴细胞经过无性繁殖（克隆）， 形成基因型相同的细胞群 基因型相同的细胞群， 形成基因型相同的细胞群，这一细胞群所 产生的化学性质单一 化学性质单一、 产生的化学性质单一、特异性强的抗体 称为单克隆抗体 单克隆抗体。 称为单克隆抗体。 2.特点： 特点： 特点 特异性强、 特异性强、灵敏度高
单克隆确有单个细胞克隆的含义， 单克隆确有单个细胞克隆的含义，只不过克隆的 确有单个细胞克隆的含义 不是B淋巴细胞 而是杂交瘤细胞。 淋巴细胞， 不是 淋巴细胞，而是杂交瘤细胞。
科勒
米尔斯坦
荣获1984 荣获1984年诺贝尔生理学或医学奖 1984年诺贝尔生理学或医学奖
4、单抗隆抗体的应用
①作为诊断试剂
单克隆抗体
温故知新：
• 1.细胞工程的两大类型？各自的技术手段及 细胞工程的两大类型？ 细胞工程的两大类型 其原理是？ 其原理是？ 2.核移植的两大类型？其中提供细胞质 核移植的两大类型？ 核移植的两大类型 的为去核的卵母细胞 为什么选去核的 去核的卵母细胞， 的为去核的卵母细胞，为什么选去核的 卵母细胞？ 卵母细胞？
③用于治疗疾病和运载药物
制成生物导弹 将药物定向带到癌细胞所在的位置， 制成生物导弹，将药物定向带到癌细胞所在的位置， 生物导弹， 在原位杀死癌细胞，疗效高、副作用小。 在原位杀死癌细胞，疗效高、副作用小。 “生物导弹”＝单克隆抗体＋药物 生物导弹” 单克隆抗体＋ 生物导弹 导向 杀死癌细胞
单克隆抗体的制备 怎样获得能分泌专一抗体的B淋巴细胞？ 1、怎样获得能分泌专一抗体的B淋巴细胞？
单克隆抗体的优点： 单克隆抗体的优点： 特异性强，灵敏度高，并可以大量制备。 特异性强，灵敏度高，并可以大量制备。
单 克 隆 抗 体 的 制 备 过 程 ：
动物 细胞
经过免疫的 经过免疫的 B淋巴细胞 诱导细胞融合 动物 细胞 融合
骨髓瘤 细胞
杂交细胞 第一次筛选 杂交瘤细胞 第 次筛选 次筛选 特异性杂交瘤细胞
• 动物细胞工程： 动物细胞工程： • 动物细胞培养（细胞增殖） 动物细胞培养（细胞增殖） • 核移植（动物细胞核的全能性） 核移植（动物细胞核的全能性） 动物细胞融合（细胞膜的流动性） 动物细胞融合（细胞膜的流动性） • 单克隆抗体 • 细胞膜的流动性、细胞增殖） （细胞膜的流动性、细胞增殖）
传统的抗体生产方法及缺陷
用于体外诊断人类和动植物疾病及病原鉴定，纯度高、 用于体外诊断人类和动植物疾病及病原鉴定，纯度高、 特异性强，具有准确 高效、简易、快速的优点 准确、 的优点。 特异性强，具有准确、高效、简易、快速的优点。
②定位诊断肿瘤、心血管畸形等疾病 定位诊断肿瘤、
利用同位素标记单抗，在特定组织成像 利用同位素标记单抗，
②再筛选出能分泌所需抗体的杂交瘤细胞 再筛选出能分泌所需抗体的杂交瘤细胞 通常采用有限稀释法 通常采用有限稀释法，将筛选出来的杂交瘤 有限稀释法， 多孔细胞培养板上培养 细胞多倍稀释，接种在多孔细胞培养板上培养， 细胞多倍稀释，接种在多孔细胞培养板上培养， 使每孔细胞不多于一个 使每孔细胞不多于一个，再由这些单细胞克隆生 不多于一个， 长，然后检测各孔上清液中细胞分泌的抗体，那 然后检测各孔上清液中细胞分泌的抗体， 些上清液可与特定抗原结合的培养孔为阳性孔 些上清液可与特定抗原结合的培养孔为阳性孔。 阳性孔。 最终选出分泌预定特异抗体的杂交细胞株进行扩 大培养。 大培养。
在培养基中加入氨基嘌呤 收集增殖细胞！ 在培养基中加入氨基嘌呤，收集增殖细胞！ 嘌呤， 3种杂交细胞：①B-B融合细胞、②杂交瘤细胞 种杂交细胞： 融合细胞、 ③瘤-瘤融合细胞 未融合的细胞： 单个的B细胞、 未融合的细胞：④单个的B细胞、⑤单个的骨髓瘤细胞
这五种细胞中， 这五种细胞中， ① ④没有分裂能力，逐渐衰老死亡； 没有分裂能力，逐渐衰老死亡； ③ ⑤的DNA复制只有D途径， DNA复制只有 途径， 复制只有D 加入氨基嘌呤后，使 D 合成途径阻断，也逐渐衰老死亡， 加入氨基嘌呤后， 合成途径阻断，也逐渐衰老死亡， 但②的DNA复制有D、S两条途径，虽然D途径被氨基嘌呤阻断， DNA复制有 复制有D 两条途径，虽然D途径被氨基嘌呤阻断， 但是还可以通过 S 途径进行DNA的复制，使细胞有分裂能力。 途径进行DNA的复制，使细胞有分裂能力。 的复制
体积大，易操作； 体积大，易操作； 含有使细胞核的全和方法？ 动物细胞融合的实质，原理和方法？ 动物细胞融合的实质 融合后的细胞叫？ 融合后的细胞叫？
• 植物细胞工程： 植物细胞工程： • 植物组织培养（细胞的全能性） 植物组织培养（细胞的全能性） • 植物体细胞杂交 • （细胞的全能性、细胞膜的流动性） 细胞的全能性、细胞膜的流动性）