呼吸道病原体分子诊断技术研究进展

第37卷第12期 河 北医科大学学报2016 年 12 月JOURNAL OF HEBEI MEDICAL U N IVERSITY V o l.37 No.12Dec.2016•1485••综 述•呼吸道病原体分子诊断技术研究进展邸红芹、王晓玲2(综述），王亮3,张辉4**(审校）(1.河北省胸科医院检验科，河北石家庄〇50041;2.河北省唐山市丰润区第二人民医院检验科，河北唐山064000;3.河北省胸科医院呼吸内科，河北石家庄050041 河北省胸科医院办公室，河北石家庄050041)[关键词]呼吸道感染;病原体；分子生物学诊断技术[中图分类号]R517.6 [文献标志码]A呼吸系统是人体各个系统中与外环境接触最频 繁的系统之一，在一些较差环境中很容易导致呼吸 道感染，呼吸道感染也是临床上最常见的感染性疾 病[1]。

呼吸道感染性病原体来源多样，包括病毒、细菌、衣原体和支原体等，并且传播迅速，临床表现相 似，单从临床表现很难区分感染病原体，易造成误 诊、贻误病情和抗生素滥用[2]。

传统的检测方法有 病原体分离培养法和免疫检测法，由于其操作过程 繁琐、灵敏度低以及检测时间较长，无法满足快速诊 断的要求。

近年来，随着分子生物学的发展，检测病 原体的方法也在不断进步，为临床呼吸系统疾病的 诊断和治疗提供了很大的帮助。

现就呼吸道病原体 的分子生物学检测方法及研究进展综述如下。

1聚合酶链反应（polymerase chain reaction,PCR)P C R技术是近年来广泛用于临床病原体检测 的一种有效手段，是PE Cetrus公司于1985年开发 的一种体外快速扩增目的片段的专利技术，该方法 特异、灵敏、快速且可使某些不能分离培养或难以培 养的病原体得以鉴定[3_4]。

随着P C R技术的发展，多重和实时荧光定量技术不断应用于呼吸道病毒的 检测，使病原体鉴定发展更快。

多重P C R技术即在 单一 P C R体系中加人两对以上特异性引物，能同时 扩增多个靶基因片段，根据不同靶基因片段的大小 判定结果，在~■个反应体系中可问时鉴定多种病原 体。

该方法为定性检测，但快速灵敏、操作简单，适 合于在临床医学领域广泛应用。

M〇等[5]纳人50 例临床样本，采用多重RT-P C R法和荧光定量PCR[收稿日期]2016 —09 —23;[修回日期]2016 —10 —18[基金项目]河北省医学科学研究重点课题（20150147)[作者简介]邸红芹（1973 —），女，河北深泽人，河北省胸科医院副主任检验师，医学硕士，从事临床检验学研究。

* 通讯作者。

E-mail:zhanghui_4081@ d o i：10.396 9/j.issn.1007-3205.2016.12.032[文章编号]1007-3205(2016)12-1485-04法快速筛查甲型H1N1流感病毒、新型甲型流感病 毒和乙型流感病毒，2种方法检测结果一致率为100%。

靶序列富集多重P C R技术（Tem-PCR)，针 对目的基因设计两对特异的巢式引物，经过富集、加 标签和扩增3个阶段，能够在同一体系中快速、特异 和高通量地诊断多种呼吸道病原体。

Hassoun等[6]采用Tem-P C R技术检测22种常见呼吸道病毒及 19种细菌，该实验纳人了 200份咽喉拭子标本（冬 季和夏季各1〇〇份），冬季收集的标本中，单一病毒 和细菌感染的标本分别为11份和34份，其中检出 率最高的有耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、莫拉菌和 冠状病毒;夏季收集的标本中有37份样本存在至少 一种细菌感染，4：份样本存在多种病毒感染，其中检 出率最高的有耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和肺炎克 雷伯囷。

多重实时荧光定量PCR(MRT-PCR)技术为多 重P C R与荧光定量P C R相结合，实现了单一体系 中多种病原体的并行定量检测，可用于病原体的快 速初筛及预防医学的健康人群体检。

向蕾等[7]根据 4种呼吸道病毒（人腺病毒、人博卡病毒、人偏肺病 毒及热呼吸道合胞体病毒）的保守序列建立多重荧 光P C R快速检测体系，体系优化后，检测灵敏度为10 copies/juL，对临床样本检测的特异度为100%，表明该体系可以快速准确地检测这4种呼吸道病 毒，且重复性良好，特异度高。

王玉月等[8]探讨 MRT-P C R在9种常见呼吸道病原体检测中的价 值，该研究纳人了 204例临床标本进行回顾性检测，包括副流感病毒1、2、3型，以及肺炎支原体、肺炎衣 原体、甲型流感病毒、乙型流感病毒、腺病毒、呼吸道 合胞体病毒。

实验结果显示MRT-P C R的最低检 出限为1〇3copies/m L，特异度达100%，无交叉反 应，且检测结果与其他试剂报告结果完全一致。

表 明MRT-P C R具有快速、准确、特异度高等特点，在 呼吸道病原体检测方面有重要价值。

•1486•河北医科大学学报第37卷第12期2基因芯片技术基因芯片技术基于DNA/R N A分子杂交原理，靶序列能与固定在不同材料上的寡核苷酸片段相配 对，同时借助一定的荧光检测系统检测待测标记样 品的杂交信号，并通过计算机系统对交信号进行分 析和处理，从而快速得出待测品的基因序列及表达 的信息。

芯片技术在各种病原体的高通量检测及基 因分型领域有广泛的应用，主要包括传统的固相芯 片、液相芯片及微流控芯片。

2.1固相芯片传统的固相芯基于DNA/R N A杂 交技术，根据病原体序列设计特异的寡核苷酸单链 点样于微阵列芯片上，提取待测样本的核酸，经体外 扩增、探针标记和靶序列杂交3个步骤处理，最后根 据荧光信号判定检测结果。

此外，根据通量的需求，固相芯片技术可与多种技术联合建立快速、高通量 和自动化的检测平台，如ArrayTube™ (A T，Germany)系统是基于多重P C R技术而建立的一种 新型的酶标记、低密度、低消耗的芯片M;FilmArray 分子诊断平台是集提取、扩增、产物处理及数据分析 为一体的全自动检测系统，且在1h内可完成检测，该平台已通过F D A认证，用于检测15种呼吸系统 病毒和几种呼吸道病原菌[1°]。

最近，基于扩增子拯 救P C R技术（Arm-PCR)的iCubate检测系统已经 上市，该技术克服了多个靶点扩增条件不兼容，并创 新性设计了一次性全封闭卡盒，以及配套的卡盒处 理仪、阅读仪及控制软件。

目前，该平台已开发出包 括呼吸道病原体V组（20种）、呼吸道病原体B组 (9种）、流感病毒分型（8种）、医院获得性病原体（14 种）、分枝菌属（13种）及葡萄球菌（9种）等多重 P C R检测试剂盒。

iCubate全自动多重微生物核酸 检测系统具有多重、自动、封闭、快速、随机、灵敏等 技术特点，适合应用于疾病预防控制机构、出人境检 验检疫部门，用于开展病原体筛查、院内感染监测、环境监测、检验检疫工作、食品卫生检验工作，还适 用于遗传病基因突变检测、m R N A和m iRN A表达 图谱研究、免疫组库多样性分析等诸多领域。

2.2液相悬浮芯片液相芯片（悬浮阵列芯片）技 术是一种以荧光编码微球为核心，可以同时标记 100种不同比例颜色配置的荧光微球，应用激光检 测和流式细胞仪实现高分辨率和自动化，具有高灵 敏度、高通量和并行检测等特点；在核酸研究方面，常用于单核苷酸多态性基因分型、遗传疾病筛选、基 因表达分析，以及微生物检测分析，其代表技术为 Luminex公司研制的x M A P技术[11]。

目前，基于 xM A P技术和Luminex仪器，开发了 3种商业化诊断试剂盒：Luminex公司基于耙位特异性引物延伸 技术研发的x T A G试剂盒，该试剂盒已获F D A认 证(为多种呼吸道病毒诊断试剂盒）；凯杰公司开发 的与x T A G原理类似（靶位特异性延伸技术）的ResPlex试剂盒；EraGene公司基于耙序歹!J富集多 重P C R技术开发出来的MultiCode-PLx R V P试剂 盒[12_13]。

这些试剂盒使用便捷且具有较高的灵敏 度，但它们都是开放性平台，易于产生污染，同时靶 序列多重P C R扩增限制了单管反应检测的病原数 量[14]。

2.3微流控芯片20世纪90年代，微全分析系统 的出现，通过化学分析将设备微型化与集成化，最大 限度地将分析实验室的功能转移到便携的芯片中，实现“芯片实验室”的构想。

微流控分析芯片通过微 机电加工技术将整个实验室的功能，包括采样、稀 释、加试剂、反应、分离、检测等集成在几平方厘米的 微流控芯片上，且可多次使用，因而极大地减少了样 品和分析试剂的用量，降低了分析的成本，加快了分 析的速度，具有广泛的适用性。

文小霞等[15]运用微 流控芯片分析方鉴定多重细菌，细菌进样、培养和鉴 定都在芯片上实现，同时结合培养池阵列的空间分 辨力以及菌种特异性显色培养基的颜色分辨力实现 多重细菌检测；该实验采用4种常见泌尿系统感染 病原菌作为模拟测试对象，结果显示该方法在15 h 内可完成细菌鉴定，检测限可达10 cfu/mL;此外，临床样本分析表明，该方法可以实现4种细菌同步 鉴定，与传统方法相比符合率为96.3%。

这种微流 控细菌鉴定方法简便快速，有望发展成为细菌检测 的有力工具。

3核酸恒温扩增技术核酸恒温扩增技术是一种新型的体外核酸扩增 技术，其扩增反应始终在一个温度下进行，反应快 速、操作简便、检测灵敏度高，在呼吸道病原体检测 方面环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification，L A M P)、依赖核酸序列等温扩增(nuclear acid sequence-based amplification, NASBA)禾口森巴（simple amplification based assay, SAMBA)等恒温扩增技术运用较为广泛[16]。

L A M P技术是一种基于链置换酶扩增核酸等 温扩增技术，能特异、高效、快速地扩增DNA，适宜 病原体的快速分子生物学诊断，该技术在2000年由 Notomi等报道。

罗思思等™基于L A M P技术建 立了禽流感病毒H7亚型和N9亚型的快速检测方 法，结果显亦该体系在63 C反应1h就g旨特异地检 测禽流感病毒H7亚型和N9亚型，对其他亚型禽河北医科大学学报第37卷第12期•1487•流感均无扩增，且最低检测限为10 copies/juL。

刘 毅等[18]选择121例临床疑似结核患者痰液标本，建 立L A M P检测体系并评价其检测能力，其特异度为 92.16%，灵敏度为87.14%。

表明该方法能够快速 准确地检测结核分枝杆菌，适于基层医院结核病诊 断的推广和应用。