高效液相色谱的基础知识
高效液相色谱基础知识
谢谢大家！
第二节 岛津LC-10AT型 HPLC本卷须知
一、 流动相
1、流动相应选用色谱纯试剂、高纯水或双蒸水，酸碱液及 缓冲液需经过滤后使用，过滤时注意区分水系膜和油系 膜的使用范围；
2、水相流动相需经常更换〔一般不超过2天〕，防止长菌 变质；
3、使用双泵时，A、口位于混合器下方〕 放置含盐流动相，B、C〔进液口位于混合器上方〕放置 不含盐流动相； A、B、C、D四个储液器中其中一个为棕色瓶，用于存 放水相流动相。
2、 冲洗完毕后，逐步降低流速至0，关泵，进样器也应用 相应溶剂冲洗，可使用进样阀所附专用冲洗接头。
3 、关断电源，作好使用登记，内容包括日期、检品、色谱 柱、流动相、柱压，使用小时数，仪器完好状态等。
九、 清洗管路及进样口
【特殊情况】：谱流路系统，从泵、进样器、色谱柱、 到检测器通池，在分析完毕后，均应按〔5.1〕充分冲 洗，特别是用过含盐流动相的，更应注意先用水，再 用甲醇-水，充分冲洗。
四、 操作过程
〔 4 〕、注意各流动相所剩溶液的容积设定，假设设定 的容积低于最低限会自动停泵，注意洗泵溶液的体积 ，及时加液；
〔 5 〕、使用过程中要经常观察仪器工作状态，及时正 确处理各种突发事件。
四、 操作过程
2、 先以所用流动相冲洗系统一定时间〔如所用流动相为 含盐流动相，必须先用水冲洗20分钟以上再换上含盐 流动相〕，正式进样分析前30min 左右开启D灯或W灯 ，以延长灯的使用寿命；
1、采用过滤或离心方法处理样品，确保样品中不含固体颗粒；
〔1〕、翻开电源，用Harb相连接时，注意Harb电源，翻开计算机，翻开Bootp Server〔一般启动时已翻开〕；
4、 梯度设定：
4.
高效液相色谱和超高效液相色谱
高效液相色谱和超高效液相色谱高效液相色谱（HighPerformanceLiquidChromatography，HPLC）和超高效液相色谱（Ultra High Performance Liquid Chromatography，UHPLC），是现代分析化学中常用的分离技术。
它们可以对复杂的混合物进行分离和定量分析，广泛应用于药物分析、食品分析、环境分析、生物分析等领域。
本文将从原理、仪器、方法和应用等方面，介绍高效液相色谱和超高效液相色谱的基本知识。
一、原理高效液相色谱和超高效液相色谱的原理基本相同，都是利用样品在流动相中的分配系数差异，通过固定相和流动相的作用，将混合物中的化合物分离出来。
不同的是，超高效液相色谱采用了更小的颗粒固定相，使得流动相可以更快地通过固定相，从而提高了分离效率和分离速度。
在高效液相色谱和超高效液相色谱中，样品首先被注入流动相中，然后通过固定相的柱子。
固定相通常是一种多孔的固体材料，如硅胶、C18等。
样品中的化合物在流动相中的分配系数不同，因此在通过固定相时，会被分离出来。
分离出来的化合物，会在检测器中被检测到，从而实现分离和定量分析。
二、仪器高效液相色谱和超高效液相色谱的仪器基本相同，主要由注射器、流动相泵、柱子、检测器和计算机控制系统等组成。
（一）注射器注射器是将样品引入流动相中的关键部分。
常用的注射器有手动注射器和自动进样器。
手动注射器通常用于小样品量的分析，而自动进样器可以实现高精度、高效率的样品进样。
（二）流动相泵流动相泵是将流动相送入柱子中的装置。
其主要功能是控制流动相的流速和流量，并确保流动相的稳定性。
常用的流动相泵有恒压流量泵和梯度流量泵。
恒压流量泵可以保持恒定的流量，适用于等浓度的流动相。
梯度流量泵可以实现不同浓度的流动相混合，从而实现更好的分离效果。
（三）柱子柱子是高效液相色谱和超高效液相色谱的核心部分，用于固定相的分离。
常用的柱子材料有硅胶、C18、C8等。
20-高效液相色谱
5. 离子色谱
其分离原理与离子交换色谱原理一样， 电导检测器检测。 问题：由于流动相都是强电解质，其电导率比 待测离子约高 2 个数量级，这种强背景电导会完
全掩盖待测离子信号。
1975年Small提出，在离子交换柱之后，再串结一根
抑制柱。该柱装填与分离柱电荷完全相反的离子交 换树脂。通过分离柱后的样品再经过抑制柱，使具 有高背景电导的流动相转变为低背景电导的流动相， 从而可用电导检测器检测各种离子的含量。
在反相色谱法中，通过调节流动相的pH，抑制样品组 分的解离，增加它在固定相中的溶解度，以达到分离 有机弱酸、弱碱的目的，称为离子抑制色谱法（ISC）
（1）适用范围 弱酸 3.0≤pKa≤ 7.0 弱碱 7.0≤pKa≤ 8.0
（2）抑制剂 弱酸（乙酸）、弱碱（氨水）或缓冲盐 （3）影响k的因素 a．与流动相的极性有关（同反相色谱） b．与流动相pH有关：弱酸 pH≤pKa k↑， tR↑ 弱碱 反之
由苯乙烯与二乙烯苯交联而成
21
20.4.2 化学键合相
化学键合固定相: 目前应用最广、性能最佳的固定相； 一般的键合相用硅胶为载体： a. 硅氧碳键型： ≡Si—O—C b. 硅氧硅碳键型：≡Si—O—Si — C (ODS）
1. 非极性键合相 键合相表面基团为非极性烃基， 如C18 、C8、 C1 和苯基等。一般用于反相色谱
33
选择流动相时应注意的几个问题
（1）尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质长期累 积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。 （2）使用前需要用微孔滤膜过滤，除去固体颗粒。
（3）流动相使用前最好脱气。
34
20.6 高效液相色谱仪
35
记录系统
输液系统
高效液相色谱法
第八章高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatograph)第一节概述（Generalization）以高压液体为流动相的液相色谱分析法称高效液相色谱法（HPLC）。
HPLC是20世纪70年代初发展起来的一种新的色谱分离分析技术。
具有分离效能高、选择性好、灵敏度高、分析速度快、适用范围广（样品不需气化，只需制成溶液即可）的特点，适用于高沸点、热不稳定有机及生化试样的分离分析。
HPLC基本方法是用高压泵将具有一定极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂泵入装有填充剂的色谱柱，经进样阀注入的样品被流动相带入色谱柱内进行分离后依次进入检测器，由记录仪、或数据处理系统记录色谱信号再进行数据处理而得到分析结果。
高效液相色谱法按固定相不同可分为液－液色谱法和液－固色谱法；按色谱原理不同可分为分配色谱法（液－液色谱）和吸附色谱法（液－固色谱）等。
目前，化学键合相色谱应用最为广泛，它是在液－液色谱法的基础上发展起来的。
将固定液的官能团键合在载体上，形成的固定相称为化学键合相，具有固定液不易流失的特点，一般认为有分配与吸附两种功能，常以分配作用为主。
C18（ODS）是最常使用的化学键合相。
根据固定相与流动相极性的不同，液-液色谱法又可分为正相色谱法和反相色谱法，当流动相的极性小于固定相的极性时称正相色谱法，主要用于极性物质的分离分析；当流动相的极性大于固定相的极性时称反相色谱法，主要用于非极性物质或中等极性物质的分离分析。
《中国药典》中有50种中成药的定量分析采用HPLC法，在中药制剂分析中，大多采用反相键合相色谱法。
一、高效液相色谱法的特点目前经典LC主要用于制备，若用于分析则采用脱机或非连续检测。
经典LC填料缺陷，通常是填料粒度大、范围宽、不规则，不易填充均匀，扩散和传质阻力大，谱带展宽加大。
它存在致命弱点：速度慢、效率低和灵敏度低。
HPLC填料（高效固定相）颗粒细、直径范围窄、能承受高压。
液相色谱基础知识
液相色谱—视差折光检测器
检测器组成：光源——透镜——两 束平行光——样品池和参比池—— 光电二极管——比较两者信号差 值——输出信号 。
液相色谱—凝胶色谱
பைடு நூலகம்
凝胶渗透色谱仪（GPC仪）、体积 排阻色谱(Size Exclusion Chrom.) 。 分离原理：利用多孔物质做固定相， 按照待测组分分子尺寸大小进行分 离。测定相对分子量大小、分子量 分布。
环己烷
正丁醇 乙醇 水 异丙醇
乙酸正丙酯
丙酸甲酯 四氯化碳 N,N-二甲基 甲酰胺 苯
260
260 265 270 280
碘甲烷
二硫化碳 硝基甲烷 硝基乙烷 2-硝基丙烷
350
380 380 380 380
甲醇
甲苯
285
液相色谱—荧光检测器
荧光检测器：样品中物质分子能在 特定波长的光激发后跃迁到高能级 状态，在返回到基态的过程中，会 发出波长较长的光，称做荧光。 荧光强度F=I0Φabc I0——激发光强度 Φ——荧光量子产率
Refractive Index Detector
A valve is opened and pure solvent passes into one half of a cell. The eluate flows through the other half of the cell. The two halves are separated by a glass plate mounted at an angle such that bending of the incident beam occurs if the two solutions differ in refractive index.
关于HPLC的基础知识(中文)
高效液相色谱提纲
高效液相色谱提纲色谱的基础知识第一章色谱分析法概述一、色谱分析法发展简介二、色谱法分类1、按两相状态分类2、按操作形式分类3、按分离原理分类三、HPLC与其他方法的比较1. 色谱法与精馏、萃取分离比较2. 色谱法与光谱、质谱分析方法比较3. 高效液相色谱与经典色谱的比较4. 液相色谱与气相色谱的比较四、色谱法特点五、现代色谱法应用领域六、有关色谱主要期刊与书籍第二章色谱分析法的理论基础一、色谱流出曲线二、色谱图中的基本术语三、分配平衡四、色谱法的基本理论五、色谱法基本分离方程第三章色谱定性分析和定量分析一、定性分析二、定量分析高效液相色谱的知识第四章高效液相色谱仪第五章色谱分离系统一、液相色谱分离原理及分类（一）分离原理（二）高效液相色谱法的主要类型二、高效液相色谱的固定相1. 高效液相色谱固定相以承受高压能力来分类2.高效液相色谱固定相按孔隙深度分类3. 高效液相色谱固定相以化学组成来分类三、流动相1.对流动相溶剂的要求：2. 流动相及流动相的极性3. 流动相的组成四、色谱柱1. 色谱柱的构型2. 色谱柱寿命第六章液固色谱法和液液色谱法一、液一固吸附色谱法(LSAC)1．分离原理 2.固定相 3.流动相二、液一液分配色谱法（LLPC）1．分离原理 2.固定相 3.流动相第七章化学键合相色谱法一、化学键合固定相二、反相键合相色谱法三、正相键合相色谱法四、离子性键合相色谱法第八章离子交换和离子色谱法一、离子交换色谱法1．离子交换色谱原理2．固定相3．流动相二、离子色谱法1.离子色谱法原理2.离子色谱具有以下优点3.离子色谱装置类型4.离子色谱的应用第九章体积排阻色谱法高效液相色谱同时测定食品中的苯甲酸、山梨酸、糖精钠、维生素C高效液相色谱同时测定药品中的苯甲酸与水杨酸样品处理、条件优化及应用第十章色谱分析样品处理一、样品的采集二、常用样品制备技术（一）溶剂萃取***1. 液-液萃取液-液萃取新技术——液相微萃取2. 液-固萃取3. 液-气萃取（溶液吸收）4. 萃取溶剂的选择（二）蒸馏1. 简单蒸馏2. 分馏3. 减压蒸馏4. 水蒸气蒸馏（三）固相萃取***1. 固相萃取的模式及原理2. 固相萃取的常用吸附剂3. 固相萃取的装置及操作程序4. 固相萃取技术的应用（四）膜分离（五）衍生化技术*（六）其它样品制备技术*1. 超临界流体萃取2. 微波萃取技术第十一章衍生化技术及浓缩柱一、衍生化技术（一）按衍生化反应分类1.衍生化反应满足条件2. 按衍生化反应类别分类（二）按衍生化的方式分类1. 柱前衍生2. 柱后衍生二、浓缩柱第十二章高效液相色谱分离条件的优化及建立分析方法的一般步骤一、高效液相色谱分离条件的优化（一）高效液相色谱中色谱参数的相关性1. 色谱参数的分类2. 色谱参数的相关性（二）色谱分离条件优化标准的选择1. 难分离物质对的峰对分离优化标准2. 整体色谱图的优化标准二、建立HPLC分析方法的一般步骤（一）样品的性质及柱分离模式的选择1. 样品的溶解度2. 样品的分子量范围3. 样品的分子结构和分析特性（二）分离操作条件的选择1. 容量因子和死时间的测量2. 色谱柱操作参数的选择3. 样品组分保留值和容量因子的选择4. 相邻组分的选择性系数和分离度的选择第十三章高效液相色谱法的实验技术和分析应用一、高效液相色谱法的实验技术1. 溶剂的纯化技术2. 色谱柱的装填技术3. 色谱柱的平衡、保护与清洗、再生技术二、HPLC法的分析应用第十四章液相制备色谱。
(干货)液相色谱基础知识大全
一、基本原理高效液相色谱（HPLC）法是以高压下的液体为流动相，并采用颗粒极细的高效固定相的柱色谱分离技术。
高效液相色谱对样品的适用性广，不受分析对象挥发性和热稳定性的限制，因而弥补了气相色谱法的不足。
在目前已知的有机化合物中，可用气相色谱分析的约占20%，而80%则需用高效液相色谱来分析。
高效液相色谱和气相色谱在基本理论方面没有显著不同，它们之间的重大差别在于作为流动相的液体与气体之间的性质的差别。
二、高效液相色谱分析原理（1）、高效液相色谱分析的流程：由泵将储液瓶中的溶剂吸入色谱系统，然后输出，经流量与压力测量之后，导入进样器。
被测物由进样器注入，并随流动相通过色谱柱，在柱上进行分离后进入检测器，检测信号由数据处理设备采集与处理，并记录色谱图。
废液流入废液瓶。
遇到复杂的混合物分离（极性范围比较宽）还可用梯度控制器作梯度洗脱。
这和气相色谱的程序升温类似，不同的是气相色谱改变温度，而HPLC改变的是流动相极性，使样品各组分在最佳条件下得以分离。
（2）、高效液相色谱的分离过程：同其他色谱过程一样，HPLC也是溶质在固定相和流动相之间进行的一种连续多次交换过程。
它借溶质在两相间分配系数、亲和力、吸附力或分子大小不同而引起的排阻作用的差别使不同溶质得以分离。
开始样品加在柱头上，假设样品中含有3个组分，A、B和C，随流动相一起进入色谱柱，开始在固定相和流动相之间进行分配。
分配系数小的组分A不易被固定相阻留，较早地流出色谱柱。
分配系数大的组分C在固定相上滞留时间长，较晚流出色谱柱。
组分B的分配系数介于A，C之间，第二个流出色谱柱。
若一个含有多个组分的混合物进入系统，则混合物中各组分按其在两相间分配系数的不同先后流出色谱柱，达到分离之目的。
不同组分在色谱过程中的分离情况，首先取决于各组分在两相间的分配系数、吸附能力、亲和力等是否有差异，这是热力学平衡问题，也是分离的首要条件。
其次，当不同组分在色谱柱中运动时，谱带随柱长展宽，分离情况与两相之间的扩散系数、固定相粒度的大小、柱的填充情况以及流动相的流速等有关。
第十八章_高效液相色谱法
疏水基团 C18基 C8基 苯基
2010-12-2
（3）键合相色谱法分离机理 ）
反相键合相色谱: 固定相极性<流动相极性 反相键合相色谱 固定相极性 流动相极性 常用固定相： 常用固定相：C18（ODS） ） 常用流动相 甲醇-水 甲醇 水 乙睛-水 乙睛 水 分离对象 非极性 中等极性化合物
2010-12-2
2010-12-2
3）流动相 极性越强，洗脱能力越弱，使溶质的 越大 极性越强，洗脱能力越弱，使溶质的k越大 溶剂种类：水为弱溶剂， 溶剂种类：水为弱溶剂，醇为强溶剂 溶剂比例：水的比例增加， 溶剂比例：水的比例增加，使k增大 增大 中性盐的加入：使中性溶质的k增大 中性盐的加入：使中性溶质的 增大 pH：影响弱酸、弱减的离解 ：影响弱酸、 流动相的pH降低，弱酸 增大 增大， 增大； 流动相的 降低，弱酸k增大，tR增大；弱 降低 变小。 碱k变小。 变小
2010-12-2
一、化学键合相色谱法的固定相
• 固定相应符合下列要求： 固定相应符合下列要求： –颗粒细且均匀；传质快；机械强度高，能耐高压； 颗粒细且均匀；传质快；机械强度高，能耐高压； 颗粒细且均匀 –化学稳定性好，不与流动相发生化学反应。 化学稳定性好，不与流动相发生化学反应。 化学稳定性好 1、键合相的种类 （1）非极性键合相 ： 与苯基等键合在硅胶表面； －非极性烃基，如C18﹑C8﹑C1与苯基等键合在硅胶表面； 非极性烃基， －用于反相色谱； 用于反相色谱； －长链烷基可使溶质的k增大，选择性改善，载样量提高， 长链烷基可使溶质的k增大，选择性改善，载样量提高， 稳定性更好。 稳定性更好。
极性基团 丙氨基 氰乙基 醚和醇等
离子交换基团 胺基、 胺基、季铵盐 磺酸、 磺酸、羧酸
高效液相色谱法
正相色谱：以极性物质做固定相，非极性物质作
流动相，即流动相的极性<固定相的极性。正相色 谱适用于极性化合物的分离，极性小的先出柱， 极性大的后出柱。（反之为反相色谱）
高效液相色谱仪
压力表 储液器 高压泵
进样器
梯度洗 提装置
色 谱 柱
记录仪 检测器
馏分收集器
一 高压输液系统 1.贮液器：1-2L的玻璃瓶，配有溶剂过滤器(Ni 合金)，其孔径约2 m，可防止颗粒物进行 泵内。 2.脱气：超声波脱气或真空加热脱气。溶剂通 过脱气器中的脱气膜，相对分子量小的气 体透过膜从溶剂中除去。 3.高压泵： 对输液泵的要求：密封性好、输液流量稳 定无脉动、可调范围宽、耐腐蚀。
二 分离和进样系统 （一）进样系统 与GC相比，HPLC柱要短得多，因此由于柱 本身所产生的峰形展宽相对要小些。即， HPLC的展宽多因一些柱外因素引起。这些 因素包括：进样系统、连接管道及检测器 的死体积。进样装置包括两种。 1. 隔膜注射进样：使用微量注射器进样。装 置简单、死体积小。但进样量小且重现性 差。
2．化学发光检测器
是近年发展起来的高选择性、高灵敏度
（二）荧光检测器（FD） 早期的荧光检测器是具有滤光片的荧光 光度计，已基本淘汰。 目前使用的荧光检测器多是具有流通池 的荧光分光光度计（直角光路）。 检测限可达 1× 10-10g ／ ml ，比紫外检测 器灵敏，但只适用于能产生荧光或其衍生 物能发荧光的物质。
主要用于氨基酸、
多环芳烃、维生素、 甾体化合物、酶类、 黄曲霉素、卟啉类 化合物、农药等的 检测。
利用固定相与流动相之间对待分离组分子溶解
度的差异来实现分离。分配色谱的固定相一般 为液相的溶剂，依靠图布、键合、吸附等手段
高效液相色谱法知识汇总大全集.总结
高效液相色谱法知识汇总大全集（最新最值得收藏的资料整理）HPLC应用一、样品测定1．流动相比例调整：由于我国药品标准中没有规定柱的长度及填料的粒度，因此每次新开检新品种时几乎都须调整流动相（按经验，主峰一般应调至保留时间为6~15分钟为宜）。
所以建议第一次检验时请少配流动相，以免浪费。
弱电解质的流动相其重现性更不容易达到，请注意充分平衡柱。
2．样品配制：①溶剂；②容器：塑料容器常含有高沸点的增塑剂，可能释放到样品液中造成污染，而且还会吸留某些药物，引起分析误差。
某些药物特别是碱性药物会被玻璃容器表面吸附，影响样品中药物的定量回收，因此必要时应将玻璃容器进行硅烷化处理。
3．记录时间：第一次测定时，应先将空白溶剂、对照品溶液及供试品溶液各进一针，并尽量收集较长时间的图谱（如30分钟以上），以便确定样品中被分析组分峰的位置、分离度、理论板数及是否还有杂质峰在较长时间内才洗脱出来，确定是否会影响主峰的测定。
4．进样量：药品标准中常标明注入10ml，而目前多数HPLC系统采用定量环（10ml、20ml 和50ml），因此应注意进样量是否一致。
（可改变样液浓度）5．计算：由于有些对照品标示含量的方式与样品标示量不同，有些是复合盐、有些含水量不同、有些是盐基不同或有些是采用有效部位标示，检验时请注意。
6．仪器的使用：①流动相滤过后，注意观察有无肉眼能看到的微粒、纤维。
有请重新滤过。
②柱在线时，增加流速应以0.1ml/min的增量逐步进行，一般不超过1ml/min，反之亦然。
否则会使柱床下塌，叉峰。
柱不线时，要加快流速也需以每次0.5ml/min的速率递增上去（或下来），勿急升（降），以免泵损坏。
③安装柱时，请注意流向，接口处不要留有空隙。
④样品液请注意滤过（注射液可不需滤过）后进样，注意样品溶剂的挥发性。
⑤测定完毕请用水冲柱1小时，甲醇30分钟。
如果第二天仍使用，可用水以低流速（0.1~0.3ml/min）冲洗过夜（注意水要够量），不须冲洗甲醇。
高效液相色谱法
类很多，有六通阀、四通阀，双路阀等。以六通进样阀最为常用。 • 3)分离系统 • 色谱分离系统包括色谱柱、固定相和流动相。色谱柱是其核心部分，
柱应具备耐高压、耐腐蚀、抗氧化、密封不漏液和柱内死体积小、柱 效高、柱容量大、分析速度快、柱寿命长的要求。通常采用优质不锈 钢管制成。
上一页 下一页 返回
一、背景知识
• 阳离子交换:
• 阴离子交换:
•
交换剂上的固定离子基团。
•
可交换的平衡离子。
•
组分离子。
• 2.固定相
• 早期离子交换色谱法采用离子交换树脂作为固定相，有溶胀和收缩现 象，不耐高压，而且表面微孔结构影响传质，柱效低，现已被离子交
换键合相所取代。
上一页 下一页 返回
一、背景知识
• 3.流动相 • 离子交换色谱流动相通常是盐类的缓冲溶液。通过改变流动相的pH
• (3)高灵敏度。紫外、荧光、电化学、质谱等高灵敏度检测器的使用， 使HPLC的最小检测量可达10-9~10-11g。
• (4)高度自动化。计算机的应用，使HPLC不仅能自动处理数据、绘图 和打印分析结果，而且还可以自动控制色谱条件，使色谱系统自始至 终都在最佳状态下工作，成为全自动化的仪器。
上一页 下一页 返回
环境仪器分析 第七章 高效液相色谱法
主要区别：固定相差别，输液设备和检测手段
柱内径1~3cm，固定相粒径>100μm 且不均匀 常压输送流动相 柱效低（H↑，n↓） 分析周期长 无法在线检测
1．经典LC：仅做为一种分离手段
2．HPLC：分离和分析
柱内径2~6mm，固定相粒径<10μm（球形，匀浆装柱） 高压输送流动相 柱效高（H↓，n↑） 分析时间大大缩短 可以在线检测
A 2 dp
next
A dp
， dp A H ， n 柱效
图示
续前
3）传质阻抗项及其影响
C C m C sm C s C m C sm （忽略固定相传质阻抗 ）
注：只考虑流动相和静态流动相的传质阻抗 忽略固定相传质阻抗
A dp
B 2 D m 2 D g
B t R ，B D g
T T D g 或D g M df 2 C Cm C s C g Cl Cl Cl Dl
DL T
续前
2. HPLC ： H A C u
B 2 D m
第七章
高效液相色谱法
High Pressure Liquid Chromatography
第一节
概述
高效液相色谱法：以气相色谱为基础，在经典液相 色谱实验和技术基础上建立的一种液相色谱法
一、HPLC与经典LC区别 二、HPLC与GC差别
三、高效液相色谱的特点
四、高效液相色谱的局限性
一、HPLC与经典LC区别
•
•
• • •
液-液分配色谱技术的关键是相体系选择。 可通过调节流动相的极性，来获得良好的柱 效和缩短分析时间。 液-液分配色谱可用于几乎所有类型化台物， 极性的或非极性的、有机物或无机物、大分 于或小分于物质的分离，只要官能团不同、 或者官能团数目不同、或者是分子量不同均 可获得满意的分离。
高效液相色谱知识
⑤分析速度快、载液流速快：较经典液体色谱法速度 快得多，通常分析一个样品在15～30分钟，有些样品 甚至在5分钟内即可完成，一般小于1小时。
精选2021版课件
3
三、HPLC 的组成
• HPLC系统一般由高压输液泵、进样器、OL Apple系列 色谱柱、检测器、数据记录及处理装置等组成 。
• 一、高压输液系统
1、泵的性能 ①流量稳定，其RSD应＜0.5%，这对定性定量的准确性至
关重要；②流量范围宽，分析型应在0.1~10 ml/min范 围内连续可调，制备型应能达到100 ml/min；③输出 压力高，一般应能达到150~300 kg/cm2；④液缸容积 小；⑤密封性能好，耐腐蚀。
2、梯度洗脱
精选2021版课件
②高效：分离效能高。可选择固定相和流动相以达到 最佳分离效果，比工业精馏塔和气相色谱的分离效能 高出许多倍。
③高灵敏度：紫外检测器可达0.01ng，进样量在uL数 量级。
④应用范围广：百分之七十以上的有机化合物可用高 效液相色谱分析，特别是高沸点、大分子、强极性、 热稳定性差化合物的分离分析，显示出优势。
• 梯度洗脱有两种实现方式：低压梯度（外梯度）和高 压梯度（内梯度）。
• 两种溶剂组成的梯度洗脱可按任意程度混合，即有多 种洗脱曲线：线性梯度、凹形梯度、凸形梯度和阶梯 形梯度。线性梯度最常用，尤其适合于在反相柱上进 行梯度洗脱。
• 在进行梯度洗脱时，由于多种溶剂混合，而且组成不 断变化，因此带来一些精选特20殊21版问课件题，必须充分重视： 5
高效液相色谱知识
• 一、液相色谱的原理 • 二、HPLC的特点
• 三、HPLC 的组成 • 四、流动相 • 五、缓冲溶液的作用 • 六、梯度洗脱的流动相
仪器分析高效液相色谱法
仪器分析高效液相色谱法高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography，简称HPLC）是目前广泛应用于仪器分析领域的一种重要分析方法。
它通过利用柱子中流动的流动相和样品的物理化学性质的相互作用，使样品组分在柱子中发生分离，再通过检测器对各组分进行定量或定性分析。
仪器分析高效液相色谱法主要由流动相供给系统、进样器、柱子、检测器和数据处理系统等组成。
流动相供给系统通过恒压或恒流的方式将流动相送入进样器中，进样器将样品注入柱子中，柱子根据物理化学性质的差异，使不同组分发生分离，之后检测器检测进入检测器的各组分的浓度，并通过数据处理系统对数据进行分析和整理。
高效液相色谱法具有分离效率高、分离时间短、适用范围广等特点。
与传统的液相色谱法相比，高效液相色谱法的流动相的流速更高，柱子填充物颗粒更小，从而大大提高了分离效率。
同时，高效液相色谱法对样品的需求量较小，具有较好的分析灵敏度。
因此，高效液相色谱法被广泛应用于生物、环境、食品、药物、化工等领域的组分分析和质量控制。
在生物领域中，高效液相色谱法常用于生物样品中代谢产物和药物的分析。
通过绑定柱子、手性柱子以及使用不同的检测器，可以对复杂的生物样品中的不同组分进行准确的分析和定量测试。
例如，对尿液中的代谢产物进行分析可以帮助人们了解人体健康状态，对药物的残留物进行分析可以保证食品和水的安全等。
在环境领域中，高效液相色谱法常用于水质、大气和土壤等环境样品中有机污染物的分析。
通过连接各种不同相的柱子，可以对复杂的环境样品中的有机污染物进行有效的分离，使用紫外-可见光检测器或质谱检测器可以对分离后的各组分进行检测和定量。
在食品领域中，高效液相色谱法常用于食品中添加剂、农药残留物和食品中的有害物质的分析。
通过选择合适的柱子和检测器，可以对复杂的食品样品进行分离和检测，以保证食品的安全性和质量。
在药物领域中，高效液相色谱法常用于药品中活性成分和杂质的分析。
高效液相色谱知识
根据GB15346-94《化学试剂包装及标志》，化学试剂按照门类分为三种：通用试剂、基准试剂(深绿色)和生物染色剂(玫红色)。
通用试剂按纯度分为三个等级：优级纯(CR深绿色)、分析纯(AR金光红色)和化学纯(CP中蓝色)。
我们所说的化学试剂一般是指通用试剂。
优级纯试剂纯度很高，用于精确的分析研究工作。
分析纯试剂纯度较高，用于一般的分析及研究。
化学纯试剂纯度较差，用于工业分析及化学试验。
除上述三个等级外，还有各种专门用途的高纯试剂，比如：光谱纯、色谱纯、电子纯等；纯度更低的则有实验试剂(LR)、工业纯等。
应根据分析任务、分析方法、对分析结果准确度的要求等，选用不同等级的化学试剂，但不应选用低于分析纯的试剂。
Agilent1100高压液相色谱仪基本操作步骤Agilent1100液相基本操作步骤Agilent1100高压液相色谱仪维护保养知识保养事项：高压液相色谱HPLC常见故障及排除方法液相色谱柱使用及保养高压液相色谱HPLC培训教程(一)高压液相色谱HPLC培训教程(七)高效液相色谱仪中反相HPLC柱子的清洁和再生HPLC对流动相的基本要求高效液相色谱Waters 600E-2487 HPLC系统SOPWaters高效液相色谱系统操作规程高效液相色谱仪(Agilent 1100)操作注意事项色谱扫盲班Agilent1100高压液相色谱仪基本操作步骤Agilent1100液相基本操作步骤(一)、开机：1、打开计算机,进入Windows NT （或Windows 2000）画面,并运行Bootp Server程序。
2、打开1100 LC 各模块电源。
3、待各模块自检完成后，双击Instrument 1 Online图标，化学工作站自动与1100LC通讯，进入的工作站画面。
4、从“View”菜单中选择“Method and Run control”画面, 单击”View”菜单中的“Show Top Toolbar”，“Show status toolbar”，“System diagram”,”S amp ling diagram”，使其命令前有“√”标志，来调用所需的界面。
第3章+高效液相色谱分析
不同待测离子与反离子形成离子对的能力不同， 分配系数存在差异，导致在固定相中滞留时间不同， 从而实现色谱分离。
离子对的容量因子k可表示为：
VS 1 k DX K XY [Y ]水相 VM
则组分的保留时间：
L 1 t R (1 K XY [Y ]水相 ） u
分析实例：
§3-4 液相色谱的流动相
当固定相选定时，流动 相的种类、配比能显著地影 响分离效果，因此流动相的 选择很重要。
1.选择流动相时应注意的几个问题
（1）尽量使用高纯度试剂作流动相（防止微量杂质长 期累积，损坏色谱柱和使检测器噪声增加) 。 （2）避免使用会引起柱效损失或保留特性变化的溶剂。 （3）试样在流动相中应有适宜的溶解度。 （4）溶剂的黏度小些为好。 （5）流动相同时还应满足检测器的要求。比如当使用 紫外检测器时，流动相不应有紫外吸收。
子或反离子)，加到流动相中与溶质离子结合形成疏
水性离子对，从而控制溶质离子的保留行为。 阴离子分离：对离子常用烷基铵类，如氢氧化十 六烷基三甲铵。 阳离子分离：对离子常用烷基磺酸(己烷磺酸钠)。 反相离子对色谱：非极性的疏水固定相(C18 柱)， 含有对离子Y+的甲醇-水或乙腈-水作为流动相，试样
离子X-进入流动相后，生成疏水性离子对Y+X-。
固定相：凝胶(具有一定大小孔隙分布)； 原理：按分子大小分离。小分子 可以扩散到凝胶空隙中通过，出 峰最慢；中等分子只能通过部分 凝胶空隙，中速通过；而大分子 被排斥在外，出峰最快；溶剂分 子小，故在最后出峰。 相对分子质量在100～105范围 内的化合物按质量分离。
空间排阻色谱固定相
（1）软质凝胶 葡聚糖凝胶、琼脂凝胶等。多孔网状结构。 水为流动相。适用于常压排阻分离。 （2）半硬质凝胶 苯乙烯-二乙烯基苯交联共聚物，有机凝胶。 非极性有机溶剂为流动相，不能用丙酮、乙醇等极性 溶剂 （3）硬质凝胶 多孔硅胶、多孔玻珠等；如可控孔径玻璃微球，具有 恒定孔径和窄粒度分布。 化学稳定性，热稳定性好，机械强度大，流动相性质 影响小，可在较高流速下使用。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
高效液相色谱法的特点 • 分析速度快——通常分析一个样品在15~30 min，有些样 品甚至在5 min内即可完成。 • 选择性高——可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果， 可分析同类型的有机化合物及其同分异构体，还可以分析 在性质上极为相似的旋光异构体。 • 灵敏度高——紫外检测器可达0.01ng，荧光和电化学检测 器可达0.1pg。 • 柱子可反复使用——用一根色谱柱可分离不同的化合物。 • 样品量少，容易回收——样品经过色谱柱后不被破坏，可 以收集单一组分或做制备。
•
• • •
高效液相色谱仪的注意事项
柱的使用和维护
1、使用前仔细阅读色谱柱附带的说明书，注意适用范围，如pH值范围、不得注射强 酸强碱的样品，特别是碱性样品。 2、使用符合要求的流动相； 3、使用保护柱； 4、如所用流动相为含盐流动相，反相色谱柱使用后，先用水或低浓度甲醇水（如5％ 甲醇水溶液），再用甲醇冲洗。 5、长时间不用仪器，应该将柱子取下用堵头封好保存，注意不能用纯水保存柱子， 而应该用有机相(如甲醇等)，因为纯水易长霉。
高效液相色谱仪工作原理
2．进样装置
高效液相色谱仪工作原理 3 分离系统——色谱柱 色谱柱是液相色谱的心脏部件，它包括柱管与固定相两部 分。柱管材料有玻璃、不锈钢、铝、铜及内衬光滑的聚合 材料的其他金属。玻璃管耐压有限，故金属管用得较多。 一般色谱柱长5～30cm，内径为4～5mm，凝胶色谱柱内 径3～12mm，制备往内径较大，可达25mm 以上。一般 在分离前备有一个前置柱，前置柱内填充物和分离柱完全 一样，这样可使淋洗溶剂由于经过前置柱为其中的固定相 饱和，使它在流过分离柱时不再洗脱其中固定相，保证分 离技的性能不受影响。 柱子装填得好坏对柱效影响很大。对于细粒度的填料 （＜20μm）一般采用匀浆填充法装柱，先将填料调成匀 浆，然后在高压泵作用下，快速将其压入装有洗脱液的色 谱柱内，经冲洗后，即可备用。
高效液相色谱仪工作原理
（1）紫外检测器
（2）荧光检测器
（3）二极管阵列检测器 应用 a: 色谱峰纯度检查 b: 色谱峰鉴定 三维色谱能提供更多全面的信息。
高效液相色谱仪工作原理
（1）紫外检测器 （2）荧光检测器 （3）二极管阵列检测器
（4）示差折光率检测器
是一种通用型检测器，只要被测组分与洗 脱液的折光指数有差别就可使用。生命科 学中常遇到各类糖类化合物，没有紫外吸 收，一般常用示差折光检测器。它的通用 性比UVD广，但灵敏度要低，对温度变化 敏感，并与梯度洗脱不相容，因而限制了 它的使用。
4
5
高效液相色谱仪工作原理
• 高压输液系统 • 进样系统 • 分离系统 • 检测系统
高效液相色谱仪工作原理
其工作过程如下：首先高压泵将 贮液器中流动相溶剂经过进样器 送入色谱柱，然后从控制器的出 口流出。当注入欲分离的样品时， 流经进样器贮液器的流动相将样 品同时带入色谱柱进行分离，然 后依先后顺序进入检测器，记录 仪将检测器送出的信号记录下来， 由此得到液相色谱图。
高效液相色谱仪工作原理
（1）紫外检测器 （2）荧光检测器
（3）二极管阵列检测器
高效液相色谱仪工作原理 （1）紫外检测器 （2）荧光检测器
（3）二极管阵列检测器
与普通UV-VIS检测器不同之处: a: 普通UV-VIS检测器是先用单色器分光，只让特定 波长的光进入流动池。 而二极管阵列UV-VIS检测器是先让所有波长的光 都通过流动池，然后通过一系列分光技术，使所 有波长的光在接受器上被检测. b:普通UV-VIS检测器只能得到二维的谱图,而DAD可 以得到三维图谱.
高效液相色谱法的特点 2．高效液相色谱法与气相色谱法 （l）气相色谱法分析对象只限于分析气体和沸点较低的化 合物，它们仅占有机物总数的20％。对于占有机物总数近 80％的那些高沸点、热稳定性差、摩尔质量大的物质，目 前主要采用高效液相色谱法进行分离和分析。 (2) 气相色谱采用流动相是惰性气体，它对组分没有亲和 力，即不产生相互作用力，仅起运载作用。而高效液相色 谱法中流动相可选用不同极性的液体，选择余地大，它对 组分可产生一定亲和力，并参与固定相对组分作用的剧烈 竞争。因此，流动相对分离起很大作用，相当于增加了一 个控制和改进分离条件的参数，这为选择最佳分离条件提 供了极大方便。 (3)气相色谱一般都在较高温度下进行的，而高效液相色谱 法则经常可在室温条件下工作。
高效液相色谱法的特点
超高效液相色谱(UPLC) • —是区别于HPLC的液相色谱新领域 • —基于小颗粒填料和LC原理的一种创新技 术 • —实现超高分离度、灵敏度、分析速度
1 2 3
高效液相色谱法的特点 高效液相色谱法仪器工作原理 高效液相色谱仪的维护 高效液相色谱法仪的注意事项 高效液相色谱的分析应用
高效液相色谱仪工作原理
（1）紫外检测器
（2）荧光检测器
• 优点: a: 灵敏度非常高(灵敏度在目前常用的HPLC检测器中最高 )， 比紫外检测器高2—3个数量级，适合于痕量分析 b: 可以用于梯度洗脱 c: 对仪器的稳定性（如温度和压力的稳定性）依赖较小 d: 选择性好，优于紫外 • 缺点: a:适用范围有一定的局限性 –只适用于有荧光基团＆衍生化 之后有荧光基团的化合物 b: 定量分析时线性范围较窄
高效液相色谱仪的维护
紫外灯的保养：
在分析前、柱平衡得差不多时，打开检测器；在 分析完成后，马上关闭检测器。
1 2 3ຫໍສະໝຸດ 高效液相色谱法的特点 高效液相色谱法仪器工作原理 高效液相色谱仪的维护 高效液相色谱法仪的注意事项 高效液相色谱的分析应用
4
5
高效液相色谱仪的注意事项
一、流动相
1 、流动相应选用色谱纯试剂、高纯水或 双蒸水，酸碱液及缓冲液需经过滤后使 用，过滤时注意区分水系膜和油系膜的 使用范围； 2、水相流动相需经常更换（一般不超过 2天），防止长菌变质.
高效液相色谱仪工作原理
4．检测系统 目前有两种基本类型的检测器: • 一类是溶质性检测器，它仅对被分离组分的物理 或化学特性有响应，属于这类检测器的有紫外、 荧光、电化学检测器等。 • 另一类是总体检测器，它对试样和洗脱液总的物 理或化学性质有响应，属于这类检测器的有示差 折光，蒸发光散射，电导检测器等。
它适合于 稠环芳烃、氨基酸、胺类、维生素、蛋 白质等荧光 物质的测定
高效液相色谱仪工作原理 （1）紫外检测器 （2）荧光检测器
（3）二极管阵列检测器
• 原理: 光电二极管阵列（或CCD阵列，硅靶摄像管等） 作为检测元件的UV-VIS检测器。它可构成多通道 并行工作，同时检测由光栅分光，再入射到阵列 式接受器上的全部波长的信号，然后，对二极管 阵列快速扫描采集数据，得到的是时间、光强度 和波长的三维谱图。
高效液相色谱法的特点
1．高效液相色谱法与经典液相色谱法 高效液相色谱法比起经典液相色谱法的最大优点 在于高速、高效、高灵敏度、高自动化。高速是 指在分析速度上比经典液相色谱法快数百倍。由 于经典色谱是重力加料，流出速度极慢；而高效 液相色谱配备了高压输液设备，流速最高可达 103cm· min-1.例如对氨基酸分离，用经典色谱法， 需用20多小时才能分离出20种氨基酸；而用高效 液相色谱法，只需lh之内即可完成。
1 2 3
高效液相色谱法的特点 高效液相色谱法仪器工作原理 高效液相色谱仪的维护 高效液相色谱法仪的注意事项 高效液相色谱的分析应用
4
5
高效液相色谱仪的维护 泵的使用和维护
• 防止任何固体微粒进入泵体，因为尘埃或其它任何杂质微粒都会磨损柱塞、 密封环、缸体和单向阀，因此应预先除去流动相中的任何固体微粒。流动相 最好在玻璃容器内蒸馏，而常用的方法是滤过，可采用Millipore滤膜 （0.2µm或0.45µm）等滤器。泵的入口都应连接砂滤棒（或片）。输液泵的 滤器应经常清洗或更换。 流动相不应含有任何腐蚀性物质，含有缓冲液的流动相不应保留在泵内，尤 其是在停泵过夜或更长时间的情况下。如果将含缓冲液的流动相留在泵内， 由于蒸发或泄漏，甚至只是由于溶液的静置，就可能析出盐的微细晶体，这 些晶体将和上述固体微粒一样损坏密封环和柱塞等。因此，必须泵入纯水将 泵充分清洗后，再换成适合于色谱柱保存和有利于泵维护的溶剂（对于反相 键合硅胶固定相，可以是甲醇或甲醇-水）。 泵工作时要留心防止溶剂瓶内的流动相被用完，否则空泵运转也会磨损柱塞、 缸体或密封环，最终产生漏液。 输液泵的工作压力决不要超过规定的最高压力，否则会使高压密封环变形， 产生漏液。 流动相应该先脱气，以免在泵内产生气泡，影响流量的稳定性，如果有大量 气泡，泵就无法正常工作
高效液相色谱仪工作原理
（1）紫外检测器
工作原理： 基于Lambert-Beer定律，即被测组分对 紫外光或可见光具有吸收，且吸收强度 与组分浓度成正比。 通用型检测器约有80％的分析样品具有 紫外吸收,可以使用这种检测器检 测。
高效液相色谱仪工作原理
（1）紫外检测器
优点: a: 灵敏度高 b: 线性范围广 C: 对温度和流速不敏感，适于进行梯度洗脱 限制: a: 没有紫外吸收的物质不能检测 b: 应尽可能选择在检测波长下没有背景吸收的流动相 (限制了一些截止波长在200~300nm之间的良好溶 剂的使用 )
高效液相色谱仪工作原理 1．高压输液系统 由于高效液相色谱所用固定相颗粒极细，因此对流动相 阻力很大，为使流动相较快流动，必须配备有高压输液系 统。它是高效液相色谱仪最重要的部件，一般由储液罐、 高压输液泵、过滤器、压力脉动阻力器等组成，其中高压 输液泵是核心部件。对于一个好的高压输液泵应符合密封 性好，输出流量恒定，压力平稳，可调范围宽，便于迅速 更换溶剂及耐腐蚀等要求。常用的输液泵分为恒流泵和恒 压泵两种。恒流泵特点是在一定操作条件下，输出流量保 持恒定而与色谱柱引起阻力变化无关；恒压泵是指能保持 输出压力恒定，但其流量则随色谱系统阻力而变化，故保 留时间的重视性差，它们各有优缺点。目前恒流泵正逐渐 取代恒压泵。恒流泵又称机械泵，它又分机械注射泵和机 械往复泵两种，应用最多的是机械往复泵。