酶联免疫斑点技术
酶联免疫斑点试验检测技术(Elispot)在诊断结核性脑膜炎中的应用
提供 ， 脑脊液 Ｔ — Ｎ Ｐ Ｒ） 平 ≥５０ ｃｐｅ／ ｌ 断 为 阳 ＢＤ Ａ（ Ｃ 水 ０ ｏ ｉ ｍ 判 ｓ
性 ， ５ ０ｃｐｅ ｍ 判 断 为 阴 性 。 检 测 结 果 使 用 Ｐｉ ５０软 ＜ ０ ｏｉ ／ ｌ ｓ ｒｍ ． ｓ
件包进行数据统计和统计学分析。两组 间率 的比较采用卡方
特 异 性 ｒ 扰 素 （Ｆ —） 平 可 以 用 于 结 核 分 枝 杆 菌 感 染 的 干 ＩＮ ｒ 水
断为 阳性 ， 抗 原 检 测 结 果 为 阴性 ， 果 判 断 为 阴 性 ； 有 ３种 结 所 脑 膜 脑 炎 病 例 均 常 规 行 脑 脊 液 Ａ Ａ、 脊 液 Ｔ — Ｎ Ｐ Ｒ） Ｄ 脑 Ｂ Ｄ Ａ（ Ｃ
检测 。脑脊 液 Ａ Ａ使 用 酶 标 法 进 行 检 测 ， 据 国 内 同行 Ｄ 根 ２０ ０４年对脑脊 液 Ａ Ａ在结 核性脑 膜脑 炎 中研 究 的标准 Ｊ Ｄ ， 脑脊液 Ａ Ａ１８Ｕ Ｌ判断为 阳性 ， ８Ｕ Ｌ判断为阴性 ； Ｄ ＞ ／ ＜ ／ 脑脊
液 Ｔ —Ｎ Ｂ Ｄ Ａ荧 光 定 量 聚 合 酶 链 反 应 试剂 由达 安 基 因有 限 公 司
选 非 结 核 性 脑 膜 脑 炎 病 例 均 通过 临床 治 疗 转 归 及 实 验室 检 查 最终确诊 。
方 法
所 有 病 例 均抽 取 乙 二 胺 四 乙 酸 （ Ｄ Ａ） 凝 血 ５ｍ ， ＥＴ 抗 ｌ送
实 验 室 行 Ｅｉ ｏ检 测 。检 测 结 果 根 据 斑 点 数 量 设 定 ， 一 反 ｌｐ ｔ ｓ 每
术 在 结 核 性 脑 膜脑 炎 中 的应 用 价 值 。
临 床 资 料
、
果
在 ７ 例 结 核 性 脑 膜 脑 炎 的 诊 断 中 ，ｌｐ ｔ 性 者 ４ ３ Ｅｉ ｏ 阳 ｓ ５
酶联免疫斑点试验
酶联免疫斑点试验
酶联免疫斑点试验（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，简称ELISPOT）是一种高灵敏度的免疫学检测技术，可用于检测单个细胞
的分泌物，如细胞因子、抗体、酶等。
该技术广泛应用于疾病诊断、
药物筛选、疫苗研究等领域。
ELISPOT的原理是利用特定的抗体捕获分泌物，然后使用酶标记的二
抗或底物来检测捕获的分泌物。
具体步骤如下：
1. 准备试板：将多孔板涂上特定的抗体，使其能够捕获分泌物。
2. 细胞处理：将待检测的细胞加入试板中，使其与涂有抗体的孔相互
作用。
3. 洗涤：将试板洗涤，去除未结合的细胞和其他杂质。
4. 二抗标记：加入酶标记的二抗，使其与捕获的分泌物结合。
5. 洗涤：将试板洗涤，去除未结合的二抗和其他杂质。
6. 底物反应：加入底物，使其与酶标记的二抗反应，产生可见的斑点。
ELISPOT的优点是灵敏度高、特异性好、操作简单、结果可靠。
它可
以检测单个细胞的分泌物，因此可以用于研究细胞免疫应答、肿瘤免
疫学、感染病毒的免疫学等领域。
此外，ELISPOT还可以用于药物筛
选和疫苗研究，帮助科学家们开发更有效的药物和疫苗。
ELISPOT的缺点是需要较长的实验时间和较高的成本，同时需要专业
的实验技能和设备。
此外，ELISPOT只能检测单个细胞的分泌物，无
法检测细胞表面分子的表达情况。
总之，ELISPOT是一种重要的免疫学检测技术，具有广泛的应用前景。
随着技术的不断发展，ELISPOT将会在疾病诊断、药物筛选、疫苗研
究等领域发挥越来越重要的作用。
固相酶联免疫斑点技术
固相酶联免疫斑点技术固相酶联免疫斑点技术，听起来是不是有点高大上？它就是个帮助我们检测各种物质的好帮手。
想象一下，你在厨房里做饭，随手把各种调料都放进锅里。
这个技术就像是把你的调料品分类，帮你找出锅里究竟有什么。
很酷吧！不过，咱们今天不聊做饭，而是来聊聊这个小家伙。
固相酶联免疫斑点技术，咱们可以把它简称为ELISAD。
这个名字虽然长得像外星人，但它的原理其实非常简单。
就像你在学校里做的实验，往显微镜底下看看细胞。
它利用了一种叫抗体的东西，专门识别目标物质。
你可以把抗体想象成个非常挑剔的朋友，只有看到自己喜欢的东西才会欢呼雀跃。
哦，对了，这个过程可有趣了，简直就像在举办一场盛大的聚会。
你知道吗，这个技术的关键在于“固相”这个词。
也就是说，它需要把目标物质固定在某个地方。
就像钉子钉在墙上一样，稳稳当当地呆在那里。
这样一来，抗体就能方便地找到它们的“朋友”，然后通过一系列反应，给你展示结果。
简直像是一场寻宝游戏，越找越有趣。
再说说检测的过程。
想象一下，你的朋友们都来了，大家一起来参加这个聚会。
每个人都有自己的名字，抗体的名字就是它们识别的目标。
如果你想知道锅里有多少盐，抗体就像个侦探，带着放大镜一一查看。
检测出来的结果，就像是聚会结束后的成绩单，让你一目了然。
哇，真是个聪明的办法！而且这个技术的应用范围可广了，简直是无所不能。
医学、环境监测、食品安全，哪儿都能看到它的身影。
比如，检测血液里的病原体，确保咱们的身体健康。
这就像是找个医生给你做体检，提前发现问题，早早处理。
谁不想健康长寿呢？想想看，等你老了，还能和孙子孙女一起追逐打闹，那多好啊！说到这里，不得不提一下，固相酶联免疫斑点技术还有个好处，就是操作相对简单。
没那么复杂，就像做个蛋炒饭，火候掌握得当，就能出奇迹。
它不需要太多设备，就像是家里简单的厨具，也能搞定一桌好菜。
快速的反应时间也让它在急诊和研究中倍受青睐。
想想看，当你急需结果时，它能像闪电一样给你答案，真是太贴心了！技术再好也难免有些小缺陷。
酶联免疫斑点法的操作方法
酶联免疫斑点法的操作方法酶联免疫斑点法是一种广泛应用于免疫学和生物化学领域的分析技术，用于检测和定量分析抗原-抗体相互作用。
下面将详细介绍酶联免疫斑点法的操作方法。
一、实验材料与试剂准备1. 试剂- 抗原：根据实验需要准备相应的抗原。
- 抗体：根据实验需要选择合适的抗体，可以是多克隆抗体也可以是单克隆抗体。
- 酶标记的二抗：选择适当的酶标记二抗，如HRP、碱性磷酸酶等。
- 底物：根据所选择的酶标记物选择相应的底物。
- 缓冲液：根据实验需要选择相应的缓冲液，如PBS、TBST等。
- 洗涤液：常用的洗涤液为PBS或TBST。
- 显色底物：根据所选择的酶标记物选择相应的显色底物，如TMB、BCIP/NBT 等。
2. 实验仪器- 酶标仪：用于测定底物酶解的吸光度或荧光值。
- 扫描仪：用于获得斑点形成的图像。
二、实验步骤1. 制备实验板- 选择合适的固相载体，如微孔板、膜、条或片等。
- 洗涤载体：根据选择的载体类型使用洗涤液充分洗涤载体，通常为3-4次洗涤。
- 固定抗原：将抗原溶液加入载体孔中，进行固定，通常需要孵育一段时间，如1-2小时。
- 停止固定反应：洗涤载体，用洗涤液洗涤3-4次。
2. 孔位的处理- 阻断孔位：加入阻断液阻断非特异性吸附，如BSA、Bovine serum albumin 等。
- 洗涤液洗涤孔位：用洗涤液洗涤3-4次。
3. 添加抗体和酶标记二抗- 加入抗体：添加适当稀释的抗体溶液到孔位中，孵育一段适当的时间，如1-2小时。
- 洗涤液洗涤孔位：用洗涤液洗涤孔位，洗涤3-4次。
- 加入酶标记二抗：添加适当稀释的酶标记二抗溶液到孔位中，孵育适当的时间，如1-2小时。
- 洗涤液洗涤孔位：用洗涤液洗涤孔位3-4次。
4. 显色和停止反应- 加入显色底物：加入适当的显色底物，添加适当的底物溶液，使酶解产生可见的色斑或显色反应。
- 停止反应：根据所使用的显色底物的不同，选择适当的反应停止液。
5. 结果读取与分析- 读取结果：将实验板放入酶标仪测定吸光度或荧光值，记录下各孔位的数值。
酶联免疫斑点技术 -回复
酶联免疫斑点技术-回复酶联免疫斑点技术（Enzyme-linked Immunosorbent Assay, ELISA）是一种常用于测定抗原或抗体的高度敏感和特异性的实验方法。
本文将详细介绍ELISA的原理、步骤和应用。
一、ELISA的原理ELISA技术基于抗原与抗体之间的特异性相互作用。
ELISA通常使用多孔板作为试剂的固相载体，先在孔板上固定特定抗原或抗体，再根据需要加入待测样品和检测抗体。
通过特异性抗原-抗体反应的信号产生，可以对待测物进行定量或定性分析。
ELISA有两种基本的原理：直接ELISA和间接ELISA。
1. 直接ELISA：直接ELISA是利用特异性抗体与待测物发生直接的非共价相互作用。
在这种方法中，待测物溶液被加入到已有特异性抗体固定在多孔板上的反应孔中。
如果待测物包含目标抗原，它将与特异性抗体结合，并固定在多孔板上。
然后，加入适量的检测抗体，该抗体被标记有一种酶，例如辣根过氧化物酶（HRP）。
最后，加入合适的底物，当酶与底物反应时，也就是产生了颜色，可以通过酶促反应的信号强度来确定待测物的浓度。
2. 间接ELISA：间接ELISA是通过待测物与特异性抗体结合，然后再加入检测抗体与该复合物结合。
首先，待测物溶液被加入到已有特异性抗体固定在多孔板上的反应孔中。
如果待测物中含有目标抗原，它将与特异性抗体结合并固定在多孔板上。
然后，在充分洗涤去除未结合的物质后，加入标记有检测抗体的二抗。
这些二抗一般与小鼠、兔子等动物蛋白特异性抗体结合，并与待测物-抗体复合物发生特异性反应。
最后，如同直接ELISA，加入适当的底物来检测酶促反应。
以上是ELISA技术的两种基本原理，根据待测物的特性和实验需求，可以选择合适的方法进行分析。
二、ELISA的步骤ELISA方法通常包括固相处理、解离、检测抗体的加入、洗涤、底物发色反应和测定等步骤。
1. 固相处理：将特异性抗体固定在多孔板上。
根据需要，可以使用直接ELISA或间接ELISA的原理选择适合的抗体。
酶联免疫斑点技术及其在结核诊断中的研究进展
作者单位 ：北京市结核病胸部肿瘤研究所结核病分子生物学研 究室 通讯作者 ：张宗德 ，电子信箱 ：ｚｄ １＠１３ｃ ｒ ｚ ４ ７ ６ ．ｏ ｎ
结核 病与 胸部 肿 瘤 ２０ ０ ８年 第 ４ 期 胞 。Ｅ ＩＰ 简 单 、 稳定 、灵 敏 ，不 受细 胞 Ｌ Ｓ ＯＴ 因子 代 谢等 因素 的 影 响 ，可 在单 细胞 水 平 检 测 淋 巴 细胞 对 特 异 性 抗 原 的 反 应 能 力及 计 数 特 异性 抗 原 刺 激 下 分 泌 性 淋 巴细 胞产 生 的 情 况 ，能够 比较 真 实 地 反 映 体 内 细胞 因子 的 水 平 ，Ｅ Ｉ Ｐ 现 已被 运 用 于 各 种疾 病 诊 断 和 Ｌ Ｓ ＯＴ 科 学研 究 中 。 Ｔ Ｔ 应 用 的纯 化 蛋 白衍生 物 （ｕｉｅ Ｓ所 ｐ ｒ ｉｄ ｆ ｐｏ ｉｄｒ ａｖｓ Ｐ ｒｔｎ ｅｉ ｔ ｅ，Ｐ Ｄ）是 存在于结 核分枝 杆 ｅ ｖｉ
产 生 多 种 细胞 因子 发 挥 免疫 效 应 ，其 中 Ｙ干 扰 素 （Ｆ Ｙ）是 最 为 关键 的细 胞 因子 。 因 ＩＮ—
此 ，检 ￣ ｌＮ— 水 平或 分 泌ＩＮ— ｇ Ｆ Ｆ Ｙ的 效应 Ｔ 细 胞 的水 平就可 以判 断是 否存在 结核 感染 。 Ｅ ＩＰ Ｔ 通 过 检测 分 泌 细 胞 因子 的细 ＬＳ 量 夹 ， Ｌ Ｓ Ｌ Ｓ ＯＴ ￣Ｅ Ｉ Ａ方 法 ：
结核 诊断 技 术 ，它是通 过抗 原特 异性Ｔ 巴细 淋 胞 反应 频 率 来 检 测结 核 感 染 患 者 的 细胞 免 疫
功能 。
１酶联免疫斑点技术的原理
结 核 病 的 免疫 学 机 制 主要 是 机 体 对结 核
２ ９５
敏 感度 均 为 ８ ％，健 康 成 人 中Ｐ Ｄ－Ｌ Ｓ ＯＴ ０ Ｐ Ｅ ＩＰ 的 敏 感 度为 ９ ％；英 国健 康 成 人 中两 种 肽 段 ８
ELISPOT技术简介及实验步骤
one spot
ELISPOT技术优点
• 高灵敏度：单个细胞水平检测，极低频的阳性细胞检
出率——百万分之一
• 高通量：每个研究人员每天可做上百样本的检测 • 冻存标本的检测 • 安全：无放射性污染 • 高性价比：一般细胞实验室即可进行。
ELISPOT应用
• 疫苗开发：评估疫苗效力，或疫苗注射路径影响 • 传染疾病研究：HBV-ELISPOT、TB-ELISPOT • 过敏机制探讨：IL-4诱导免疫球蛋白亚型转换，其它参与
双因子酶联斑点检测
IFN-
IL-4
IFN-/IL-4
双因子荧光斑点检测
IFN-
IL-13
IFN-/IL-13
多色荧光斑点检测
IFN-
IFN-/TNF-/IL-10
TNF-
IL-10
BioRreader 读板
BioReader 3000
BioReader 5000
BioReader 4000
8.ELISPOT技术服务
ELISPOT 全国用户培训 ELISPOT 试剂开发服务
3.试剂的准备
*预包被ELISPOT技术
™ 预包被ELISPOT 试剂盒
6.实验室质控
*ELISPOT质控技术
冻干多价非特异性刺激物 PHA和PMA/IMC ELISPOT细胞质控品
PBMC-SPOTTM细胞
F肽特异性刺激肽
1
B2
1.1
22
69
2,818
6,715
Real Plate B3
1.2
30
77
3,466
11,915
Real Plate D5
12.2
65
酶联免疫斑点法
酶联免疫斑点法酶联免疫斑点法（Enzyme-linked immunospot assay, ELISPOT）是一种用于检测单个细胞分泌物（包括细胞因子、抗体和其他蛋白质）的方法。
该技术将单个细胞和特异性抗体共同培养于多孔的固体基质上，当特异性抗体捕获了细胞分泌物时，就会形成一个“免疫斑点”，而该斑点会通过化学反应显示出来，从而可进行定量分析。
该技术的优点一是提高了灵敏度和特异性，促进了单个细胞分泌物的检测能力。
二是实验条件较容易控制，能够极大地减少误差。
另外，与其他技术相比，ELISPOT技术具有较高的自动化水平和适应性。
同时，该技术可用于评估和比较不同治疗方案或疫苗的效果、评估细胞免疫反应、疾病诊断和监测、评估药物毒性和进行基础研究。
在实验中，ELISPOT可分为两个阶段。
第一阶段是细胞培养，即将感兴趣的细胞和特定的刺激物共同培养。
第二阶段是免疫斑点检测，即将细胞移到多孔的固体基质上，添加特异性抗体进行反应，以发现并定量斑点。
常用的免疫斑点计数仪可以通过电子显微镜对固定、染色的免疫斑点进行准确计数，从而获得准确的结果。
通过该技术，研究人员可以研究细胞免疫和疫苗的作用机制，及早发现传染病或肿瘤的预警信号，以促进更好的预防和治疗。
此外，酶联免疫斑点法也适用于儿童疫苗接种后对疫情的监测和跟踪，以及老年人免疫力的评估。
需要指出的是，这种技术并不能够直接用于临床检测，仅在研究领域发挥作用。
一些商业实验室已经开始使用该技术进行疫苗测试和特定蛋白质的检测，在检测和诊断方面具有很大的潜力。
总之，酶联免疫斑点法是一种基于细胞分泌物检测的技术手段，在生物医学研究、药物开发以及疾病预防和治疗等方面具有较为重要的应用价值。
ELISPOT-技术
14
• 高产量 T 细胞分析成为可行。一个经过训 练的相关实验室小组可以测试成百的样本 中几十种抗原的反应。只需要少量细胞， 就可以用于通其他细胞学分析方法进行比 较。例如，45 毫升的血液就足以用于测试 600 种不同抗原/肽类物质的反应。可以定 义CD4 和CD8 细胞的免疫因子指标。这是 因为只需要少数细胞，分析就可以在高产 量模式下进行。
15
• 可以定义CD4和CD8细胞的免疫因子指标。 这是因为只需要少数细胞，分析就可以在 高产量模式下进行。ELISPOT 分析在筛选 肽库，绘制免疫因子方面是一个理想的工 具。
• 用于确定抗原特异性 T 细胞的功能性亲和 力。这最大可能受到肽类药物刺激至50%的 影响。
• 可以用于研究未经药物处理过的细胞的分 泌过程。如果观察到净产量减少，可以确 定这种区别是来自于分泌细胞的减少，还 是每个细胞分泌产量的减少。
2
ELISA 和ELISPOT区别
• ELISA 通过显色反应，在酶标仪上测定吸 光度，与标准曲线比较得出可溶性蛋白总 量。
• ELISPOT 也是通过显色反应，在细胞分泌 这种可溶性蛋白的相应位置上显现清晰可 辨的斑点，可直接在显微镜下人工计数斑 点或通过 ELISPOT 分析系统对斑点进行计 数， 1 个斑点代表 1 个细胞，从而计算 出分泌该蛋白的细胞的频率。
5
6
ELISPOT 解决了以下问题
• 哪些斑点是抗原特异性 T 细胞产生的（此斑点 具有进一步分析价值），哪些是无关细胞产生的 （此斑点没有 T 细胞研究价值）
ELISA和ELISPOT检测技术
酶联免疫吸附试验（ELISA）
酶联免疫斑点试验（ELISPOT）
酶联免疫吸附试验 (ELISA)
ELISA技术简介 ELISA的基本原理 ELISA的类型和方法 ELISA方法注意事项和应用
酶联免疫吸附试验（ELISA）
酶联免疫吸附试验( Enzyme-Linked Immunosorbent Test, ELISA ) ：
酶标记物
底物溶液
E
E E E E E E E E
E
E
E
E
对 照 孔
参考液(不含抗原)
酶标记物
底物溶液
E
E E
E
E
E
E
测 定 孔
样本(含抗原)
竞争法ELISA实验原理
E
E
半定量ELISA试验
间接法检测血清HBsAb含量
设计加板次序 (空孔、阴、阳) 加板 (阴、阳、样) 37℃, 30min 洗涤3次，拍干 37℃, 30min 洗涤3次，拍干 加底物溶液 (空孔除外) 避光 37℃, 10-30min
酶联免疫斑点试验（ELISPOT）
ELISPOT技术简介 ELISPOT的基本原理 ELISPOT的实验方法 ELISPOT技术的应用
ELISPOT技术简介
酶联免疫斑点试验( Enzyme linked immunospot assay, ELISPOT) 随着酶联免疫分析技术在医学及生物学领域的广泛应用, 使 体外检测各种细胞因子及抗体研究有了新的突破。在研究免疫 应答机制时，以往常用ELISA方法检测体液中游离的细胞因子 （CK）或抗体，但由于游离的CK或循环抗体的半哀期不同， 使之在体液中不断的被代谢或与靶器官结合，而不能确切的反 映体内的抗体及CK 的水平。80 年代，国外的科研工作者根据 ELISA 技术的基本原理，建立了体外检测特异性抗体分泌细胞 和 CK 分泌细胞的固相酶联免疫斑点技术（ELISPOT）。因其 具有较高的特异性和敏感性，目前正被国内外广泛应用，对探 索自身免疫系统疾病发病机制具有重要意义。
斑点酶联免疫吸附试验原理
斑点酶联免疫吸附试验原理斑点酶联免疫吸附试验（ELISA）：从表面到内部的探索1. 什么是斑点酶联免疫吸附试验？•斑点酶联免疫吸附试验（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，简称ELISA）是一种常用于检测肿瘤抗原、感染性疾病、药物残留等的生物学分析技术。
•ELISA利用酶标记抗体与待测物相互作用，并通过最终的酶反应产生可见的颜色变化，从而定量或定性分析目标物质的存在和浓度。
2. ELISA的原理与步骤原理概述•ELISA利用了抗体与抗原之间的高度特异性反应，实现对目标物质的检测。
•一般的ELISA试验分为直接ELISA、间接ELISA、间接竞争ELISA 和竞争ELISA四种常见形式。
步骤详解1.试样处理与包被：待测样品中的目标物质与特异性抗体结合，形成目标物-抗体复合物。
2.洗涤：将未结合的其他物质洗去，保证后续反应的准确性。
3.二抗添加：加入与目标物-抗体复合物反应的次级抗体，次级抗体通常与酶分子偶联。
4.洗涤：去除未结合的次级抗体，减少背景干扰。
5.底物添加：加入酶底物，与酶发生反应后会呈现可见的颜色变化。
6.反应停止：通过添加反应停止剂停止酶反应，停止颜色的发展过程。
7.读数与结果分析：使用光谱仪或光密度计读取样品的吸光度或荧光强度，并根据标准曲线计算待测样品中目标物质的浓度或定性判断。
3. ELISA的优势和应用领域•高灵敏度和特异性：ELISA可以检测目标物质的微量浓度，并在复杂样品中准确鉴定。
•定量和定性分析：根据标准曲线，ELISA可以定量测定待测样品中目标物质的浓度，也可用于定性判断目标物质的存在与否。
•广泛应用于医学、农业和生物科学等领域：ELISA在肿瘤学、感染性疾病诊断、食品安全监测等方面有着重要的应用价值。
4. 总结•斑点酶联免疫吸附试验（ELISA）是一种常见且广泛应用于生物学研究和临床诊断的生物分析技术。
•ELISA通过抗体的高度特异性与目标物质之间的相互作用，结合酶标记技术实现对目标物质的检测和分析。
酶联免疫斑点技术在结核病诊断中的应用
（ 阳性率 ３ ． ％ ） 正常对 照 ３ ７８ ， ０例 中有 ２例 阳性 （ 阳性率 ６ ７ 。结核抗体诊 断结核病 的灵敏 度为 ３ ． ％ ， ． ％）Байду номын сангаас８ ３ 特异
度为 ９ ． ％ ；Ｐ ３ ３ Ｐ Ｄ试验痰 菌 阳性患 者 ５ ７例 中阳性 ２ ７例 （ 阳性率４ ．％ ） 痰 菌阴性 结核 ３ ７４ ， ７例 患 者中 阳性 ２ ０例 （ 阳性率５ ．％ ） 正常对照 ３ ４１ ， ０例 中有 ３例 阳性 （ 阳性 率 １ ．％ ） ０ ０ 。见表 １ 。
观察结果 ， 测量硬结 （ 横径 ＋纵 径 ）２ 均径 ≥５ｍ ／， ｍ为 阳
性 反 应 ，０～１ ｎ 为 中 度 阳 性 ， ０ｍ 或 有 水 泡 、 ｌ ９ｉ ｌ ｎ ≥２ ｍ 双
例数
５ ７ ３ ７ ３ Ｏ
Ｅ ＩＰ ＬＳＵｒ百分率 结核抗体 百分率 Ｐ Ｄ试验 百分率 Ｐ
４ ２ ２ ７ １ ７． ３ ７ ７ ０ ３． ３． ３ ２ ２ １ ４ ２ ３ ． ８６ ３ ８ ７． ６７ ． ２ ７ ２ ０ ３ ４ ． ７４ ５ １ ４． １ ． ００
２１ ００年 第 ２ ２卷 第 ８期
２ １ Ｖｏ ． ２ Ｎｏ ８ ０ ０， １ ２ ．
上 海 预 防 医 学 杂志
Ｓ ａ ｇ ａ ｏ ｍ ￣ ｏ ｒ ｖ ｎ ｉｅ Ｍｅ ｉｉ ｅ ｈ ｎ ｈ ｉＪ ｕ ｆ Ｐ ｅ ｅ ｔｖ ｄ ｃｎ
文章 编 号 ：０４— ２ １ ２ １ ０ ０ ２ 一０ １０ ９ ３ （０ ０）８— ４ ｔ ２
１ ２ 方 法 ．
③ 结核患 者 Ｅ ＩＰ Ｔ 结核 抗体 、Ｐ ＬＳ Ｏ 、 Ｐ Ｄ试验 的特征 ： Ｅ ＩＰ Ｔ试 验 阳 性 预 测 值 为 ９ ． ％ ， 性 预 测 值 为 ＬＳ Ｏ ８６ 阴 ５ ．％ ， ｏ ｄｎ指数 为 ７ ． ％ ， 核抗 体为 阳性预 测值 ３７ Ｙ ｕｅ ０１ 结
酶联免疫斑点试验的原理
酶联免疫斑点试验的原理1. 引言酶联免疫斑点试验（Enzyme-Linked ImmunoSpot Assay，简称ELISPOT）是一种用于检测细胞分泌物的敏感且高通量的免疫学技术。
该技术可以定量检测单个细胞分泌的蛋白质或细胞因子，在免疫学研究、药物开发和临床诊断中具有广泛的应用。
2. 原理概述ELISPOT技术基于酶标记抗体和特异性抗原结合的原理。
它通过将待测细胞与特定抗原刺激后，将细胞分泌物捕获到固相载体上，然后使用酶标记二抗进行检测，最后通过显色反应可视化并计数斑点数量。
该技术具有高灵敏度、高特异性和高通量等优势。
3. 实验步骤步骤一：制备固相载体在ELISPOT实验中，常用的固相载体是多孔膜板或膜片。
首先，在载体表面涂覆特异性抗原或抗体，以便捕获待测细胞分泌的特定蛋白质或细胞因子。
步骤二：孵育待测细胞将待测细胞加入到含有特异性抗原的培养基中，使其与抗原发生特异性反应。
通常，实验者会设置对照组，包括阴性对照组（只有培养基）和阳性对照组（含有已知分泌物的细胞）。
步骤三：洗涤将孵育后的细胞用洗涤缓冲液洗去未结合的细胞和其他杂质。
步骤四：二抗处理加入酶标记的二抗（如辣根过氧化物酶标记的抗IgG），使其与待测细胞分泌物中的特异性蛋白质或细胞因子结合。
步骤五：显色反应加入适当的底物和显色剂，通过酶催化作用产生可见信号。
常用的显色剂是BCIP/NBT，在酶催化下会生成紫色斑点。
步骤六：计数和分析使用显微镜对固相载体进行观察，并使用计算机软件或手工计数斑点数量。
斑点的数量代表了待测细胞分泌物的水平。
4. 原理解析特异性抗原和抗体结合固相载体表面涂覆的特异性抗原或抗体与待测细胞分泌物中的特定蛋白质或细胞因子结合。
这种结合是通过免疫反应中抗原与抗体之间的特异性识别实现的。
酶标记二抗检测酶标记二抗是一种能够与待测细胞分泌物中的特异性蛋白质或细胞因子结合并具有酶活性的二级抗体。
常用的酶标记二抗有辣根过氧化物酶标记的抗IgG。
TSPOT分析
有学者指出：
诊断活动性结核病患者外周血T-SPOT.TB斑点形成细 胞中位数为442SFCs/10^6 PBMC 。
排除活动性结核病患者外周血T-SPOT.TB斑点形成细 胞中位数为124SFCs/10^6 PBMC。
以72SFCs/10^6 PBMC为界值时,诊断活动性结核病的 敏感性为71.9%,特异性76.4%,ROC曲线下面积为 0.810。
不能确定病变部位。
国外文献报道应用ELISPOT方法检测活动性 肺结核的敏感性可达到 78% ~100%, 特异性 可达到80% ~100%。
国内学者研究应用ELISPOT方法检测活动性 肺结核的敏感性为83%~98.8%，特异性 65%~100%，阴性预测值81.8~91.6%，阳性 预测值45.3~67.9%。
通常正常结果，空白对照孔没有或有很少的斑点而PHA对照孔斑 点数超过20个。
空白对照孔斑点数超过10个时结果被认为是“不确定”。 当PHA对照孔斑点数少于20个时，检测结果被认为是“不确定”。 当空白对照孔斑点数为0-5个并且（抗原A或抗原B斑点数）减去
（空白对照孔斑点数）等于5-7时，此结果被认为是“灰区”， 应当利用所有可利用相关的的临床信息进行判断。必要时可进行 复查。 T-SPOT.TB的实验结果也有用每10^6 PBMCs中斑点形成细胞 (SFCs)的数目来描述，即SFCs／106PBMCs。
一、 T-SPOT.TB的原理
Lalvani建立以RDI编码的结核特异性抗原6KD早 期分泌靶向抗原和10KD培养滤过蛋白肽段库为 刺激源，检测外周血中结核特异性释放γ干扰素 的T淋巴细胞。
二、结果的判断
试验分四组：空白对照组、抗原组(ESAT-6和CFP-10)、阳性对 照组(植物血凝素PHA)。
ELISPOT.
加入酶底物显色形成斑点 （SPOT）
Coating Ab 包被培养板 取外周血单核细胞 或脾淋巴细胞 根据实验要求， 培养液中加入 所需刺激物， 预先将所检测细胞 孵育24-42小时 40C过夜 0.05%PBS-Tween20(PBST) 洗板5次
无菌
每孔加入1%BSA阻断 或者 370C孵育1小时 按实验设计 加入含或不含刺激剂的培养液 及一定数目细胞孵育5-24小时 脾单直 淋核接 巴细取 细胞外 胞或周 血
酶联免疫斑点(ELISPOT)技术
中山医学院免疫学教研室
基 本 原 理
根据实验设 计加入淋巴 细胞及含或 不含刺激因 子的培养液 孵育 Coating Ab 包被培养孔 并经BSA阻断
活化的淋巴细胞可分泌细胞 因子与次加入生物素 标记的抗细胞因子抗体及酶 标抗生物素抗体进行反应
可在单细胞水平检测淋巴细胞对特异性抗原的 反应能力 计数特异性抗原刺激下分泌性淋巴细胞产生的 比例 有效、快速、灵敏度高
使用高吸附性的专用ELISPOT培养板 细胞因子的检测不易受非分泌细胞的干扰 比传统的ELISA和细胞内细胞因子染色法敏感20-200倍
易操作 样本量大的情况下实验结果可用计算机图象分 析系统进行快速、客观的分析
技术要点
预孵育的淋巴细胞若有坏死/凋亡（培养液过黄） 会影响斑点的形成 提取淋巴细胞时应尽量去除红细胞的干扰 入ELISPOT培养孔的细胞须为单细胞悬液
细胞孵育过程应保证ELISPOT培养板静置，CO2培 养箱应保证稳定，避免震荡 稀释抗体及GABA冻干粉时建议无菌操作，保存过 程避免细菌的污染以保证其效用
显色剂I和II应避光保存，不使用时切勿混合
ELISPOT 实 验 结 果 示 意 图
分子医学技能：酶联免疫斑点(ELISPOT)技术
特点：
❖斑点可持久保存并进行计数分析
❖易操作、有效、快速、灵敏度高
✓ 细胞因子的检测不易受非分泌细胞的干扰 ✓ 比传统的ELISA和细胞内细胞因子染色法敏感20-200倍
❖样本量大的情况下实验结果可用计算机图象分 析系统进行快速、客观的分析
❖
基
Coating Ab
本
包被培养孔
原
理
根据实验设 计加入淋巴 细胞及含或 不含刺激因 子的培养液
酶联免疫斑点(ELISPOT)技术
❖ELISPOT（Enzyme-linked Immunospot Assay）
▪ 结合了细胞培养技术与酶联免疫吸附技术（即 ELISA技术），能够在单细胞水平检测细胞因子 的分泌情况；
▪ 用抗体原位捕获培养中的细胞分泌的细胞因子， 并以酶联斑点显色的方式将其表现出来。
❖双色ELISPOT结果示意图
蓝色：IFN-γ,红色：IL-2; 蓝色：IFN-γ,红色：IL-17
❖ ELISPOT
▪ B细胞杂交瘤的筛选 ▪ 化合物和药物免疫学反应的检测 ▪ 优化树突细胞和T细胞的抗肿瘤活性 ▪ 靶向疫苗的质控
方 ▪ 自身免疫疾病的诊断和预后分析 法 ▪ 自身免疫疾病免疫治疗的监控 主 ▪ 过敏性疾病的脱敏治疗的监测 要 ▪ 器官移植中排斥反应的预测 用 ▪ 微量组织、肿瘤和免疫细胞分泌谱的分析 途 ▪ 结核病的诊断
▪ 显色剂I和II应避光保存，不使用时切勿混合
❖ ELISPOT 实 验 结 果 示 意 图
细胞因子A
双抗体包被
❖双色ELISPOT原理
培养细胞 细胞因子B
包被抗体
Biotin-检测抗体
HRP-检测抗体 BCIP/NBT底物
AEC底物
ELISpot检测技术操作要求及质量控制
ELISpot检测技术操作要求及质量控制作者：刘佳来源：《兽医导刊》 2017年第9期酶联免疫斑点检测技术(enzyme-link immunospot assay，ELISpot) 是近年来发展起来的检测细胞因子免疫学检测技术，是在酶联免疫吸附技术(ELISA) 基础上与细胞培养技术充分结合而建立起来的一种可以在体外检测单细胞水平培养的特异性抗体分泌细胞的新型检测技术，此技术可以快捷、简便的对细胞因子分泌量进行定量，目前已经成为国际公认的抗原特异性T细胞免疫学研究的主流技术。
由此可以预见，该检测方法在动物免疫研究领域将会得到广泛应用，发挥其重要作用。
但是，此项技术尚未形成标准化，对细胞含量、细胞浓度、孵育、显色时间等优化条件还没有形成完整体系。
因此，在检测工作实践中，总结实验操作步骤注意事项，提高检测水平，对提高ELISpot技术检测的准确性以及对各个因素进行优化，建立稳定的检测体系具有重要意义。
一、细胞质量控制1. 采血。
选取45 ～ 50 日龄，没有疫苗接种经历的仔猪，从前腔静脉采集外周静脉血，保证无菌操作，抗凝剂抗凝。
采血后轻摇，使血液与抗凝剂充分混匀，避免出现血凝块，影响分离效果。
震荡过于剧烈或保存不当，会出现溶血现象。
2. 淋巴细胞分离。
6 h 内进行外周血单个核细胞(PBMC) 的分离，时间过长会影响活细胞数，淋巴细胞的活细胞比例直接影响酶联免疫斑点的形成。
将稀释好的细胞悬液沿管壁缓慢加至淋巴细胞分离液液面上，2 000 转/ 分钟离心10 min，转速不宜过高，否则会使细胞壁破裂。
离心后，离心管中由上至下细胞分为四层，即血浆或者组织匀浆液层、环状乳白色淋巴细胞富集层、透明分离液层、红细胞层。
吸出中间环状乳白色PBMC 富集层，吸取方法可以将组织匀浆层用吸管去掉，将乳白色淋巴细胞吸出，也可以直接将吸管插入淋巴细胞富集层吸出。
吸液要慢、稳，避免吸出红细胞。
洗涤后，如果有红细胞存在，可以使用红细胞裂解液，将红细胞去除。
简述酶免疫技术的分类
酶免疫技术：分类及应用
酶免疫技术是许多生化分析和医学诊断中重要的一种工具。
它基于抗原与抗体间的特异性反应，将酶标记的抗体或抗原作为探针，通过检测其酶反应产物来检测并定量目标分子。
酶免疫技术种类繁多，主要分为以下几类：
1.酶联免疫吸附测定法(ELISA)
这是一种常用于诊断感染性疾病、肿瘤和免疫相关疾病的方法。
它利用酶标记的抗体或抗原作为探针，检测血清、尿液、唾液等生物样品中的分子。
ELISA可以快速、准确地检测出细菌和病毒感染的抗体和抗原，是一种常见的诊断方法。
2.免疫斑点法
由于其简单和方便的特点，这种技术常用于检测微透镜膜穴、肺结核和疱疹病毒的感染。
免疫斑点法也可用于检测各种细胞因子，如白细胞介素（IL）-2、干扰素（IFN）-γ等。
3.免疫层析技术
免疫层析技术也称为免疫固相卡，利用固相化学材料吸附抗体或抗原，将它们与待测分子结合，从而完成检测。
该技术可以快速完成检测，广泛用于检测激素、蛋白质等分子结构查询。
4.F快速诊断技术
该技术可用于基于解离测试的负压移位检测，可检测多种微生物、各种传染病以及不同种类的癌症。
快速诊断技术可以快速、准确地检测出更多感染疾病的标记分子，是一种非常灵敏的定量技术。
酶免疫技术已经广泛应用于医学诊断、药物开发和基因工程。
通过不同的酶免疫技术，可以检测、分析和探索多种分子的生物学特性，有助于促进科学研究和临床医学的进步和发展。
分子医学技能-免疫：酶联免疫斑点(ELISPOT)技术
非无菌
PBST洗板10次
加入生物素标记 的detector Ab
370C孵育1小时后，PBST洗板5次
加入酶标抗生物素抗体(GABA)
370C孵育1小时后，PBST洗板5次
40C暗处混合显色剂I和II, 加入显色剂I/II,
暗处室温孵育20-30分钟
显微镜下观察至斑点形成， 去离子水清洗培养板 室温干燥后
酶联免疫斑点(ELISPOT)技术
一、ELISPOT检测细胞因子实验技术
❖Байду номын сангаас
基
Coating Ab
本
包被培养孔
并经BSA阻断
原
理
根据实验设 计加入淋巴 细胞及含或 不含刺激因 子的培养液
孵育
活化的淋巴细胞可分泌细胞 因子与Coating Ab结合
洗除细胞，依次加入生物素 标记的抗细胞因子抗体及酶 标抗生物素抗体进行反应
106抗原呈递细胞（APC）中混入特定数 量的IFN-γ+的T淋巴细胞 ，经下列方 法检测： ▪ ELISPOT ▪ 细胞内细胞因子染色（FACS） ▪ ELISA
X坐标： 106 APC中实际IFN-γ+T细胞数量 Y坐标： 各检测方法的检测结果
▪ B细胞杂交瘤的筛选
ELISPOT
▪ 化合物和药物免疫学反应的检测
预先将所检测细胞 孵育24-42小时
40C过夜 0.05%PBS-Tween20(PBST)
洗板5次
每孔加入1%BSA阻断
370C孵育1小时
按实验设计 加入含或不含刺激剂的培养液 及一定数目细胞孵育5-24小时
或者
脾 淋 巴 细 胞
单 核 细 胞 或
直 接 取 外 周 血
酶联免疫斑点技术介绍
酶联免疫斑点技术介绍(总19页)--本页仅作为文档封面，使用时请直接删除即可----内页可以根据需求调整合适字体及大小--酶联免疫斑点技术介绍一、 ELISPOT技术概述1. 技术原理和技术特点ELISPOT全名为酶联免疫斑点检测，英文：（Enzyme-linked Immunospot Assay）。
它结合了细胞培养技术与酶联免疫吸附技术（即ELISA技术），能够在单细胞水平检测细胞因子的分泌情况。
其技术原理，一句话概括就是：用抗体捕获培养中的细胞分泌的细胞因子，并以酶联斑点显色的方式将其表现出来（Sedgwick JD 2005）。
该技术检测细胞因子具有三大优点：其一，灵敏度高。
在一百万个阴性细胞中只要有一个分泌细胞因子的阳性细胞即可被检测出来。
这是目前为止，最为灵敏的检测技术，灵敏度比传统的的ELISA方法高2-3个数量级。
其二，单细胞水平，活细胞功能检测。
ELISPOT检测的是单个细胞分泌，而非细胞群体的平均分泌。
在检测的过程中，有活细胞培养与抗原刺激阶段，检测的是活细胞的功能，而非死细胞的遗留物。
其三，操作简便经济，可以进行高筒量筛选。
ELISPOT没有复杂的细胞体外扩增过程，不使用同位素，不需要大型的、专门的实验仪器设备。
按照标准化的实验操作，一个实验者可以同时处理数百个样品，效率远远高于其它检测方法（Kalyuzhny AE 2005）。
实验设计在96孔培养板上进行，直接以培养板的塑料板底或者PVDF膜以及硝酸纤维素膜为基质，包被上特异性的单克隆抗体，用以捕获细胞分泌的细胞因子。
（由于涉及到细胞培养的过程，对单克隆抗体的要求要远高于ELISA中的捕获抗体，该抗体需要无毒，不含内毒素，亲和力高等特点。
）之后，在培养板的孔内加入细胞培养基（现在无血清ELISPOT技术已经成熟，培养基中可以不再含有血清）、待检测的细胞以及抗原刺激物进行培养。
在特异性的抗原或者非特异性的有丝分裂原的刺激下，数小时之内，T细胞就会开始分泌各种细胞因子。
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酶联免疫斑点技术
摘要:介绍了酶联免疫斑点技术(ELISPOT)的发展历程，检测原理及应用方面的相关内容。
关键词：酶联免疫斑点技术；免疫检测技术
随着酶免疫分析技术在医学及生物学领域的广泛应用, 使体外检测各种细胞因子和抗体研究有了新的突破。
在研究免疫应答机制时, 以往人们常用酶联免疫吸附试验(ELISA) 检测体液中游离的细胞因子(CK) 或抗体, 但由于游离的循环抗体或CK 半衰期不同, 使之在体液中不断地被代谢或与靶器官结合, 而不能确切地反应体内抗体及CK 水平。
80 年代中期, Sedgw ick、Ho lt 和Czerk in sky 等根据ELISA 技术的基本原理, 建立了体外检测特异性抗体分泌细胞和CK 分泌细胞的固相酶联免疫斑点(ELISPOT) 技术, 因其具有较高的特异性和敏感性, 目前正被国内外广泛应用, 对探索自身免疫系统疾病发病机制具有重要意义。
1.ELISPOT技术的发展史
1.1溶血空斑技术.80 年代初用于检测抗体形成细胞, 是对细胞免疫学的重要方法学贡献, 可从单细胞水平研究抗体的产生。
但该方法不够灵敏。
另外, 许多抗原决定簇与红细胞表面耦联困难, 使该方法应用受到限制。
1.2细胞ELISA.以酶标记物取代放射标记定量细胞表面分子, 因微量板内有细胞的存在将会产生较高背景。
另外, 细胞需固定于平板上, 也会引起非特异性结合, 产生假阳性结果。
固定还会引起一些细胞表面抗原的破坏而影响检测的敏感性。
1.3ELISPOT.由于上述原因, 1983 年两个研究小组分别在瑞典和奥地利同时报道了另一抗体分泌细胞的检测技术, 即ELISPOT。
1988 年, 首次用该方法检测CK IFN-γ分泌细胞, 目前已多用此方法检测CK, 其技术方法亦在逐步更新。
多年来作者实验室已用该方法检测重症肌无力及多发性硬化患者外周血的CK 分泌细胞, 共计数百例, 并发表论著数篇, 总结了一些方法学方面的经验。
2. ELISPOT技术的基本原理
2.2ELISPOT 检测原理.在细胞受到刺激后局部产生CK,该CK被特异性的单克隆抗体捕获。
洗去分泌细胞后,被捕获的CK与生物素(Biotin) 标记的二抗结合,然后再与碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase , AKP) 或辣根过氧化物酶(Horseradish peroxidase , HRP) 标记的链亲和素结合。
经底物,如BCIP/ NBT孵育后, 在PVDF 孔板出现有色的斑点即表明细胞产生了CK。
通过显微镜或ELISPOT 酶联斑点分析系统对斑点进行分析即可获得结果。
2.2ELISPOT技术原理.ELISPOT的技术原理与ELISA 基本相似,即通过生物酶高催化效率放大反应效果,进而达到很高的敏感度,便于检测微量的抗原或抗体。
其实验设计是在96 微孔培养板的底部披覆PVDF 薄膜,包被经特殊挑选的、无毒性(不含Sodium azide、内毒素Endotoxin) 的单克隆抗体。
然后洗脱未结合的单克隆抗体,封闭。
随后将经适当分离处理后的细胞(如外周血单核细胞(Peripheral blood mononu2clear cell ,PBMC) ) 分配到微孔上,用适当的抗原刺激,并将96孔板放置于温箱中过夜培养一段时间。
一般情况下,记忆型T细胞在受抗原刺激后数小时开始分泌CK,此时局部(紧靠分泌细胞的周围) 分泌出的CK会被PVDF 薄膜上包被的特异性抗体捕获。
洗去微孔中的细胞和未结合的组分之后,被捕获的CK进一步使用生物素标记的特异性检测抗体来标志。
然后将未结合的酶洗除,再以AKP 或HRP 标记的链亲和素与之作用,并加入底物(如BCIP/ NBT) 使其呈色,有反应作用的细胞会留下大小染色的斑点。
斑点多少可以在ELISPOT读数系
统上进行自动化计数或在立体显微镜上进行人工计数。
当然也可以在96 微孔培养板上包被特异性捕获抗体来检测特异的CK分泌细胞。
3. ELISPOT技术的优缺点
3.1优点.(1) 侧重于细胞检测, 弥补了体液中CK 半衰期短的不足, 当体液中某CK 含量较低时, 用ELISPOT 法检测具有较高灵敏性。
(2) 既可检测自发分泌细胞, 又可检测抗原特异性CK 分泌细胞, 具有较高特异性, 并可观察药物治疗反应,且首次使对CSF 中T、B 细胞研究成为可能, 对神经免疫疾病发病机制研究及临床疗效观察均有重要价值。
(3) 因新鲜标本来源的限制, 作者实验室用ELISPOT 法试测了经过程序冰冻冻存的外周血或CSF 单个核细胞的分泌功能, 发现与新鲜标本差异无显著性, 既可减少试剂浪费, 又可利于临床做回顾性或前瞻性研究。
3.2缺点.(1) 比ELISA 技术复杂而费时, 需严密控制实验条件, 操作人员需技术熟练, 并能对实验结果进行分析, 以减少实验偏差。
(2) 属半定量方法, 试剂比ELISA 价格贵, 当细胞产生大量CK时, 不宜选用ELISPOT , 而可选用ELISA。
4. ELISPOT技术的应用及展望
IFN-γ是由Thl细胞亚群分泌的一类细胞因子，能够促进CTL、NK细胞及巨噬细胞的活化和增殖，介导细胞毒效应，在抗病毒感染中发挥着重要作用。
目前检测NDV诱导特异性IFN-γ的方法主要是ELISA试验，但该方法只能定性检测培养上清中IFN-γ含量，而无法进行细致的免疫学机理研究。
酶联免疫斑点法(EHSPOT)是基于ELISA试验发展起来的，即可从单细胞水平检测抗体分泌细胞，又可以检测分泌量的一种细胞免疫学检测技术。
从脾淋巴细胞的浓度、培养时问、抗原刺激量等方面确立了检测NDV诱导特异性IFN-γ的ELISPOT方法，进而为新城疫细胞免疫的研究提供了一种更为准确、灵敏、特异的试验方法。
目前，ELISPOT法在全球尚未完全标准化，研究人员必须采用最佳匹配(best pair)的包被抗体和检测抗体、ELISPOT 板、形成斑点的底物及其显色时间等。
如果上述因素都能够标准化，就可以在许多研究领域中快速获得有可比性、更有价值的免疫学研究成果，从而为免疫学研究开辟新的研究思路和方法。
现在ELISPOT主要用于医学研究中。
对于疫苗研究，中国药品生物制品检定所
在《预防用DNA 疫苗临床前研究技术指导原则》及《预防用以病毒为载体的活疫苗制剂的技术指标原则》等规定中均指出，ELISPOT是检测和评价疫苗的细胞免疫的有效方法。
由于它具有诸多优点，可以预见该方法在免疫学研究、免疫监测、动物疫病监测、疫苗评估等多方面将会发挥极其重要的作用。