应斌武教授-结核病的分子诊断技术进展
(仅供参考)结核病的分子诊断技术进展
国际上较为成熟的IGRAs有两种
结核感染T细胞免疫检测
全血检测
ELISA对全血中致敏T细胞再次 受到结核特异性抗原刺激后所释 放的IFN-γ水平进行检测。
均为结核菌 RD1区基因 编码的抗原
多肽，主要 包括ESAT-6 和CFP-10
结核感染T细胞检测
细胞检测
ELISPOT在结核菌特异性抗原刺 激下, 测定外周血单个核细胞中 能够释放IFN-γ的效应T细胞数量。
三、诊断技术发展的多元化
诊断技术便捷化 检测样本多样化 技术产品本土化 测序技术和数据平台
诊断技术便捷化
GeneXpert Omni
全自动分子诊断POCT系统，为患者提供真正的即时床旁检测 轻便易携带（高23cm,重1kg）,方便在全球范围内推广 采用电池供电，需联网使用，涉及数据所有权 单盒式测试，一次只能检测一个样本 2015年AACC会议上亮相，预计2017年第3季度正式发布
DNA作为分子诊断靶标的技术
2.环介导恒温扩增 LAMP 技术
原理
针对靶基因的6个区域设计4 条特异引物，利用链 置 换 DNA 聚 合 酶 在 等 温 条 件 (63-65℃) 下 30-60 min，即可完成核酸扩增
特点
不需双链DNA先变性成单链 扩增反应在等温下可持续进行 扩增效率高，15min-1h内实现109-1010倍的扩增 对 DNA 的扩增不需要热循环仪器。 当模板为RNA时，仅需加入逆转录酶即可与DNA一样扩增
Sanger 测序
① PCR扩增待测耐药基因，对产物纯化之后测序，与其标准株的 同一
片段比较异同 ② 作为耐药突变分子生物学检测技术的金标准，能确定突变碱基的位置、 类型性质 ③ 操作繁琐，费用昂贵，多用于评价其他检测方法
重视分子病理诊断新技术提高结核病病理学诊断水平
重视分子病理诊断新技术提高结核病病理学诊断水平车南颖中国是结核病高负担国家，在结核病诊断中面临很多问题。
分析2018年WHO发布的全球结核病报告中国结核病诊断在以下3个方面需要继续加强：(1)肺结核细菌学确诊率低，仅为31%,远低于世界平均水平57%；(2)耐药结核病发现率低，不到20%耐多药或利福平耐药患者被发现；(3)肺外结核发现率低，全球报告的结核病患者中15%为肺外结核，但中国报告的肺外结核患者仅占5%。
病理学是诊断结核病的重要途径，在疑难性结核病，尤其在菌阴肺结核(痰涂片及培养阴性)及肺外结核的诊断中发挥着非常重要的作用。
近年来，分子病理学新技术发展迅猛，结合传统病理学可以做到确诊结核病、鉴别诊断结核病与非结核分枝杆菌病，以及诊断耐药结核病，为解决以上3个结核病诊断所遇到的突岀问题提供了新的途径。
如何将这些新技术应用到临床实际工作中，提高疑难性结核病的诊断水平是摆在我们面前的重要问题。
1病理学诊断结核病的方法及标准•M病理学诊断结核病的主要方法病理学诊断结核病的主要方法包括常规病理学、特殊染色、免疫组织化学染色,以及分子病理学等。
2017年发表的《中国结核病病理学诊断专家共识》p,(以下简称“《共识》”)，对上述4种方法的原理、特点及注意事项等做了详细的介绍。
1.1.1常规病理学：常规病理学通过大体和镜下观察组织细胞的病理形态学变化进行诊断，具有针对性强、准确性高等特点。
对结核病与其他一些非肉芽肿性疾病(如肺结核与肺癌)的鉴别诊断具有很好的优势「但肉芽肿或坏死等结核病常见的病理改变亦可出现在其他感染性和非感染性肉芽肿性病变中DT,《共识》中明确指出常规病理学诊断手段不能作为诊断结核病的金标准，必须通过其他方法找到明确的结核病病原学依据方可确诊。
1.1.2特殊染色：特殊染色中，抗酸染色是病理科最为常用的查找抗酸杆菌的方法，对于诊断结核病有非常重要的作用。
需要注意的是，抗酸染色无法鉴别结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌，而且除了分枝杆菌外其他一些种属的细菌也可呈抗酸染色阳性151,因此抗酸染色阳性并不能确诊结核病，形态典型的情况下只能诊断分枝杆菌病。
结核病分子病理学诊断技术临床应用进展
结核病与胸部肿瘤2019年第1期Tuber&ThorTumor,Mar2019,No.l•73••综述•结核病分子病理学诊断技术临床应用进展宋妹车南颖结核病(tuberculosis,TB)已经存在数千年.仍然是全球十大死因之一，死亡率在传染性疾病中排名第一，严重威胁人类健康⑴。
病理学是诊断结核病的重要途径.尤其在痰菌阴性肺结核和肺外结核等疑难患者的诊断中发挥了重要作用⑵。
传统的结核病病理学诊断主要依靠常规病理学及抗酸染色，可与其他常见的肿瘤和感染性疾病进行鉴别⑴；但与其他一些肉芽肿性疾病，例如非结核分枝杆菌(non-tuberculous mycobacteria,NTM)病的鉴别诊断中遇到很多困难。
随着分子生物学与病理学的相互交叉渗透，20世纪70年代利用分子生物学技术研究疾病病因、发病机制、形态变化及功能损伤规律的新分支学科——分子病理学诞生闵。
近年来，分子病理学技术发展迅速；在2017年发表的《中国结核病病理学诊断专家共识》中提出，分子病理学检测是病理学确诊结核病的主要依据。
分子病理学可以有效解决结核病与NTM病的鉴别诊断，以及耐药结核病的诊断等传统病理学所无法完成的难题I4)o 笔者从分子病理学诊断结核病、NTM病及耐药结核病等3个方面对近几年分子病理学诊断技术在临床中的应用进展做一简要综述。
1分子病理学诊断结核病TB的早期诊断是临床治疗的关键，分子病理学技术是诊断TB快速、有效的方法。
随着分子生物学技术的不断发展，新的PCR及其衍生技术的应用，进一步提高了TB病理学诊断的敏感度和特异度。
1.1常用PCR技术PCR是一种体外扩增特异DNA片段的技术，可在短时间内将一个或几个结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)DNA 拷贝扩增到百万数量级。
为了提高PCR诊断的敏感度和特异度，基于普通PCR的新型分子诊断技术大量涌现。
实时荧光定量PCR(real-time fluorescent quantitative PCR,RT-qPCR)通过对PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时监测实现对起始模板定性及定量的分析；巢式PCR通过设计“外侧”、“内侧”两对引物进行2次PCR扩增，提高了微量靶序列检岀的敏感度和特异度。
分子生物学技术在结核病诊断中的应用分析
分子生物学技术在结核病诊断中的应用分析摘要：目的对分子生物学技术在结核病诊断中的应用实施分析。
方法本次研究中共计选择了2020年1月至2020年12月期间在我中心初诊为肺结核疑似病例或临床病例的371例患者为对象，371例患者均为痰涂片阴性病例，对其全部开展DNA实时荧光恒温扩增检测和交叉引物恒温扩增检测技术和改良罗氏培养进行诊断。
结果所有参与本次研究的371例初诊为肺结核疑似病例或临床病例，通过DNA实时荧光恒温扩增检测和交叉引物恒温扩增检测技术进行诊断之后，最终有63例患者确诊为分子生物学阳性病例、47例为培养阳性病例。
DNA实时荧光恒温扩增检测和交叉引物恒温扩增检测阳性率比涂片镜检和改良罗氏培养更高。
结论在对肺结核疑似病例或临床病例实施诊断期间，对患者采取实时DNA实时荧光恒温扩增检测和交叉引物恒温扩增检测具有比较高的诊断效果，值得推广。
关键词:分子生物学技术；结核病；诊断；价值结核病是由结核分枝杆菌感染引起的慢性传染病,是全球最具威胁的传染病之一。
据世界卫生组织统计,我国患结核病人数居世界第2位,是全世界22个结核病流行严重的国家之一[1]。
结核病实验室检查是结核病诊断、治疗方案制定和治疗效果评估的重要依据。
目前我国大多数实验室广泛采用细菌学检查方法,包括抗酸杆菌痰涂片镜检和分枝杆菌分离培养。
涂片检查简便、易行,但阳性检查率较低[2];分离培养法是目前结核病诊断的金标准,具有很高的灵敏度,但至少需要3~8周的时间,但耗时较长,不能满足结核病早期诊断的要求。
随着分子生物学的发展,近年来涌现出很多方法用于结核分枝杆菌的快速诊断及鉴定[3]。
本文正是基于此，选择了2020年1月至2020年12月期间在我中心初诊为肺结核疑似病例或临床病例的371例患者为对象，对分子生物学技术在结核病诊断中的应用进行分析，具体的研究情况报道如下。
1资料与方法1.1一般资料本次研究中共计选择了2020年1月至2020年12月期间在我中心初诊为肺结核疑似病例或临床病例的371例患者为对象，对所有患者共计742份痰标本进行诊断。
分子诊断技术的最新进展
分子诊断技术的最新进展分子诊断技术是当今医学领域中最为热门的研究方向，也是未来医疗发展的一个重要方向。
该技术可以通过检测和分析体内的分子物质，为疾病的早期诊断和治疗提供了可能。
在最近的几年里，分子诊断技术得到了快速发展，不断涌现出新的技术和方法，为我们开启了新的窗口。
本文将以该领域的最新进展为主题，并从多个角度介绍它的研究方向及未来趋势。
一、NGS技术+全基因组测序随着NGS技术的不断成熟，全基因组测序在分子诊断领域得到了广泛的应用。
在疾病的诊断和治疗中，全基因组测序可以快速而准确地确定患者的基因组序列，为分子诊断提供了更为精确的参考。
当前，在全基因组测序领域最为注目的是单细胞测序技术，它可以实现对单个细胞的基因组测序。
可用于检测早期肿瘤的突变，还可用于个体化医学，为不同患者提供不同的治疗方案。
二、CRISPR-Cas9CRISPR-Cas9技术是当前最具热门的基因编辑技术之一，是一种基于RNA的程序化核酸切割工具。
该技术可以快速而准确地定位并切割DNA序列，从而在基因水平上实现对疾病的治疗。
该技术可以用于修复有缺陷的基因，防止遗传疾病的传播，甚至在对抗癌症等方面具有潜力。
目前，CRISPR-Cas9技术正在经历着从实验室研究到临床试验的转变。
值得一提的是，文献报道了利用该技术可以将异常细胞的基因修正为正常细胞，从而制造一种自我改善的生物体。
三、芯片技术芯片技术是一种将分子生物学、电子技术和计算机技术相结合的技术，其主要功能是将分子物质固定在特制的微型管壁上，以实现分子的快速检测和分析。
芯片技术可以通过微型反应腔的灵活设计，将多个生物分子相互干扰的反应隔离开，以更加精确地检测和分析生物分子的性质。
四、蛋白质组学技术除了基因组学技术外，蛋白质组学技术也是目前研究最为活跃的分子诊断技术之一。
该技术以质谱为核心，通过检测和分析蛋白质的性质，从而探索其在疾病诊断和治疗中的应用。
可用于分离蛋白质，鉴定其分子量和特定的质量分子以获得蛋白质的序列信息，从而获得更多关于蛋白质功能和性质的研究。
基于分子诊断技术的肺结核病治疗研究
基于分子诊断技术的肺结核病治疗研究肺结核是一种常见的细菌性传染病，其病原菌为结核分枝杆菌。
随着科技的不断发展，分子诊断技术已经成为肺结核病治疗研究的重要手段之一。
本文将从分子诊断技术在肺结核病治疗方面的应用以及分子诊断技术的展望两方面来探讨这一话题。
一、分子诊断技术在肺结核病治疗中的应用分子诊断技术是指利用生物学和生化学的基础研究结果，将特定分子的特征和变化作为诊断肺结核病的指标的技术。
与传统的肺结核病诊断方法相比，分子诊断技术具有高度敏感性、特异性、快速性和准确性等优点，因此在肺结核病治疗中的应用越来越广泛。
1. 分子诊断技术在肺结核病诊断中的应用传统的肺结核病诊断方法包括：临床症状和体征、痰液涂片和培养、胸部X线检查和结核菌素试验等。
但这些方法存在着一定的局限性，在诊断准确性和时间效率上都较为受限。
而分子诊断技术可以通过检测肺结核病患者血液、痰液、尿液等样本中的结核菌DNA、RNA分子，更快速、更敏感地检测出病原体，提高了肺结核病的诊断准确性。
2. 分子诊断技术在肺结核病治疗中的应用分子诊断技术在肺结核病治疗中的应用不仅限于病原体检测，还包括疗效评估、药物敏感性检测等方面。
相比传统的疗效评估方法，如痰涂片和培养检测，分子诊断技术可以在治疗后更快速、更准确地评估患者的疗效。
同时，在药物敏感性检测方面，分子诊断技术也可以更快速、更准确地检测出患者对结核病特定药物的敏感性。
二、分子诊断技术在未来肺结核病治疗中的展望分子诊断技术的发展趋势是将其应用于肺结核病的个性化治疗中，实现精准诊断和个性化治疗。
同时，分子诊断技术也在朝着更快速、更准确、更经济的方向发展。
1. 个性化治疗个性化治疗是针对不同患者采用不同治疗方法的治疗方式。
目前，结核病患者的治疗方案存在着“一刀切”的情况，不同的患者采用相同的治疗方案，因此治疗效果也会存在差异。
而分子诊断技术可以根据患者病原体的对药物的敏感性，为患者个性化选择治疗方案，提高治疗效果，降低治疗时间和费用。
分子诊断技术在感染性疾病诊断中的应用前沿
分子诊断技术在感染性疾病诊断中的应用前沿随着科技的不断进步，分子诊断技术在感染性疾病的诊断中扮演着越来越重要的角色。
分子诊断技术通过检测人体内的特定基因、蛋白质以及其他分子标志物，能够准确、快速地诊断出感染性疾病，为临床治疗提供及时有效的指导。
本文将介绍分子诊断技术在感染性疾病诊断中的应用前沿。
一、分子诊断技术简介分子诊断技术是一种利用分子生物学和生物化学的方法进行疾病检测和诊断的新兴技术。
它利用了人体内微量的分子标志物，如DNA、RNA、蛋白质等，通过特定的实验方法进行检测，从而准确地诊断出感染性疾病。
在感染性疾病的诊断中，传统的方法往往需要培养和鉴定病原微生物，操作繁琐、耗时且存在很大误差。
而分子诊断技术则能够通过直接检测病原微生物的核酸或蛋白质等标志物，极大地提高了诊断的准确性和快速性。
二、PCR技术的应用聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是目前应用最广泛的分子诊断技术之一。
PCR技术通过扩增病原微生物的DNA片段，能够在非常短的时间内获得大量特定的基因组DNA。
在感染性疾病的诊断中，PCR技术被广泛应用于包括呼吸道感染、血液感染、泌尿道感染等在内的多个领域。
例如，在呼吸道感染的诊断中，通过采集患者的呼吸道标本，利用PCR技术快速检测出病原微生物的核酸，可以准确地确定感染性病原体，从而指导治疗方案的选择。
PCR技术的快速性和准确性为感染性疾病的早期诊断提供了重要的手段。
然而，PCR技术在一定程度上存在着对特殊设备和操作技术的依赖，同时也容易受到样品质量和操作误差的影响。
三、下一代测序技术的发展随着生物技术的不断发展，下一代测序技术（Next Generation Sequencing，NGS）逐渐兴起并广泛应用于感染性疾病的诊断中。
NGS 技术能够快速、准确地测序全基因组的DNA或RNA，不受研究对象的限制。
在感染性疾病的诊断中，NGS技术能够对患者样本中的全部基因组进行测序，并通过比对分析找出病原微生物的基因组序列，从而实现全面的病原微生物检测和鉴定。
分子生物学技术在结核病诊断中的应用分析
分子生物学技术在结核病诊断中的应用分析摘要目的:分析研究分子生物学技术聚合酶链反应(PCR)对结核病检测的临床应用,并对其应用进行方法学评价。
方法:采用分子生物学技术体外核酸扩增聚合酶链反应对临床疑似结核病标本进行结核分枝杆菌检测。
结果:分子生物学技术聚合酶链反应对临床标本可以明确区分结核杆菌与其它分枝杆菌和一般呼吸道微生物,能从含有大量人类核酸和其它分枝杆菌的标本中检测到结核杆菌,实验快速,整个实验在一天完成,灵敏度高特异性强。
结论: 分子生物学技术聚合酶链反应对结核病的临床诊断是一项敏感性高,特异性强,简便快速等特点的诊断技术,对结核病的诊断具有较高的临床意义。
关键词结核病;结核分枝杆菌;聚合酶链反应20世纪90年代,全球多数发达国家结核病疫情出现明显回升,许多发展中国家出现结核病疫情严重加剧,结核病已成为全球最紧迫的公共卫生问题,目前世界上没有任何一个国家能逃脱结核病的威胁。
每年全世界约有800万新发病人,约300万人因结核病而死亡。
我国的情况也是如此,据2000年第四次全国结核病流行病抽样调查表明,我国结核病的形势仍然十分严峻。
结核病流行病学显示高患病率、高耐药率、低递降率等特点[1]。
因此快速准确的诊断是控制结核病的主要条件,我们对使用分子生物学技术聚合酶链反应在结核病实验室的诊断做了一些分析研究。
1材料仪器与试剂:广州达安基因生物公司DA-7600荧光定量核酸扩增仪和结核分枝杆菌检测试剂盒。
2方法2.1标本采集和处理2.1.1标本的采集和液化用一次性痰液收集器采集,最好留取早晨第一口痰液。
痰液收集后应尽快送检。
在痰液标本中加入4倍体积的4%NaOH溶液,吹打均匀后室温放置30分钟使之液化。
2.1.2 1×TE溶液配制吸取1ml20×TE,溶于19ml去离子水中,混匀即可。
2.1.3标本及质控标准品的处理取0.5ml液化痰液至1.5ml离心管中,再加入0.5ml4%NaOH室温放置10分钟后15000rpm离心5分钟,吸弃上清,在沉淀中加无菌生理盐水1ml打匀,15000rpm离心分钟,吸弃上清:再重复洗涤一次。
结核病分子诊断技术的开发与应用
结核病流行病学研究
追踪Байду номын сангаас染源
利用分子诊断技术对结核分枝杆菌进行 基因分型，追踪结核病的传染源和传播 途径，为疫情防控提供科学依据。
VS
研究菌群演变
通过分析不同地区、不同时间段结核分枝 杆菌的基因序列差异，研究菌群演变规律 和传播特点，为制定防控策略提供数据支 持。
04 结核病分子诊断技术的挑 战与展望
临床挑战
01
02
03
早期诊断
结核病早期感染时菌量较 低，传统诊断方法阳性率 较低，需要分子诊断技术 提高早期诊断的准确率。
无症状感染者诊断
部分结核病患者无明显症 状，通过分子诊断技术发 现无症状感染者，以控制 结核病的传播。
监测治疗效果
分子诊断技术可用于监测 结核病患者在治疗过程中 的病情变化，为指导治疗 方案提供依据。
一种在等温条件下进行的核酸扩增方法，具有简单、快速、特异性强等特点，适用于基层医疗机构的结核病诊断 。
微流控芯片技术
将PCR扩增、检测等步骤集成在微流控芯片上，实现样品的快速处理和自动化检测，提高诊断效率和准确性。
03 结核病分子诊断技术的应 用
临床样本的检测
检测结核分枝杆菌
利用分子诊断技术，通过检测临床样本中的结核分枝杆菌特 异性基因序列，快速准确地诊断结核病。
区分活动性与非活动性结核
通过分析结核分枝杆菌基因表达的差异，区分活动性结核病 和非活动性结核病，为患者提供个性化治疗方案。
耐药性结核病的检测
检测耐药基因
运用分子诊断技术，直接检测结核分枝杆菌中的耐药基因，快速筛选出耐药性结核病，指导临床合理 用药。
监测药物敏感性
通过定量检测结核分枝杆菌在药物作用下的基因表达变化，实时监测药物敏感性，为临床医生提供调 整治疗方案的依据。
结核诊断新进展：无需找到结核菌也能确诊，分子技术助力结核诊断
结核诊断新进展：无需找到结核菌也能确诊，分子技术助力结核诊断随着科技的进步，所有的临床疾病的诊断已经全面进入分子时代，所谓的分子时代是指利用分子生物技术，寻找疾病极其微量的分子层面的线索，尽量提高疾病的诊断准确性，同时又能增加敏感度，使原来无法诊断或者准确诊断的疾病得到诊断，或者提高准确度，是指得到更好的治疗，比如癌症的诊断已经利用基因检测相关技术进入了精准医疗时代，以前只能做放化疗的病人，如今可以通过基因检测获得靶向治疗等新治疗方法并成功延长生命的机会。
肺结核的诊断也进入了分子时代前天医院内举行了一次呼吸沙龙，与往届不同的是，此次和检验科以及结核科共同举办，会上著名的结核科诊治专家沙巍主任详细的介绍了结核领域诊断和治疗的新方法，重点强调了肺结核的诊治已经进入分子时代，新技术层出不穷，不但有结核的诊治技术进展，也有结核以及肺结核分枝杆菌菌型鉴定进展，部分肺结核患者无需发现完整的结核菌也可以确诊诊断，甚至能够通知得到该结核菌是否对抗结核药物耐药的信息。
X-pert技术助力结核分子诊断新的结核诊治共识中强调结核诊断已经可以通过分子技术获得确诊，如果患者有典型的结核CT表现，即使无法从临床收集到的标本中找到结核菌，也可以通过X-pert技术确诊结核，同时获得是否对利福平耐药的信息，这是一种什么技术呢，为什么如此神奇。
Xpert MTB/RIF检测是一种分子信标检测方法，可用于检测结核分枝杆菌和位于rpoB基因81-bp区域(密码子426-452)的利福平耐药突变，该区域被称为利福平耐药决定区(rifampicin resistance–determining region, RRDR)。
该检测可用于疑似或已接受抗分枝杆菌治疗少于3日的疑似肺结核成人的痰抗酸杆菌涂片阳性或阴性样本(直接或浓缩样本，可为自发产生或诱导)。
Xpert MTB/RIF检测在2011年得到了WHO的批准，并在2013年得到了美国FDA的批准。
浅谈结核病实验诊断技术的新进展
ＴＳ Ｏ ．Ｂ试验是 以特异性抗 原为刺激 源 ， ．Ｐ ＴＴ 应用 酶联免
疫斑点技术诊 断结核感染 的新方法。结核感染后体 内长期存
在抗原特异性 的记忆性 Ｔ细胞 ， 当再次遇到抗原刺激时 ， 能迅 速活化增值 ， 释放 干扰素 。综合上述 原理 ，ａｖｎ 建立了 Ｌｌａｉ 。 以Ｒ Ｉ Ｄ 编码 的结核特异性抗原 ６ｋ Ｄ早期分泌 靶向抗原 （ Ｓ Ｅ— Ａ －） １ Ｋ Ｔ６ 和 ０ ｄ培养滤过蛋 白（ Ｆ 一０ 肽段库为刺激原 ， Ｃ Ｐ１ ） 检测 外周血中结核特异性释放 干 扰素 的 Ｔ淋 巴细胞 ， 从而诊 断 结 核杆菌感染 。其优点 为 ： 实验结 果清晰 ， 于判断。Ｐ ｉ 易 ａ 等 对 近 ３年的 １ ３项研究 进行 Ｍｅ ｔ ａ分析 ， 明 ＴＳ Ｏ —Ｂ的综 表 —Ｐ ＴＴ 合 敏感性为 ９ ％ ， ０ 在免疫力 低下 的人群 中 ， 然能够 维持较 依 高的敏感性 ” 。在肺外结 核 的诊 断中 ，—Ｐ ＴＴ ＴＳ Ｏ —Ｂ也具有较 高的敏感性 。Ｆ ｒ ｒ ｅｒ ａ和 Ｌｅ等报道 的 ２个前 瞻性研究 中 ， ａ ｅ 共 包括 １ ８例 肺 外结 核 患者 ， －Ｐ ＴＴ 阳性率 为 １０ ［９。 Ｔ Ｓ Ｏ —Ｂ ０ ％ ８ｊ ， 同时以 ＴＳ Ｏ —Ｂ为标 准能够 更加准 确地 锁定 需要 预防性 ．Ｐ ＴＴ
酸扩增法。
抗结核治疗 的感染者 。其斑点 数越多 ， 发生活动性 结核 的可
能性越大 ， 时间内斑点数显著增 加 ， 短 则强烈提示体 内结核活 动 ， 时给 予预防性 的治疗 十分必要 。Ｔ Ｓ Ｏ ・Ｂ在 现有结 此 —Ｐ ＴＴ 核诊断方法存在诸多缺陷 的今 天 ， 以给临床 医生 提供有力 可
速、 特异、操作简单 、 无须 昂 贵仪器 等优点 。但 其可 与少数
两种分子检测技术快速诊断肺外结核的研究
两种分子检测技术快速诊断肺外结核的研究肺外结核是指除了肺部以外的部位感染结核杆菌所引起的结核病。
肺外结核不同于肺结核，其临床病症多样，病程复杂，难以诊断和治疗。
传统的结核诊断方法主要是靠症状、体征、痰液涂片和培养等方法，但这些方法存在一定的局限性，如病情复杂时容易漏诊或误诊、诊断时间较长等。
因此，发展一种快速有效的分子检测技术诊断肺外结核具有重要意义。
目前，已发展出许多用于肺外结核的分子检测技术，下面将介绍其中两种主要的研究方法。
第一种是PCR（聚合酶链式反应）技术。
PCR技术是一种在体外复制DNA片段的重要方法，通过扩增病原体的核酸片段，使其达到可以被检测的浓度。
PCR技术能够快速、敏感地检测肺外结核感染，并且可以在早期感染时进行诊断。
此外，PCR技术还可以通过检测结核菌特异性核酸片段的多态性，进行结核病菌株的分型，以及抗结核药物敏感性检测等相关研究。
然而，PCR技术对样本的纯度要求较高，且存在较大的交叉反应的风险。
第二种是免疫分子检测技术，主要包括ELISA（酶联免疫吸附测定）和免疫荧光染色法。
这些技术通过检测结核杆菌特异性抗原或抗体来快速诊断肺外结核。
免疫测定技术具有高效、灵敏、特异性好等特点，能够在早期感染时进行诊断，且能够对结核病菌进行分型和抗结核药物敏感性测试。
免疫测定技术适用于多种临床标本的检测，如血液、尿液、脑脊液等。
然而，免疫测定技术对抗体的选择和不同抗体组合的优化仍然需要进一步研究。
此外，还有一些新兴的分子检测技术也在快速诊断肺外结核的研究中得到应用。
如基于核酸纳米传感器的技术、基于纳米孔技术的技术等，这些技术具有高灵敏度、高特异性、实时检测等特点，有望成为肺外结核诊断的新方法。
综上所述，肺外结核的快速诊断对于及时治疗和控制疾病具有重要意义。
PCR技术和免疫分子检测技术是目前较为常用的方法，但仍然存在一些局限性。
因此，未来应继续开展研究，探索新的分子检测技术，在提高诊断准确性和敏感性的同时，降低检测成本，为肺外结核的早期诊断和治疗提供更好的支持。
结核病的早期诊断与治疗新技术
结核病的早期诊断与治疗新技术结核病是一种由结核杆菌引起的慢性传染病，其早期诊断与治疗对于控制和防止病情进一步恶化至关重要。
近年来，随着科技的不断发展，出现了一些新技术，有助于提高结核病的早期诊断和治疗效果。
本文将介绍几种新技术，并探讨其在结核病防治中的应用前景。
一、基因检测技术基因检测技术是近年来结核病早期诊断的重要突破之一。
传统的结核病诊断主要依靠痰液培养和胸部X光片，但这些方法存在一定的局限性，如培养时间长、敏感性较低等。
而基因检测技术能够检测结核杆菌的DNA，准确快速地判断是否感染结核杆菌。
例如，PCR（聚合酶链反应）技术通过扩增结核杆菌DNA，能够在数小时内得出结果。
此外，核酸杂交试验和线探针杂交试验也是常用的基因检测方法。
这些新技术的出现大大提高了结核病的早期诊断效率，有助于尽早采取治疗措施。
二、放射诊断技术放射诊断技术在结核病的早期诊断中也起到了重要作用。
传统的胸部X光片诊断方法对于结核病的诊断存在一定的局限性，尤其是在肺结核的早期病变上。
而新兴的放射影像技术，如计算机断层扫描（CT）和磁共振成像（MRI），能够更加清晰地观察到病变细节，提高了结核病的早期诊断准确性。
例如，CT技术可以对肺部病灶进行三维重建，有助于更好地评估病情。
此外，正电子发射断层扫描（PET-CT）技术也可以用于结核病的分期和评估治疗效果。
三、药物治疗技术在结核病的治疗方面，药物治疗是最常用的方法。
传统的结核病治疗方案一般采用多种抗结核药物联合使用，但这种方法存在一些问题，如药物副作用大、治疗耐药性等。
近年来，一些新的治疗技术不断涌现，为结核病的治疗带来了新的希望。
例如，利福平（Levofloxacin）和利奈唑胺（Linezolid）等新型抗结核药物的使用，使得多药耐药结核的治疗效果得以提高。
此外，免疫治疗技术也逐渐受到关注，如干扰素和Toll样受体激动剂等，可增强机体免疫力和抗菌能力，有助于提高结核病的治疗效果。
分子生物学技术在结核病诊断及耐药检测中的应用
分子生物学技术在结核病诊断及耐药检测中的应用摘要】结核病是我国重点防治的重大传染性疾病。
目前耐药结核病、流动人口和HIV/TB双重感染已经成为结核病防控所面临的难题，其中结核杆菌耐药性是我国结核病防控中起着非常重要作用的因素。
结核病、耐药结核病的实验室诊断技术相对滞后。
亟需引进新的实验室技术辅助结核病、耐药结核病的诊断。
【关键词】分子生物学；结核病；应用【中图分类号】R52 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2018）26-0069-02Xpert Mtb/RIF技术使用半定量巢氏荧光PCR，该技术针对结核杆菌利福平耐药基因rpoB基因区设定引物、探针，扩增荧光检测，其是否发生基因突变，检测标本中是否含有结核杆菌及是否对利福平耐药，整个实验过程需3小时左右。
线性探针杂交技术（Hain）检测技术直接从临床收集的病人肺部涂片阳性痰标本中提取核酸DNA、用生物素标记的引物进行多重PCR扩增和反向杂交。
通过检测rpoB基因突变（编码RNA聚合酶β-亚单位）确定对利福平的耐药性；通过检测katG基因（编码过氧化氢酶）和inhA基因的启动子区（编码NADH烯酰酸性磷酸酶还原酶）确定对异烟肼的耐药性。
从而，对来自培养物或病人肺部涂片阳性痰标本的结核分枝杆菌复合群及其耐利福平和/或异烟肼耐药基因进行分子生物学检测。
1.资料和方法1.1 标本来源2015年10月至2018年6月期间吉林市结核病防治研究所及所辖各县区结防所收治的疑似结核病患者共1345份痰标本。
1.2 检测方法对1345份痰标本进行荧光染色涂片镜检检测、结核分枝杆菌培养、结核杆菌比例法药敏，相关操作及结果判定。
其操作均按《结核病诊断细菌学检验规程》进行。
临床确诊肺结核病442例，对442例患者痰标本进行Xpert Mtb/RIF检测和线性探针杂交技术（Hain）检测，其操作均按试剂说明书进行。
2.结果2.1 1345例初诊肺结核可疑患者，经X线、CT、实验室检查，临床最终确诊肺结核病442例，确诊率为32.9%。
结核病的分子生物学检测与药物疗效评估
结核病的分子生物学检测与药物疗效评估简介：结核病是一种严重威胁人类健康的传染病，由结核杆菌引起。
传统的结核病诊断方法主要依靠临床表现、X射线检查及培养，但这些方法存在一定的限制。
近年来，随着分子生物学技术的发展，结核病的分子生物学检测方法得到了广泛应用，并为药物疗效评估提供了新思路。
一、分子生物学检测在结核病诊断中的应用1. PCR技术在结核菌检测中的应用PCR（聚合酶链反应）是一种敏感且特异性强的分子生物学技术，能够快速而准确地检测出结核杆菌DNA。
通过PCR检测可以迅速确定结核病阳性患者和阴性患者，并能够对耐药性进行分析。
2. 基于RNA的新型分子生物学诊断方法除了基于DNA的PCR技术外，近年来还出现了基于RNA的新型诊断方法，如reversed transcription loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP)技术。
这种方法不仅具有高度敏感性和特异性，而且能够在室温下进行反应，对于结核病的早期诊断具有很大的潜力。
3. 拮抗试验在结核杆菌检测中的作用拮抗试验是一种通过寻找对某种药物抵抗的细菌株来间接检测细菌存在的方法。
利用这种技术，可以判断出患者体内是否存在耐药性结核杆菌，并能够指导合理选择药物治疗方案。
二、分子生物学评估结核病药物疗效1. 耐药基因检测预测耐药性分子生物学技术可以通过检测结核杆菌中与耐药相关的基因突变来预测患者对某些药物的耐药性。
例如，当发现某个特定基因突变时，就可以判断该患者对某种抗结核药物是否产生耐药性。
2. 荧光素酶活力测定评估抗结核活性分子生物学技术还可以通过测定抑制剂诱导基因表达（LUC）活性来评估患者体内抗结核药物的活性。
这种方法能够提供更加客观和准确的药物疗效评估，从而指导治疗方案的选择。
3. 分子生物学技术在药代动力学研究中的应用药代动力学是研究药物在机体内吸收、分布、代谢和排泄过程的学科。
利用分子生物学技术可以对药物代谢酶作用、激素受体表达以及受体配基互作进行定量测定，评估特定药物在个体水平上的疗效和副作用。
一种结核分枝杆菌复合群快速检测试剂盒及制备方法[发明专利]
![一种结核分枝杆菌复合群快速检测试剂盒及制备方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/736dd9228bd63186bdebbc95.png)
专利名称：一种结核分枝杆菌复合群快速检测试剂盒及制备方法
专利类型：发明专利
发明人：应斌武,柯博文,王睿敏
申请号：CN202010104800.3
申请日：20200220
公开号：CN111269996A
公开日：
20200612
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开了一种结核分枝杆菌复合群快速检测试剂盒，包括鉴别试剂，所述的鉴别试剂包括十对引物中的至少一对与十条探针中的至少一条；本发明还提供了一种结核分枝杆菌复合群快速检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤：S1根据基因库比对结核分枝杆菌复合群基因序列设计各个引物和探针；S2构建出结核分枝杆菌复合群的试剂盒程序；S3针对试剂盒程序的特异性和灵敏性试验；S4对建立的试剂盒程序进行多次重复试验；S5制备标准目的基因池；S6构建高灵敏度的特异性检测试剂盒；本发明的有益效果是：利用本发明所提供的基于特异性引物对和探针的试剂盒，可达到快速、全面检测鉴别结核杆菌，为后面的全面检测提供可能性；利用灵敏性测试、特异性测试和重复性测试，同时对比CT差值，达到快速准确检测。
申请人：四川大学华西医院,成都华西精准医学产业技术研究院有限公司
地址：610000 四川省成都市武侯区国学巷37号
国籍：CN
代理机构：成都时誉知识产权代理事务所(普通合伙)
代理人：李双
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结核病分子诊断研究进展
结核病分子诊断研究进展
梅珍珍
【期刊名称】《湖北科技学院学报：医学版》
【年(卷),期】2017(031)001
【摘要】结核病是威胁人类健康的主要传染性疾病之一,自上世纪50年代抗生素疗法问世后,其发病率和死亡率已显著降低,然而,最近20多年来,结核病疫情大有卷土重来之势,全球的流行形势十分严峻。
及时发现、治疗和隔离患者是控制结核病的有效手段,而结核病诊断是发现和治疗患者的前提。
近些年,分子诊断技术发展十分迅速,为结核病和耐药结核的快速诊断提供了重要手段。
现将目前结核病分子诊断进展介绍如下：
【总页数】5页(P88-92)
【作者】梅珍珍
【作者单位】咸宁市结核病院,湖北咸宁437000
【正文语种】中文
【中图分类】R521
【相关文献】
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结核感染T细胞检测 细胞检测
ELISA对全血中致敏T细胞再次 受到结核特异性抗原刺激后所释 放的IFN-γ水平进行检测。
IGRA
ELISPOT在结核菌特异性抗原刺 激下, 测定外周血单个核细胞中 能够释放IFN-γ的效应T细胞数量。
T-SPOT.TB
IFN-γ是参与结核病发病的一个细胞因子。效应T细胞被近期 暴露的抗原在体外再次刺激后会释放γ干扰素。
四、华西医院结核病诊断的临床应用及研究进展
我院的结核及耐药实验室检测流程
患者临床标本
直接检测 核酸
Ziehl-Neelsen 染色 显微镜检查
MGIT960 液体培养
IGRA
核酸提取 及纯化
AFB阴性
AFB阳性
培养阳性
培养阴性
阴性有排除结 核病的价值 阳性提示结核 感染或结核病
实时荧光 PCR 阴性 阳性
基于TB-DNA的MTB鉴定及分子药敏技术
1. Line probe assays线性探针测定法 Hain（LPA GenoType® MTBDRplus/Rsl）技术
2h
0.5 h
2.5-3 h
WHO建议使用Hain来检测 MDR-TB
基于TB-DNA的MTB鉴定及分子药敏技术 2. Xpert MTB/RIF
Xpert XDR
可以检测异烟肼，氟喹诺酮类药物和二线注射剂的耐药 测定正在开发中，尚未被WHO评估。 初步敏感性和特异性(与测序相比，尚未经同行评议): 异烟肼98.1%，100% 氟喹诺酮95.8%，100% 卡那霉素92.7%，100% 阿米卡星96.8%，100% 预计2018年面世
DNA作为分子诊断靶标的技术
2.环介导恒温扩增 LAMP 技术
原理
针对靶基因的 6 个区域设计 4 条特异引物，利用链 置 换 DNA 聚 合 酶 在 等 温 条 件 (63-65℃) 下 30-60 min，即可完成核酸扩增
特点
不需双链DNA先变性成单链 扩增反应在等温下可持续进行 扩增效率高，15min-1h内实现109-1010倍的扩增 对 DNA 的扩增不需要热循环仪器。 当模板为RNA时，仅需加入逆转录酶即可与DNA一样扩增
EasyNAT™ 结核分枝杆菌核酸检测
用等温交叉引物扩增技术( CPA，中国首个具有自主知识产权的核 酸扩增技术) 进行定性检测结核分枝杆菌，将病原体DNA扩增、核 酸杂交和核酸试纸条检测三种技术有机地融为一体，目标检测结核 分枝杆菌特异性IS6110片段 反应速度快，样本到结果2小时 检测成本低，只需离心机和水浴锅或金属浴 2014年被中国食品药物管理局批准用于检测肺结核
平台缺乏全面自动化
正在进行大规模的多中心评估，预计2017年底上市
检测样本多样化
stool
对于难以咳痰的患者的PTB 诊断，粪便可能是替代样本。
在痰涂片镜检和培养阴性的 HIV感染者的粪便中检测到 结核分枝杆菌
如果痰液不可用，Stool Xpert是疑似结核儿童的潜 在替代筛检。
技术产品本土化
截止到 2014 年末， GeneXpert 已累积生产了 17,883 组模块和 10,013,600 组标本盒，销往 145 个国家和 地区。
GeneXpert残留物进行其它耐药性分析
Xpert测定法处理的样品 残留物可用于PCR，以发 现与MDR和XDR-TB的 其他药物的抗性相关的突 变，无需培养或生物安全 基础设施，特别适合于不 可能进行表型药物敏感性 测试的环境
Truenat MTB
基于芯片的核酸扩增试验，样本在Trueprep-MAG™（电 池供电设备）进行处理，加载到Truenat，在Truelab Uno™ 分析仪（手持式、电池供电式热循环仪）上进行实时PCR。 样本制备到最终报告：<1h Truenat具有防污染/防蒸发设计的反应口，实现核酸隔离
RNA作为分子诊断靶标的技术
2. 恒温扩增检测 SAT 技术
DNA作为分子诊断靶标的技术 1. TB-DNA检测
1. 能稳定检测10 copy 的TB-DNA ，较 灵敏特异 2. 荧光定量PCR检出MTB阳性率显著高 于涂片染色和培养法 3. 早期、快速、准确地诊断结核病
痰液、支气管灌洗液——肺结核 血液——播散性结核和各脏器结核病 脑脊液——中枢神经系统结核病 宫颈/尿道拭子——泌尿生殖结核
Newer iterations of GeneXpert
Xpert MTB/RIF Ultra
手动操作时间：<1分钟
结果：<80分钟
敏感性更高，特别是涂片阴性结核病例 提高利福平耐药检测结果的准确性 改进混合感染的检测
WHO计划在2018年更新关于使用Ultra的政
策建议。
Newer iterations of GeneXpert
Sanger 测序
① PCR扩增待测耐药基因，对产物纯化之后测序，与其标准株的 同一
片段比较异同 ② 作为耐药突变分子生物学检测技术的金标准，能确定突变碱基的位置、 类型性质 ③ 操作繁琐，费用昂贵，多用于评价其他检测方法
焦磷酸测序 Pyrosequencing
一种以检测DNA 合成过程中所产生的焦磷酸（PPi）为基础的实时DNA 测 序技术，操作简单，准确性高，一次完成96 个样品的检测
亚能MTB耐药突变检测
高通量：检测MTB5个耐药基因（rpoB、katG、inhA、embB、
rpsL）的13种突变，结果提示4种一线抗结核药物（利福平、异烟 肼、链霉素、乙胺丁醇）的耐药信息。 快速：检测全程仅需8小时 性能好：检测的特异性达98%，准确性达95%，重复性达99%
测序技术与数据平台
三、诊断技术发展的多元化
诊断技术便捷化
检测样本多样化
技术产品本土化
测序技术和数据平台
诊断技术便捷化
GeneXpert Omni
全自动分子诊断POCT系统，为患者提供真正的即时床旁检测 轻便易携带（高23cm,重1kg）,方便在全球范围内推广 采用电池供电，需联网使用，涉及数据所有权 单盒式测试，一次只能检测一个样本 2015年AACC会议上亮相，预计2017年第3季度正式发布
以半巢式实时定量 PCR 扩增技术为基础，能够自动抽提 DNA 并且
扩增 rpoB 基因。设计五个重叠的分子信标，检测81碱基 rpoB核心
区域所有可能的突变；用不同的荧光基团标记每个分子信标，仅在 一个反应中完成整个检测 2 小时内直接从病人痰液中检测是否有MTB及对利福平的耐药性
整个过程都在一密闭环境中进行，手动操作时间不超过 5 分钟，对
操作者和周围环境安全
2010 年 12 月，WHO 首次发布官方文 件推荐 Xpert MTB/RIF 技术的使用
2013 年，WHO 又再次发文更新了对 XpertMTB/RIF 的推荐意见：
当成人和儿童患者怀疑 MDR-TB 感染或合 并 HIV 感染时，强烈推荐 Xpert MTB/RIF 作为首选检测方法，从而替代传统的涂片镜检， 培养和药物试验的方法。 对疑似肺外结核患者的肺外标本如脑脊液， 淋巴结和其它组织，推荐Xpert MTB/RIF 作 为检测方法。 对于痰涂片检测阴性的患者，推荐 Xpert MTB/RIF 作为后续检测方法。
基于TB-DNA的MTB鉴定及分子药敏技术
3. DNA微阵列芯片
适用范围：MTBC鉴定，TB菌种鉴定， 利福平和异烟肼的耐药检测 分离株或者痰标本均可检测
原理：多重PCR扩增和反向杂交
菌种鉴定试剂盒同时快速检测包括结核 分枝杆菌在内的 17 种MTB
耐药试剂盒能快速检测分离株或者痰样 本的MDR-TB
原理：以rRNA 为靶标，采用线性探针技术检测 结核分枝杆菌复合群 检测时间: 2.5h
扩增 rRNA，TMA恒温扩增 动力快速反应，30分钟产生十亿扩增物 反应在单一试管进行，无须移液和清洗 产物为易自然降解 RNA，防止交叉污染
唯一获得FDA推荐的涂阴样本快速检测技术， 不使用PCR仪，无需专业PCR实验室认证
阴性
开展结核感染的宿主因素相关研究
01
SNP与结核易感性的关联研究 药物基因组学相关SNP与抗结核药物的不良反应 lncRNA在结核病中的诊断价值探讨及功能研究 结核病相关的表观遗传修饰改变（甲基化、miRNA）
02
03 04
建立结核病的生物样本库
结核生物样本库
结核菌株生物 库
信息相对应
宿主生物样本 库
评价
1.TB-DNA检测的限制步骤在于DNA的提取： 磁珠法提取DNA较煮沸裂解法和柱子法纯度 高 2. TB-DNA检测尤其适合于菌量少的体液标 本 3.血液标本除外，MTB检出率极低，可能和 前处理、核酸提取有关
Duo L, Ying B, et al. Molecular profile of drug resistance in tuberculous meningitis from southwest china. Clin Infect Dis. 2011 Dec;53(11):1067-73.
分子快速药敏检测 ①GenoType® MTBDR plus（利福平、异烟肼） ② GenoType® MTBDR sl（乙胺丁醇、氟喹诺酮、可
注射药物）
MTB药敏检测
① 14种一二线药物 ② 菌型鉴定 （MTBC、NTB、牛 型结核分枝杆菌）
③ 亚能MTB耐药突变检 测（利福平、异烟肼、链霉
素、乙胺丁醇）
特点：操作简便、 快速、 价廉。特异 性好，阳性率低，易造成漏诊。 涂片 特点：提高了镜检的灵敏度，缩短了检 测时间；缺点是假阳性率较高，需确证 方法（萋-纳染色）
Sputum
培养
固体培养及药敏试验—孵育4 周观察生长情况 平均时间2-3个月 液体培养及药敏试验 平均时间20天