ELISPOT技术实验步骤
elispot的原理及应用
Elispot的原理及应用1. Elispot是什么Elispot（enzyme-linked immune spot assay）是一种用于测定单个细胞的分泌功能的实验技术。
它通过检测分泌细胞在特定条件下产生的细胞因子或细胞分泌物的分泌量，来评估细胞的免疫反应。
Elispot被广泛应用于免疫学、肿瘤学、感染病学等领域的研究和诊断。
2. Elispot的原理Elispot基于细胞分泌物的分泌原理进行测定。
其原理主要包括以下几个步骤：1.准备ELISPOT板：将特定抗体或刺激物涂覆在固相支持体上，形成抗原或刺激物捕获层。
常用固相支持体有多孔膜、96孔板等。
2.加样细胞：将待测细胞或其他产生细胞分泌物的细胞加入到ELISPOT板中，使其与抗原或刺激物接触。
3.细胞刺激：经过一定的培养条件和时间，刺激细胞产生分泌物。
4.分泌物检测：将细胞移除，用特异性抗体标记待测细胞分泌物中的目标分子，形成复合物。
5.免疫反应可见化：通过酶标法或荧光法，使复合物与ELISPOT板上的底物发生反应，产生可观察的斑点。
3. Elispot的应用Elispot技术广泛应用于以下领域：3.1 免疫学研究Elispot可以用于研究多种细胞因子的产生情况，如干扰素γ（IFN-γ）、白介素-2（IL-2）、肿瘤坏死因子（TNF-α）等。
它可以检测单个细胞的分泌情况，并通过对不同细胞类型进行比较，揭示免疫细胞的功能和相互作用。
3.2 肿瘤学研究Elispot可以评估肿瘤特异性T细胞的活性和功能。
通过使用与肿瘤相关的抗原刺激细胞，可以检测肿瘤特异性T细胞的分泌情况，进而评估免疫治疗的效果和抗肿瘤免疫应答的强度。
3.3 感染病学研究Elispot在感染病学研究中起到重要作用。
通过检测特定感染病原体的抗原刺激下，细胞分泌物的产生情况，可以评估免疫应答的强度和类型，并且可以用于疫苗开发和新药筛选等领域。
3.4 自身免疫性疾病研究Elispot可以用于评估自身免疫性疾病（如类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮等）患者的自身免疫反应。
ELISPOT
去除细胞，加入冰冻去离子水200ul/孔， 培养板置冰上10分钟 PBST洗板10次
非无菌
加入生物素标记 的detector Ab
370C孵育1小时后，PBST洗板5次 加入酶标抗生物素抗体(GABA) 370C孵育1小时后，PBST洗板5次 40C暗处混合显色剂I和II, 加入显色剂I/II, 暗处室温孵育20-30分钟 显微镜下观察至斑点形成， 去离子水清洗培养板 室温干燥后 在倒置显微镜下观察结果
可在单细胞水平检测淋巴细胞对特异性抗原的 反应能力 计数特异性抗原刺激下分泌性淋巴细胞产生的 比例 有效、快速、灵敏度高
使用高吸附性的专用ELISPOT培养板 细胞因子的检测不易受非分泌细胞的干扰 比传统的ELISA和细胞内细胞因子染色法敏感20-200倍
易操作 样本量大的情况下实验结果可用计算机图象分 析系统进行快速、客观的分析
显色剂I和II应避光保存，不使用时切勿混合
ELISPOT 实 验 结 果 示 意 图
Dual ELISPOT 实 验 结 果
ELISPOT检测方法特点
通过两种高亲和力的特异性抗细胞因子抗体 来检测淋巴细胞分泌细胞因子情况 在分泌细胞原处捕获该细胞分泌的细胞因子 斑点的生成属于一种显色反应 SPOT=细胞印迹 斑点可持久保存并进行计数分析
酶联免疫斑点(ELISPOT)技术
中山医学院免疫学教研室
基 本 原 理
根据实验设 计加入淋巴 细胞及含或 不含刺激因 子的培养液 孵育 Coating Ab 包被培养孔 并经BSA阻断
活化的淋巴细胞可分泌细胞 因子与Coating Ab结合
洗除细胞，依次加入生物素 标记的抗细胞因子抗体及酶 标抗生物素抗体进行反应
ELISPOT/FACS/ELISA 检测精确度比较
ELISPOT工作原理
ELISPOT工作原理关键信息项：1、 ELISPOT 技术的定义2、涉及的实验材料和设备3、实验操作步骤4、数据采集与分析方法5、技术的优势和局限性11 ELISPOT 技术的定义ELISPOT（EnzymeLinked Immunospot Assay），即酶联免疫斑点检测技术，是一种用于检测和定量单个细胞分泌特定蛋白质的免疫学方法。
111 原理概述ELISPOT 基于细胞分泌的蛋白质能够在细胞周围的固相载体上形成可见斑点的原理。
当被检测的细胞受到特定刺激后，会分泌特定的细胞因子或抗体等蛋白质。
这些分泌的蛋白质会被预先包被在固相载体（通常是微孔板）上的特异性抗体捕获。
112 与其他技术的比较与传统的 ELISA（酶联免疫吸附测定）方法相比，ELISPOT 能够检测单个细胞的分泌水平，而 ELISA 则是对细胞群体分泌的总和进行测量。
12 涉及的实验材料和设备121 固相载体通常使用 96 孔或 384 孔的微孔板，表面经过特殊处理以增强抗体的吸附。
122 捕获抗体针对待检测的细胞因子或蛋白质的特异性抗体，用于包被微孔板。
123 检测抗体与捕获抗体识别不同表位的另一种特异性抗体，通常与酶标记物结合。
124 酶标记物如辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AP）等，用于催化显色反应。
125 显色底物根据所使用的酶标记物选择相应的显色底物，产生可见的斑点。
126 细胞培养相关试剂包括培养基、血清、刺激剂等。
127 细胞分离和制备设备如离心机、移液器等。
13 实验操作步骤131 微孔板包被将捕获抗体稀释至适当浓度，加入微孔板中，在适当条件下孵育，使抗体吸附在微孔板表面。
132 封闭用封闭液封闭微孔板上未结合抗体的位点，以减少非特异性结合。
133 细胞接种将处理好的细胞悬液加入微孔板中，在特定条件下培养。
134 刺激根据实验目的，加入适当的刺激剂，诱导细胞分泌目标蛋白质。
135 孵育在适当的温度和时间条件下孵育，使细胞分泌的蛋白质被捕获抗体捕获。
酶联免疫斑点试验
酶联免疫斑点试验
酶联免疫斑点试验（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，简称ELISPOT）是一种高灵敏度的免疫学检测技术，可用于检测单个细胞
的分泌物，如细胞因子、抗体、酶等。
该技术广泛应用于疾病诊断、
药物筛选、疫苗研究等领域。
ELISPOT的原理是利用特定的抗体捕获分泌物，然后使用酶标记的二
抗或底物来检测捕获的分泌物。
具体步骤如下：
1. 准备试板：将多孔板涂上特定的抗体，使其能够捕获分泌物。
2. 细胞处理：将待检测的细胞加入试板中，使其与涂有抗体的孔相互
作用。
3. 洗涤：将试板洗涤，去除未结合的细胞和其他杂质。
4. 二抗标记：加入酶标记的二抗，使其与捕获的分泌物结合。
5. 洗涤：将试板洗涤，去除未结合的二抗和其他杂质。
6. 底物反应：加入底物，使其与酶标记的二抗反应，产生可见的斑点。
ELISPOT的优点是灵敏度高、特异性好、操作简单、结果可靠。
它可
以检测单个细胞的分泌物，因此可以用于研究细胞免疫应答、肿瘤免
疫学、感染病毒的免疫学等领域。
此外，ELISPOT还可以用于药物筛
选和疫苗研究，帮助科学家们开发更有效的药物和疫苗。
ELISPOT的缺点是需要较长的实验时间和较高的成本，同时需要专业
的实验技能和设备。
此外，ELISPOT只能检测单个细胞的分泌物，无
法检测细胞表面分子的表达情况。
总之，ELISPOT是一种重要的免疫学检测技术，具有广泛的应用前景。
随着技术的不断发展，ELISPOT将会在疾病诊断、药物筛选、疫苗研
究等领域发挥越来越重要的作用。
ELISPOT技术简介及实验步骤
Table :
Real Plate
Number of Counts / Table
Table Number :
3
24/11/2003
50
Average Values
Cummulated values
Experiment Well
Sp ot s/Well
Opt. Density * Area
area **
• 左图来自我们在中检所建立ELISPOT制备准质控细胞的实验结果 • 右图来自我们建立ELISPOT标准化的实验结果
培 养 基 种 类
RPMI 1640+10%FBS
无血清培养基
ELISPOT质控
Optic reading
ELISPOT数据处理
• 数据处理：斑点判读和统计分析 • 斑点判读：
人工计数 仪器分析
• 统计分析：
Bioreader：不同斑点大小分布图、软件自动计算细胞的分
泌频率
统计学分析软件
ELISPOT结果统计分析
• 常见实验数据统计分析； • 批量样本实验数据统计分析； • 单孔样本分析； • 单个细胞水平结果分析；
Quality of spots
Spots Reader 1. Manual
2. Automated
Results Criteria of positivity Storage of data source
解决方案
1.样品细胞的分离
*淋巴细胞分离技术 ™ EZ-Sep 系列分离 液、分离管
4.实验过程
ELISPOT技术及实 验
ELISPOT简介
• ELISPOT全文为Enzyme-linked Immunospot Assay，中文： 酶联免疫斑点技术。
ELISPOT步骤
ELISPOT技术原理及实验方法介绍ELISPOT技术原理随着酶联免疫分析技术在医学及生物学领域的广泛应用，使体外检测各种细胞因子及抗体研究有了新的突破。
在研究免疫应答机制时以往常用酶联免疫吸附法（ELISA）检测体液中游离的细胞因子（CK）或抗体，但由于游离的循环抗体或CK的半哀期不同，使之在体液中不断的被代谢或与靶器官结合，而不能确切的反映体内的抗体及CK的水平。
80年代，国外的科研工作者根据ELISA技术的基本原理，建立了体外检测特异性抗体分泌细胞和CK分泌细胞的固相酶联免疫斑点技术（ELISPOT）。
因其具有较高的特异性和敏感性，目前正被国内外广泛应用，对探索自身免疫系统疾病发病机制具有重要意义。
ELISPOT法源自ELISA，又突破传统ELISA法，是定量ELISA技术的延伸和新的发展。
两者都是检测细胞产生的细胞因子或其他可溶性蛋白，它们最大的不同在于：1、ELISA通过显色反应，在酶标仪上测定吸光度，与标准曲线比较得出可溶性蛋白总量。
2、ELISPOT通过显色反应，在细胞分泌这种可溶性蛋白的相应位置上显现清晰可辨的斑点，可直接在显微镜下人工计数斑点或通过ELISPOT分析系统对斑点进行计数，1个斑点代表1个细胞，从而计算出分泌该蛋白的细胞的频率。
（某些研究不仅要测细胞因子生成量，还需检测分泌此细胞因子的细胞频率）3、由于是单细胞水平检测，ELISPOT比ELISA和有限稀释法等更灵敏，能从20万-30万细胞中检出1个分泌该蛋白的细胞。
4、捕获抗体为BD、R&D、Mabtach生产的高亲和力、高特异性、低内毒素单抗，在研究者以刺激剂激活细胞时，不会影响活化细胞分泌细胞因子。
ELISPOT检测原理：ELISPOT全名为Enzyme-linked Immunospot Assay，其技术原理与ELISA相似。
其实验设计是在96微孔培养盘底部披覆PVDF薄膜，用来吸附特殊挑选、且无毒性（不含sodium azide、内毒素endotoxin）的单株抗体。
07-ELISpot检测方法
ELISpot检测方法以DyClone试剂盒为例●实验试剂RPMI-1640含2mM谷氨酰胺（glutamin）和抗菌素，Hepes缓冲液。
阳性对照用含ConA的培养液4-8ug/ml或含PHA的培养液1.25-10ug/ml。
无菌PBS含1%BSA和PBS含0.1%tween 20。
●包被和检测1.在ELISPOT板中加入70%乙醇，100μl/孔，室温放置10min。
2.倒掉乙醇，用PBS洗涤3次。
加入稀释的包被抗体（按1：100的比例稀释，例如100μl包被抗体加入到10mLPBS中），100μl/孔，4℃过夜或37℃至少2h以上。
3.倒掉包被抗体，用PBS洗涤3次。
加入2%的奶粉（用PBS配制）封闭，100μl/孔，室温2h。
4.倒掉奶粉，在无菌吸水纸上拍打，PBS洗涤1次。
5.加入细胞（或预先用刺激物刺激的细胞）和刺激物。
调整细胞浓度为1×106个/ml，加入100μl/孔；阳性对照用PHA刺激，终浓度为2μg/ml；实验孔加入终浓度为20μg/ml 的HBcAg，和/或HBsAg 20μg/ml；阴性对照用培养液代替。
37℃孵箱中放置15-20h，注意96孔板放入孵箱后要尽量避免移动。
6.倒掉细胞，在吸水纸上轻拍几下。
加入PBS-0.1% tween 20，4℃放置10min，用PBS-0.1%tween 20洗3遍。
7.加入检测抗体（按1：100的比例稀释，用PBS-1%BSA稀释），100μl/孔，37℃放置1.5h.8.倒掉检测抗体，用PBS-0.1% tween 20洗3遍。
9.加入链酶亲和素化的碱磷酶（按1：1000的比例稀释，用PBS-1%BSA稀释），37℃放置1h。
10.倒掉链酶亲和素化的碱磷酶，用PBS-0.1% tween 20洗3遍，在吸水纸上吸干残液。
11.加入BCIP/NBT，100μl/孔，室温反应2-5min，肉眼观察点的形成。
12.用蒸馏水洗板3遍，以终止反应。
酶联免疫斑点试验的原理
酶联免疫斑点试验的原理1. 引言酶联免疫斑点试验（Enzyme-Linked ImmunoSpot Assay，简称ELISPOT）是一种用于检测细胞分泌物的敏感且高通量的免疫学技术。
该技术可以定量检测单个细胞分泌的蛋白质或细胞因子，在免疫学研究、药物开发和临床诊断中具有广泛的应用。
2. 原理概述ELISPOT技术基于酶标记抗体和特异性抗原结合的原理。
它通过将待测细胞与特定抗原刺激后，将细胞分泌物捕获到固相载体上，然后使用酶标记二抗进行检测，最后通过显色反应可视化并计数斑点数量。
该技术具有高灵敏度、高特异性和高通量等优势。
3. 实验步骤步骤一：制备固相载体在ELISPOT实验中，常用的固相载体是多孔膜板或膜片。
首先，在载体表面涂覆特异性抗原或抗体，以便捕获待测细胞分泌的特定蛋白质或细胞因子。
步骤二：孵育待测细胞将待测细胞加入到含有特异性抗原的培养基中，使其与抗原发生特异性反应。
通常，实验者会设置对照组，包括阴性对照组（只有培养基）和阳性对照组（含有已知分泌物的细胞）。
步骤三：洗涤将孵育后的细胞用洗涤缓冲液洗去未结合的细胞和其他杂质。
步骤四：二抗处理加入酶标记的二抗（如辣根过氧化物酶标记的抗IgG），使其与待测细胞分泌物中的特异性蛋白质或细胞因子结合。
步骤五：显色反应加入适当的底物和显色剂，通过酶催化作用产生可见信号。
常用的显色剂是BCIP/NBT，在酶催化下会生成紫色斑点。
步骤六：计数和分析使用显微镜对固相载体进行观察，并使用计算机软件或手工计数斑点数量。
斑点的数量代表了待测细胞分泌物的水平。
4. 原理解析特异性抗原和抗体结合固相载体表面涂覆的特异性抗原或抗体与待测细胞分泌物中的特定蛋白质或细胞因子结合。
这种结合是通过免疫反应中抗原与抗体之间的特异性识别实现的。
酶标记二抗检测酶标记二抗是一种能够与待测细胞分泌物中的特异性蛋白质或细胞因子结合并具有酶活性的二级抗体。
常用的酶标记二抗有辣根过氧化物酶标记的抗IgG。
ELISPOT(IFN-γ检测)试验详细介绍
ELISPOT（IFN-γ检测）试验详细介绍一、实验背景IFN-γ对于抵抗细胞内病原体和控制肿瘤的免疫力至关重要。
它主要由天然杀伤（NK）和天然杀伤T细胞（NKT）以及抗原特异性Th1 CD4 +和CD8 +效应T细胞产生。
在研究针对病原体和癌细胞的免疫应答时，与治疗组相比，对病原体或癌细胞的抗原特异性IFN-γ反应的测量结果可定量评估治疗效果。
与没有肽的对照培养相比，测量抗原特异性IFN-γ反应涉及CD4 +或CD8 + T 细胞与抗原呈递细胞（APC）和来自靶病原体或癌细胞的特定肽一起培养。
在合适的时间范围后，通过ELISPOT测定法测量释放的细胞因子。
有和没有肽的分泌IFN-γ的细胞数量的差异是抗原特异性IFN-γ反应的量度。
该测定法可以应用于其他细胞因子，例如IL10。
干扰素γ（IFN-γ）是二聚化的可溶性细胞因子，是II型干扰素的唯一成员。
IFN-γ具有抗病原，免疫调节和抗肿瘤的特性，可增强NK细胞的活性，增加抗原呈递，激活诱导型一氧化氮合酶，诱导活化浆细胞中产生IgG2a，通过上调转录因子T-bet促进Th1细胞分化。
鉴于这种细胞因子在免疫反应中的重要作用，有几种方案可以量化IFN-γ。
也许最简单的方法是ELISA分析，该方法用于通过用抗体捕获细胞因子来测量血清样品和组织培养上清液中的细胞因子水平。
还有一种基于流式细胞术的测定法，其中细胞通透性过后，通过流式细胞术检测细胞内IFN-γ。
含有细胞因子的细胞百分比通常很低，并且不能表明该蛋白是否具有功能，是否可以分泌并且不能测量它是否对特定的靶抗原或多种抗原作出反应。
酶联免疫斑点法（ELISPOT）是一种高度灵敏的免疫分析法，可在单细胞水平上测量分泌细胞因子的细胞的频率。
抗原特异性ELISPOT 分析可量化特定细胞类型（CD4 +或CD8 + T细胞）的数量，该细胞可响应特定抗原而分泌IFN-γ。
ELISPOT板上的IFN-γ特异性抗体从细胞分泌后立即捕获IFN-γ，其检测极限通常为100,000个细胞中的1个。
ELISPOT测定小鼠IFN-γ水平试验的标准操作规程
ELISPOT测定小鼠IFN-γ水平试验的标准操作规程（编号：036）1、目的及适用范围该SOP用来规范ELISPOT测定小鼠IFN-γ水平的操作。
2、主要仪器及试剂CO2细胞培养箱、普通光学显微镜、超净工作台（生物安全级别）、电动吸引器、移液器、细胞计数器、微量移液器及配套枪头、通道微量移液器、0.5mL离心管、1.5mL离心管、RPIM-1640培养基、淋巴细胞分离液、Quick Spot 小鼠 ELISPOT 预包被试剂盒3、相关器皿的预处理玻璃制品和金属制品高压灭菌4、操作步骤4.1 分离小鼠脾细胞4.1.1断颈处死小鼠，浸入75%的乙醇中浸泡1-2min。
4.1.2在超净台中用大头针固定，小心剪开小鼠的腹部外皮，再剪开小鼠的腹腔，用镊子取出小鼠脾脏。
注意无菌操作。
4.1.3 在60mm培养皿中放入4-5mL淋巴细胞分离液，用镊子把尼龙网固定在皿上。
然后用注射器活塞轻轻研磨小鼠脾脏，使得分散的单细胞透过尼龙网进入淋巴细胞分离液中。
4.1.4 把悬有脾脏细胞的分离液转移到离心管中，然后覆盖上大约1mL的1640培养基。
4.1.5 800g离心30min。
离心结束后淋巴细胞会漂浮上来，在1640覆盖层下面聚集4.1.6 吸出淋巴细胞层，加入10mL 1640培养基洗涤一次，250g离心10min。
倾倒上清液，加入3-5mL 含5%FBS的1640培养基重悬，细胞计数。
4.2参考达科为生物技术有限公司的Quick Spot 小鼠 ELISPOT 预包被试剂盒产品说明书进行，具体如下：4.2.1 第一天：接种细胞，加入刺激物，培养（严格注意无菌操作）。
整个实验设置一组正对照（ConA 或者其他非特异性刺激物），每一个细胞样品（同一个捐献者或者实验动物）要设一个负对照（不加刺激物），整块板还要加一个背景负对照（不含细胞，只加培养基和所有的检测试剂）。
4.2.2 填好实验卡片，用以指导实验的安排和细胞及试剂的添加。
ELISPOT工作原理
ELISPOT工作原理抗－IFN γ细胞IFN γ生物素标记抗－IFN γAvidin-ALP底物 1. 收集外周血白细胞2. 抗干扰素包被96孔PVDF 板3. 加入白细胞和刺激物4. 抗体捕获干扰素5. 加入生物素化二抗6. 底物显色7. 一个斑点代表一个T细胞版权所有：北京表源生物技术有限公司血浆 PBMCRBCELISPOT标准操作程序1. ELISPOT包被 (无菌操作)每孔加入20μl的 70％乙醇预湿PVDF膜、甩干。
用无菌PBS洗涤，每孔加入100μl， 洗涤2次去除乙醇。
用灭菌PBS稀释包被抗体，每孔加入100μl已稀释好的包被抗体(终浓度10μg/ml)到各实验孔。
4°C包被过夜或室温（25C+/-）包被2小时。
2. 封闭 (无菌操作)倾倒包被液，用无菌PBS洗涤3次。
最后一次，在灭菌的吸水纸上扣干。
每孔加入200μl细胞培养液封闭，室温孵育1小时。
3. 细胞培养 (无菌操作)倾倒封闭液，无须洗涤，直接加入准备好的细胞。
（初次进行试验，应作刺激物浓度梯度、和∕或细胞计数梯度预实验）实验组孔加入细胞和刺激物，阳性对照组每孔加入10μl PHA（PHA终浓度1-4ug/mL），阴性对照组每孔只加细胞。
37°C二氧化碳培养箱中培养16-24h。
4 检测用PBS/0.05%Tween-20 洗板3次。
甩干, 用抗体稀释液（PBS＋1％BSA）稀释检测抗体 每孔加入1：1000稀释好的生物素标记检测抗体100μl，室温孵育2h。
用PBS/0.05%Tween-20 洗板3次。
甩干, 用抗体稀释液（PBS＋1％BSA）稀释酶标亲和素，每孔加入1：1000稀释好的酶标亲和素，室温（25°C+/-）孵育1h。
5 显色用PBS/0.05%Tween-20 洗板3次，PBS洗板1次。
拍干。
加入50μlBCIP·NBT显色液。
室温静置15-45min，注意避光。
elispot实验方法
ELISPOT实验操作指南一、物品准备：动物房：小鼠处死所需材料：75%乙醇，酒精棉，PE手套，记号笔，袋子；取血准备材料：镊子，标好组别的EP管细胞室：6孔板3块（按每孔放一组脾）；平皿6套(每2组一套)；剪刀、镊子若干；5ml注射器15个；200目纱网（剪成许多块，一般每组3块，一大一小）；折成四折灭菌。
蓝、黄枪头若干盒；液体塑料槽5个以上，排枪2把；离心筒(15ml,50ml)按每组2-3个准备，各30个；吸管（10ml ，5ml）4-5筒，1.5ep管1饭盒，冻存管1饭盒。
离心机T-75 培养瓶CO2培养箱显微镜血球记数板水浴锅96孔板：1、ELISPOT板：96孔板-Millipore MultiScreen-HA plate (0.45um Surfactant-Free Mixed Cellulose, Ester embrane#MAHAS4510)，每板可测八组样品，共需2块。
注：头一天晚上照两个台子（一个做CTL一个处理靶细胞）二、所需溶液：1．需配制并灭菌液体：RPMI 1640 R5无酚红RPMI 1640(HyQ, cat no: SH30197.03) DMEM小牛血清双抗（青霉素/链霉素）谷氨酰胺无菌水（500ml）、PBS、PBST 、ACK（上述液体均需足够量并无菌）；2．需确认及领用溶液及试剂：IFN-r抗体（BD公司, purified anti-mouse ifn-r(capture) cat no: 551216, 或51-2525kc）；一抗(biotinylated mAb for IFN-gamma, BD公司，cat no: 551506)；二抗（BD公司, streptavidin-HRP concentrate A，cat no: 51-9000209(557630)）；ficoll-paque（Amershan公司或GE Healthcare公司，17-1440-02）；裂解液(10X)：试剂盒中带或9%（v/v）Triton X-100 ；trypan blue；elispot染色液（AEC substrate set, cat no: 551951, 20ul的chronogen加入到1ml的AEC substrate溶液中)；洗涤缓冲液（PBS-T）；稀释缓冲液（PBS+10%FBS）；终止液（试剂盒带）：1M 醋酸（取醋酸57ml，加水至1L）。
ELISPOT
8
A8 (-) A8 5 B8 (-) B8 5 C8 (-) C8 5 D8 (-)
9
A9 (-) A9 5 B9 (-) B9 5 C9 (-) C9 5 D9 (-)
10
A10 (-) A10 5 B10 (-) B10 5 C10 (-) C10 5 D10 (-)
11
A 2.5 A 5 A 10 B 2.5 B 5 B 10 C 2.5
• AEC 显色液：10 ml （临用时配制）
AEC稀释液 9 ml AEC solution Ⅰ AEC solutionⅡ AEC solutionⅢ 500 μl 500 μl 50 μl
分组：20人一块板（A组+B组：IFN-γ， C组+D组：IL-4）， 每个人一轮操作（80孔），按列加板
第二天：按照说明书操作 （不再需要无菌操作）
试剂与器材
• • • • • • IFN-γ/IL-4预包被试剂盒： Biotinylate antibody 生物素标记抗体 100μl Streptavidin-HRP 酶联亲和素100μl Dilution buffer R (1 X) 10 ml X 2, Washing buffer(50 X)10 ml（实验员配制） AEC 稀释液 10 ml, AEC solutionⅠ500μl, AEC solutionⅡ 500 μl, AEC solution III 50μl • IFN-γ预包被96孔板1块，IL-4预包被96孔板1块 • 200μl、1000μl加样器各1 把 • 200μl加样器头 20个 • 蒸馏水 250 ml X 4（高压），4度保存备用 • 5 ml 玻璃试管 1 支 • 37度 5%CO2 孵箱 • 吸水纸1盒 • 冰冷的去离子水 100 ml（无菌）
Get清风ELISPOT技术实验步骤
ELISPOT技术实验步骤〔相关网站〕ELISPOT技术实验步骤从原理上看ELISPOT确实很简单，但是在操作过程中有许多条件需要摸索，所以这里进一步介绍一下ELISPOT的操作步骤。
〔1〕将适量捕获性抗体预先包被于96孔ELISPOT板上，用胶带封板并在4℃孵育过夜。
将板用PBS洗6遍，再用含体积比10%胎牛血清(FCS)的培养基封闭，室温下孵育至少1h。
FCS可以封闭所包被抗体的FCS受体以降低非特异性反响。
有一种特殊的96孔板底面介质是PVDF膜，利用膜的多孔结构可以让单个细胞坐到其中，然后分泌细胞因子或特定抗体，这样使最后的检测单个细胞灵敏度成为可能。
同时，PVDF膜的不透光性也是ELISPOT与ELISA的不同之处。
理论上是可以同时包被两个不同的抗体的，两种不同的抗体可以利用不同的显色系统显出不同颜色，但是这样就要考虑到不同抗体间的不亲和性，必需保证每种抗体包被的数量要足够。
如果是使用试剂盒的预包被板，这一步就可以省略啦。
〔2〕将阴性对照和细胞样品，如外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)，经纯化的CD8+T细胞或去除某种特异细胞群的PBMC，用含10%FCS的培养基稀释至5×104～2×105个/孔如果条件可以到达更高的细胞数，建议可以尝试3×105～5×105个/孔，特别是在分泌细胞〕，分装于ELISPOT板孔中，再参加特异的刺激物，如多肽或基因表达产物，提取的抗原等，阴性对照孔中只参加培养基〔实验中最好采用无血清的培养基，这样可以防止因为血清批次不同的差异所造成的误差，同时也防止血清的某些成份会引起非特异的反响〕，阳性对照孔参加植物血凝素(PHA，2μg/mL)或阳性多肽，37℃，体积比为5% CO2培养24～48h。
要进行ELISPOT实验的细胞必需制备成为悬液的形式。
利用ELISPOT的检测是十分灵敏的，频率低至10-12的分泌细胞都可以被检测出来。
ELISPOT 试验步骤
免疫小鼠2. 13 Enzyme-linked immunospot (ELISPOT) assay按参考文献[49]进行，有改进。
2.13.1碳酸盐包被缓冲液（pH 9.6）溶解抗原溶为30 μg/ml，加100 μl/孔于PVDF膜铺底的96孔灭菌板过夜；2.13.2第二天吸去包被液后，加5％FCS的PRMI 1640培养基100 μl封闭1小时，37 o C；2.13.3准备脾细胞悬液（用氯化铵去除红细胞，制备成单个脾淋巴细胞悬液）；2.13.4从1 ×106/孔开始，按1:3的稀释度开始逐孔稀释做不同浓度梯度，并做3个复孔，37 o C静置培养5小时；2.13.5PBS洗3～5次，生物素化的抗鼠IgG二抗孵育30 min；2.13.6PBS洗3～5次，亲和素标记的碱性磷酸酶孵育30 min；2.13.7PBS洗3～5次，用底物BCIP/NBT显色，显微镜（肉眼）下观察显色反应，显色后及时终止反应；2.13.8计数每孔中的斑点数目，计算每106个脾细胞中抗体分泌细胞数量。
2. 10 酶联免疫吸附实验（ELISA）参考文献方法[48]进行2.10.1 用碳酸盐包被缓冲液（pH 9.6）溶解抗原使浓度为30 μg/ml，加100 μl/孔到96孔酶标板，4 o C放置过夜；2.10.2 第二天弃去包被液后，用PBST洗涤3次，每孔加入150 μl 1％BSA封闭1小时；2.10.3 PBST洗涤3次后，每孔加入100 μl不同稀释度的血清，37 o C孵育2小时；2.10.4 PBST洗涤5次后，加入100 μl稀释后的HRP标记的二抗，37 o C孵育1小时；2.10.5 PBST洗涤5次后，显色剂显色20 min后，酶标仪上读取A450吸收值。
2. 11 免疫印迹（Western Blot）同样参考文献方法[48]进行2.11.1 配制适合浓度的聚丙烯酰胺凝胶，电泳分离样品；2.11.2 电泳结束后，将凝胶移入转移缓冲液浸泡30 min。
ELISPOT实验方法
★脾细胞保存方法（一）短期保存技术适用范围：术后1周PRT反应。
保存方法：将分离到的细胞用适量含10％～20％灭活小牛血清的RPMI1640培养液稀释重悬。
置4℃保存较好，可减低细胞代谢活动。
要注意不要迅速改变细胞所处的温度，以免造成细胞“温度”休克。
保存1管即可。
（二）长期冷冻保存技术适用范围：术后2周以后的PRT反应。
保存方法：利用液氮深低温（－196℃）环境保存细胞，冷冻时的降温速度和细胞解冻时的升温速度对细胞活力的保存有很大影响。
低速离心后，取沉积细胞用含10％二甲亚砜的小牛血清配制成适当浓度的细胞悬液，分装于冻存管内（保存3管），速即放入降温过渡站中，避免二甲亚砜对细胞的损伤。
用两步降温法，即迅速降温至－80℃低温冰箱过夜，或在液氮罐液面以上的一层空间放置片刻，然后再放入液氮中。
如需复苏细胞，则需迅速解冻以恢复细胞的活力，要求在20s以内完全融化。
将冻存管自液氮中取出，立即放入40℃温水中，融化后即从水中取出，吸出细胞悬液，加入10倍的培养液中混匀，继而低速离心，尽快洗去保护剂，再悬于新培养液中，计数并检查细胞活力，然后置37℃培养箱内培养。
★相关试剂的配制（一）PBS：800ml蒸馏水中，溶解8克NaCl、2克KCl、1.44克Na2HPO4和0.24克KH2PO4，用HCl调节PH到7.4，加水定容到1升，高压蒸汽灭菌20分，室温保存。
或：8克Nacl、0.2克KCl、1.44克KH2PO4，用HCl调整PH到到7.4，加水定容到1升，高压蒸汽灭菌20分，室温保存。
或：在800ml蒸馏水中溶解8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4和0.24g KH2PO4,用HCl调溶液的pH值至7.4加水定容至1L。
（二）PHA：10μg/mL（终浓度）。
（三）丝裂霉素（mitomycin c,MMC）：50μg/mL,for 20 minutes,and then three washes in PBS。
elispot实验方法
ELISPOT实验操作指南一、物品准备：动物房：小鼠处死所需材料：75%乙醇，酒精棉，PE手套，记号笔，袋子；取血准备材料：镊子，标好组别的EP管细胞室：6孔板3块（按每孔放一组脾）；平皿6套(每2组一套)；剪刀、镊子若干；5ml注射器15个；200目纱网（剪成许多块，一般每组3块，一大一小）；折成四折灭菌。
蓝、黄枪头若干盒；液体塑料槽5个以上，排枪2把；离心筒(15ml,50ml)按每组2-3个准备，各30个；吸管（10ml ，5ml）4-5筒，1.5ep管1饭盒，冻存管1饭盒。
离心机T-75 培养瓶CO2培养箱显微镜血球记数板水浴锅96孔板：1、ELISPOT板：96孔板-Millipore MultiScreen-HA plate (0.45um Surfactant-Free Mixed Cellulose, Ester embrane#MAHAS4510)，每板可测八组样品，共需2块。
注：头一天晚上照两个台子（一个做CTL一个处理靶细胞）二、所需溶液：1．需配制并灭菌液体：RPMI 1640 R5无酚红RPMI 1640(HyQ, cat no: SH30197.03) DMEM小牛血清双抗（青霉素/链霉素）谷氨酰胺无菌水（500ml）、PBS、PBST 、ACK（上述液体均需足够量并无菌）；2．需确认及领用溶液及试剂：IFN-r抗体（BD公司, purified anti-mouse ifn-r(capture) cat no: 551216, 或51-2525kc）；一抗(biotinylated mAb for IFN-gamma, BD公司，cat no: 551506)；二抗（BD公司, streptavidin-HRP concentrate A，cat no: 51-9000209(557630)）；ficoll-paque（Amershan公司或GE Healthcare公司，17-1440-02）；裂解液(10X)：试剂盒中带或9%（v/v）Triton X-100 ；trypan blue；elispot染色液（AEC substrate set, cat no: 551951, 20ul的chronogen加入到1ml的AEC substrate溶液中)；洗涤缓冲液（PBS-T）；稀释缓冲液（PBS+10%FBS）；终止液（试剂盒带）：1M 醋酸（取醋酸57ml，加水至1L）。
ELISPOT操作步骤(BD)
ELISPOT实验实验材料：免疫小鼠实验器材：试剂：包被缓冲液：1×PBS封闭液及稀释液：完全细胞培养液，即含有10%FBS，1%（PS+G），1%~2%Na的RPMI1640细胞培养液：含有1%（PS+G），1%~2%Na的RPMI1640胎牛血清（FBS）洗液：PBST（含0.05%TW-20的PBS）红细胞裂解液配方：NH4Cl 8.29gKHCO3 1.0gNa2EDTA 37.2mgddH2O 800ml用5mol/LNaOH调整pH值至7.2~7.4ddH20定容至1000ml，0.2um滤膜过滤除菌，4℃保存无菌水BD ELISPOT Set耗材：EP管、15ml离心管、平皿，带滤芯Tip，细胞冻存管仪器及器材：移液器，铜网，针栓，器械，移液管，吸管，离心机，血细胞计数仪其他物品准备：水盆，冰盒及冰，吸水纸，75%医用酒精，笔，记号笔，计算器，EP管架实验步骤：1.根据实验内容设计板子的加样内容, 细胞计数表, 肽稀释表并打印。
以下步骤2~5均在无菌环境下进行。
2.包被抗体：1）用1×PBS对Capture Antibody（Purified Anti-mouse IFN-γ）做1：200稀释(50ulAb+9mlPBS/板),每孔100ul.2）4℃包被过夜。
3.封闭3）弃掉包被抗体，用封闭液（200ul/孔）洗一次。
4）每孔加入200ul封闭液，室温孵育2h。
4.小鼠脾细胞分离1）将小鼠编号，摘眼球取血，将血液保存到编好号码的EP管里，室温放置，可待当天实验完成后离心将血清置-20℃冻存。
2）在每个平皿里加入5ml不含FBS的1640，取一铜网置入，然后将小鼠脱颈椎处死并用医用酒精消毒体表，取出脾脏，将脾脏置于铜网上，用针栓小心挤压研磨，然后取走针栓铜网及残留结缔组织，用吸管将细胞液轻轻吹打，然后吸入写有相应号码的15ml离心管里。
1000rpm/min4℃离心8min。
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ELISPOT技术原理在免疫学领域中，对于疾病以及疫苗研究不仅仅局限于体液免疫应答（B细胞免疫），细胞介导的免疫应答(cell mediated immune response，CMI)也是人们所关注的，而T细胞在CMI中起关键作用。
在研究免疫应答机制时以往常用用酶联免疫吸附法（ELISA）检测体液中游离的细胞因子（CK）或抗体，但由于游离的循环抗体或CK的半哀期不同，使之在体液中不断的被代谢或与靶器官结合，而不能确切的反映体内的抗体及CK的水平。
80 年代，国外的科研工作者根据ELISA 技术的基本原理，建立了体外检测特异性抗体分泌细胞和CK 分泌细胞的固相酶联免疫斑点技术（ELISPOT ）。
作为一项新型的免疫酶技术——酶联免疫斑点法(enzyme linked immunospot assay，ELISPOT)，是从单细胞水平检测分泌抗体细胞(ASC) 或分泌细胞因子(CK) 细胞的一项细胞免疫学检测技术。
由于该方法具有较高的特异性和敏感性，易操作，成本相对流式细胞分析术也较低，已被广泛用于分泌CK细胞检测或ASC测定中，对探索自身免疫系统疾病发病机制具有重要意义。
ELISPOT 法源自ELISA，又突破传统ELISA 法，是定量ELISA 技术的延伸和新的发展。
两者都是检测细胞产生的细胞因子或其他可溶性蛋白，它们最大的不同在于：（1）ELISA通过显色反应，在酶标仪上测定吸光度，与标准曲线比较得出可溶性蛋白总量。
（2）ELISPOT也是通过显色反应，在细胞分泌这种可溶性蛋白的相应位置上显现清晰可辨的斑点，可直接在显微镜下人工计数斑点或通过ELISPOT 分析系统对斑点进行计数，1个斑点代表1个细胞，从而计算出分泌该蛋白的细胞的频率。
（某些研究不仅要测细胞因子生成量，还需检测分泌此细胞因子的细胞频率）由于是单细胞水平检测，ELISPOT 比ELISA 和有限稀释法等更灵敏，能从20万-30万细胞中检出1个分泌该蛋白的细胞。
捕获抗体为高亲和力、高特异性、低内毒素单抗，在研究者以刺激剂激活细胞时，不会影响活化细胞分泌细胞因子。
下面将从发展、原理、具体实验操作、技术优势和应用几方面进行介绍。
ELISPOT技术的发展（1）ELISPOT技术的过去ELISPOT是20多年前便己研发成功的老技术。
Czerkinsky 等人率先在1983年，运用该技术成功地检测出因受激而分泌抗体的B细胞频率。
从那时起世界各国免疫学者便开始一长期的ELISPOT Cytokine技术竞赛，每个团队都希望能率先将此一技术推广来研究T细胞免疫，其绝妙之处在提供一接近体内实验的环境，藉由侦测T细胞分泌的各类细胞因子，来定量机体内免疫反应启始者Precursor T的clonal size族群大小，同时预测体内免疫系统即将进行的下游免疫反应。
ELISPOT Cytokine技术虽说操作简单，但该技术并没能如预期地很快地被成功应用在ex vivo T细胞功能研究。
要让ELISPOT技术从B细胞免疫走向T细胞免疫的产生的第一个主要问题，便是灵敏度的提升，因为T细胞因子较之B细胞免疫球蛋白产量极少。
早期ELISPOT的分析条件不是非常理想，成对抗体的品质、呈色底膜的材质等几个技术性的问题，使当时多数研究团队很难获得清晰的斑点，结果是敏感度不够、数据分析重现性低。
这问题直到1996美国俄亥俄卅Case Western Reserve大学Paul Lehmann团队引进PVDF薄膜的应用（Forsthuber et al., Science, 1996），才釜底抽薪地解决了该技术因斑点呈色问题造成低敏感度的缺失。
与原来的标准膜面相比，PVDF薄膜提供1,000倍的较大面积来吸附单株抗体，使T细胞分泌的各类细胞因子能在细胞周围就近被俘虏，让呈色斑点集中、清晰、对比色高，大大的提高ELISPOT Cytokine分析的敏感度。
图一是使用PVDF-BASED改良薄膜（Panel A）与传统标准薄膜（Panel B）并行实验的比较结果。
同样的人体PBMC样品，在通过完全相同的实验，Panel A呈现较清晰的小色点。
第二个技术性问题是ELISPOT Cytokine实验分析的几个基本假设缺乏科学实证，也使得该技术在当时并没受到该有的广泛重视。
没有科研人员尝试去厘清一些基础但很重要的问题，诸如；实验所得的斑点是抗原特定T细胞所生产，还是旁观细胞受Cytokine刺激的次级效应？斑点的小或大有何生理意义；如何决定cutoff值？能否相信斑点是由单一的细胞造成？ELISPOT Cytokine分析技术能准确测量的频率范围？如果效应相互拮抗的cytokine同时产生，它们是否会互相妨碍？及到什么程度？（2）ELISPOT 技术的现在1996年以来随着抗体制备、PVDF膜材篁等技术改良，ELISPOT 分析技术已经逐渐达到科研人员的期待，它已是当世公认最灵敏抗原特定T细胞的体外检测技术。
藉由检验新鲜分离PBMC细胞所分泌cytokine的指纹，ELISPOT 分析技术可提示T细胞免疫系统的两个重要参数：抗原特定T细胞的clone族群大小；和免疫效应细胞的信号传导路径Th1/Th2。
多年来经过数十个研究团队的致力研究，对于ELISPOT分析技术本身的几个问题，也有了科学上的验证。
目前一般公认，ELISPOT技术允许科研人员在单细胞水平上识别抗原特定T细胞，主要针对经由CD4或者CD8细胞的免疫反应。
在适当的实验设计下，ELISPOT Cytokine 斑点的数量分析显示斑点是由一个单细胞所生成，同时斑点形态学与Time Response分析则显示斑点直径大小直接反映该细胞族群的产能。
也因为如此，ELISPOT是个免疫学上的标竿技术，它可以允许科研人员在几乎自然生理条件下，观察细胞实际分泌Cytokine的进程，进而可以得到药理学信息，阐明免疫调节药物如何影响T细胞分泌各类cytokine的速率。
药物抑制T细胞免疫一般可通过两程截然不同的机转；使能分泌Cytokine的Precursor T细胞族群变小，或减少每Precursor T细胞的cytokine 产能，而ELISPOT技术能提供双份信息。
ELISPOT分析技术的几个特点已经让它在抗原特定T细胞免疫学上独占鳌头。
此技术是当世唯一准许百万分之一1:1000,000的准确分析，如此强效的解析力使流式细胞技术也望其项背，以目前国内外常规的intracellular cytokine或者Dimer/ tetramer染色，流式技术的灵敏度一般限制在1:10,000。
这样的高灵敏度对T细胞免疫学研究是必须的，因为抗原特定T细胞一般在机体周边循环系统发生的频率通常低于万中取一。
此外由于ELISPOT Cytokine技术被证实适用于冰冻后复苏的人类淋巴球，解冻后PMBC与新鲜分离样品有相当的效价，没有丧失功能。
这一点对临床试验非常重要，它使科研人员得以并行分析免疫治疗前、后的病人血样，如果试验牵涉全国多个临床试验机构，病人血样可冰存并同时集中在「中央实验室」一齐被测试。
同理，一个血样或标准对照品可被分装小份，被送到不同检验中心进行测试，以交互比对，同时有利LISPOT Cytokine技术流程的规范化、标准化（3）ELISPOT 未来展望ELISPOT 分析技术正在欧美各国发挥它的完整潜能，它让免疫学家可以直接洞察活体内T细胞相关生理学或病理学，就像是心脏外科医师手上的那张心电图，经由这个技术科研人员可以在活体内直接进入一个器官系统，在那里视察、发掘，得到全新的智识。
从各国文献可见ELISPOT技术已经达到标准化、规范化的要求，并被广泛地应用在多项领域，包括监视癌症病人接受免疫疗程时的反应(Lewis, 2000 and Janetzki, 2000)，以及感染性疾病(Moss, 2000, Rahman, 2000, Rowland-Jones, 1998, Herr, 1997 and Lechner, 2000)、肿瘤(Nagorsen, 2000)、或自体免疫病人体内的一个特定的免疫反应型式(Pelfrey, 2000)。
ELISPOT技术同时也在数个疫苗效价评估人体试验中，被当成重要的终结指针。
2003年1月，世界卫生组织通过与大陆北京性艾中心合作，将应用ELISPOT技术来监测HIV疫苗研究免疫应答反应技术，该计划将是首次利用ELISPOT技术对亚洲国家从事HIV疫苗研究和临床试验的有关研究。
我们期待未来此一技术能在我国免疫学界得到广泛地应用。
原理ELISPOT就其原理来说实在是很简单的，从本质上说和ELISA的原理是一样的，理解起来并不难。
细胞受到刺激后局部产生细胞因子，此细胞因子被特异单克隆抗体捕获。
细胞分解后，被捕获的细胞因子与生物素标记的二抗结合，其后再与碱性磷酸酶标记的亲和素结合。
BCIP/NBT 底物孵育后，PVDF孔板出现“紫色”的斑点表明细胞产生了细胞因子，通过ELISPOT 酶联斑点分析系统对斑点的分析后得出结果。
传统的ELISA 与ELISPOT都是根据酶免疫学检测原理，通过酶的高催化频率，放大反应效果，从而达到很高敏感度的检测效果。
ELISPOT全名为Enzyme-linked Immunospot Assay，其技术原理与ELISA相似。
其实验设计是在96微孔培养盘底部披覆PVDF薄膜，用来吸附特殊挑选、且无毒性（不含sodium azide、内毒素endotoxin）的单株抗体。
静脉血PBMC细胞经适当分离处理后，会被分配到微孔盘上，再接受适当的抗原刺激，并将微孔盘放置于温箱中过夜培养一段时间。
一般而言，记忆型T细胞在受抗原刺激数小时后会开始分泌细胞激素，此时局部(在紧靠分泌细胞的周围)分泌出的细胞激素会被PVDF薄膜上特异抗体捕获。
微孔盘中的细胞被移除并清洗后，被捕获的细胞激素可进一步使用生物素（Biotin）标记的二次抗体来标志，其后再以结合酵素的StreptAvidin与之作用，并加入酵素受质使其呈色，有反应作用的细胞会留下染色斑点。
反应步骤可大致分为：（1）利用特定细胞因子的单克隆抗体包被96孔板，封闭剩余的空白位点；（2）加入细胞悬液，用特异性抗原刺激、活化细胞，产生细胞因子，细胞因子会往附近扩散与之前包被的抗体进行特异结合；（3）洗掉细胞；（4）加入酶标二抗特异与细胞因子进行结合，通过底物的显色反应，一个细胞所在位置就会显出斑点，最后利用显微镜或者特定的读板机（reader）就可以计算出样品中被激活细胞的数目。
以上是检测分泌细胞因子细胞的流程，如果是检测分泌特异抗体的细胞只需把包被特异抗体变为包被特异抗原即可。