核酸的分离纯化技术
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性,平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益,请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间:9:00-18:30)。
核酸的分离纯化技术
从细胞中提取核酸后,仍混杂着蛋白质、多糖和各种大小分子核酸同类物。除去这些“杂质”的过程,也就是核酸提纯过程。在核酸的分离纯化时,为防止核酸大分子的变性降解,必须在0~4℃的低温条件下操作。核酸酶的水解作用,是过去制备具有活性核酸大分子的严重障碍,现普遍采用加入去污剂或加入EDTA、8-羟基喹啉、柠檬酸钠以除去核酸酶的激活剂Mg2+,就可以抑制核酸酶的活性,保证在提纯过程中核酸大分子的完整。关于核酸分离纯化阶段中除去多糖、蛋白质及不同类型核酸之间分离的一些方法,分别介绍如下:(1)肝糖元、淀粉及粘多糖,由于其物理化学性质与核酸有许多相似之处,常在提取液中残存下来。除去的方法常有:①取材前尽量减少组织中多糖的含量,如先使动物饥饿数天然后杀死,可使细胞内肝糖元大大减少。②加入淀粉酶,将大分子多糖分解为小分子,在以后纯化步骤中逐渐被除去。③在浓磷酸盐存在下,以2-甲氧基乙醇抽提核酸提取液,使多糖溶于下层水相,核酸在上面有机层中。
④以钙盐沉淀DNA,再以草酸钾处理,使之形成DNA钾盐回收,然后用离子交换法吸附DNA,使之与多糖分离。
(2)蛋白质的除去:由于核酸在细胞内以核蛋白体形式存在,不论采用哪种方法提取核酸,蛋白质都不同程度地存在于体系中。因此,除去蛋白质是核酸分离纯化不可避免的步骤。常用方法有下列几种:①加入去污剂如硫酸十二脂钠,从提取到分离纯化各阶段均可反复使用此法。去污剂与氯仿法或苯酚法结合使用,效果更加理想。②氯仿-戊醇或辛醇对提取液摇荡抽提,蛋白质在氯仿-水界面形成凝胶,离心后除去,核酸留在水溶液中。此法在分离纯化中也常反复使用。③苯酚水溶液抽提,在对氨基水杨酸等阴离子化合物存在下,DNA或RNA都可以进入水相,蛋白质则沉淀于酚层,然后取水相加入乙醇或2-乙氧基乙醇沉淀RNA 或DNA,残余的酚可用葡聚糖凝胶G-10或G-25除去。
(3)不同类型核酸的分离:两种类型核酸的制备过程中,DNA制品中混杂着少量RNA或RNA制品中混杂着少量DNA是经常发生的。由于DNA和RNA结构和性质都很相似,而且分子量都十分大,所以两类核酸的分离是核酸纯化工作中比较复杂和繁琐的一步。从DNA中除去RNA的方法常有:①核糖核酸酸酶选
择地破坏RNA,这是比较有效的方法,但使用的核糖核酸酶中常含有极微量的脱氧核糖核酸酶,必须事先加热处理除去,然后将纯净的核糖核酸酶与样品溶液一起在37℃孵育数分钟,就可达到破坏RNA的目的。②钙盐分步沉淀:在核酸溶液中加入1/10体积10%的氯化钙溶液,使DNA与RNA均成为钙盐后,再利用DNA钙盐在2/10体积乙醇中能形成沉淀析出,RNA钙盐不形成沉淀而彼此分离。
③活性炭吸附:将处理好的活性炭按1/15~1/20体积加入每毫升含有0.5~1mgDNA溶液中,0~4。C下搅拌1h ,以31000×g离心1h,除去RNA后的DNA 回收率可达94%。
在RNA制品中除去DNA,苯酚水溶液抽提是较有效和常用的方法。在没有阴离子化合物存在下,以等体积90%苯酚水溶液反复抽提RNA,可以除去绝大部分DNA。此外,也可采用加入脱氧核糖核酸酶处理,破坏DNA,或参考上述DNA 与RNA分离方法将DNA除去。
(4)同类核酸的分离
①RNA混合物的分离:经过提取的初步纯化的RNA制品中含有各类RNA和某些已降解的RNA混杂物。进一步纯化时,多应用柱层析、梯度离心及逆流分溶等方法。例如tRNA与rRNA的分离用吸附于硅藻土表面的甲基化白蛋白柱吸附后,以不同梯度氯化钠溶液洗脱,或用蔗糖梯度(顶部5%浓度,底部20%浓度)离心法分开。mRNA的代谢速度较快,在细菌中平均寿命为90min,在哺乳动物中约为几小时至十几小时,常用密度梯度离心法和DNA-琼脂柱进行分离。制备rRNA时,由于共沉作用,常混有mRNA,一般可用萘-1,5-二磺酸处理,使二者分开。各种tRNA的提纯,通常采用逆流分溶法在磷酸缓冲液-甲酰胺-异丙醇系统下进行,分离效果较好。
②DNA混合物的分离:主要是变性或降解的DNA和天然的分离,常用磷酸钙、ECTEOLA-纤维素、DEAE-纤维素和甲基化白蛋白柱层析,逆流分溶,梯度离心等方法。一个具有生物活性高度提纯的DNA制品应具有如下标准:不含有蛋白质及多糖;不含有可透析的小分子杂物;在pH7时紫外吸收最大值在257~261μm之间,E(P)在6600左右;不含有RNA;固体为纤维状,水溶液具有高的粘度并有流动双折射作用;具有电泳均一性及超离心中单分散性;具有生物活性。