酶联免疫斑点检测技术研究进展
酶联免疫斑点试验检测技术(Elispot)在诊断结核性脑膜炎中的应用
提供 ， 脑脊液 Ｔ — Ｎ Ｐ Ｒ） 平 ≥５０ ｃｐｅ／ ｌ 断 为 阳 ＢＤ Ａ（ Ｃ 水 ０ ｏ ｉ ｍ 判 ｓ
性 ， ５ ０ｃｐｅ ｍ 判 断 为 阴 性 。 检 测 结 果 使 用 Ｐｉ ５０软 ＜ ０ ｏｉ ／ ｌ ｓ ｒｍ ． ｓ
件包进行数据统计和统计学分析。两组 间率 的比较采用卡方
特 异 性 ｒ 扰 素 （Ｆ —） 平 可 以 用 于 结 核 分 枝 杆 菌 感 染 的 干 ＩＮ ｒ 水
断为 阳性 ， 抗 原 检 测 结 果 为 阴性 ， 果 判 断 为 阴 性 ； 有 ３种 结 所 脑 膜 脑 炎 病 例 均 常 规 行 脑 脊 液 Ａ Ａ、 脊 液 Ｔ — Ｎ Ｐ Ｒ） Ｄ 脑 Ｂ Ｄ Ａ（ Ｃ
检测 。脑脊 液 Ａ Ａ使 用 酶 标 法 进 行 检 测 ， 据 国 内 同行 Ｄ 根 ２０ ０４年对脑脊 液 Ａ Ａ在结 核性脑 膜脑 炎 中研 究 的标准 Ｊ Ｄ ， 脑脊液 Ａ Ａ１８Ｕ Ｌ判断为 阳性 ， ８Ｕ Ｌ判断为阴性 ； Ｄ ＞ ／ ＜ ／ 脑脊
液 Ｔ —Ｎ Ｂ Ｄ Ａ荧 光 定 量 聚 合 酶 链 反 应 试剂 由达 安 基 因有 限 公 司
选 非 结 核 性 脑 膜 脑 炎 病 例 均 通过 临床 治 疗 转 归 及 实 验室 检 查 最终确诊 。
方 法
所 有 病 例 均抽 取 乙 二 胺 四 乙 酸 （ Ｄ Ａ） 凝 血 ５ｍ ， ＥＴ 抗 ｌ送
实 验 室 行 Ｅｉ ｏ检 测 。检 测 结 果 根 据 斑 点 数 量 设 定 ， 一 反 ｌｐ ｔ ｓ 每
术 在 结 核 性 脑 膜脑 炎 中 的应 用 价 值 。
临 床 资 料
、
果
在 ７ 例 结 核 性 脑 膜 脑 炎 的 诊 断 中 ，ｌｐ ｔ 性 者 ４ ３ Ｅｉ ｏ 阳 ｓ ５
免疫学检验技术的研究进展
细胞 ，产生 Ｃ Ｋ或 Ｉ。细胞下方 的固相单克隆抗体就会捕获 Ｃ ｇ Ｋ
１ 研 究进展
１１ 荧光 素 标 记 抗体 技 术 ．
或Ｉ ｇ物质。 细胞被清洗后 ， 加入生物素化 的第二抗体 ， 抗体 和 Ｃ Ｋ
或 Ｉ 物质结合后 ， ｇ 再加以酶做标记的生物素或亲和素反应 ， 以酶 流式荧光免 疫微 球分析技 底物显色 ， 阳性细胞就可形成直径约 ５ ～２ ０ Ｔ大小不等的圆 ０ ０ Ｉ Ｉ
现 代 免 疫 学 检 验 技术 源 于标 记 技 术 在 免 疫 学 中 的应 用 。科
１ ． 酶 联 免疫 斑 点 技 术 ．２ ２
酶 联 免 疫 斑 点 技 术 是 一 种用 于测 定
技 的进步推动免疫检 验技术 的迅速发展 ，正从单一 的免疫诊断
Ｂ细 胞 分 泌 免 疫 球 蛋 白 、 Ｔ细胞 分 泌 细 胞 因 子功 能 的分 析 技 术 ，
定 阳性 Ｔ Ｂ细胞族群 的产生则可以通过斑点直径 的大小 可以直 、 接反映。酶联免疫斑点技术既可用于分泌抗体的 Ｂ细胞 ， 也可用
于分 泌各 类 Ｃ Ｋ的 Ｔ细胞 。 联 免疫 斑 点 技 术 也是 Ｔ细胞 功 能检 酶 测 的标 准 技 术 ， 有 较 高 的检 测 灵 敏度 日 具 。
技术 向单细胞 、 多基 因、 微量化等方面发展 。而哮喘 、 器官和骨髓
移植 、 自身免疫性疾病 、 变态反应 、 淋巴细胞和浆细胞 的恶性肿 瘤 以及 继发性 和原 发性免疫 缺陷 的临床诊 断都客 观要求 免疫
学 检 验 技术 更 加 精确 ， 且能 够 定 量 评 价 临床 治 疗 的 有 效性 。 并
１ ． 元素标记免疫检 验技术 ．１ ３
元素标记 免疫 检验技术 中的标
酶联免疫斑点试验
酶联免疫斑点试验
酶联免疫斑点试验（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，简称ELISPOT）是一种高灵敏度的免疫学检测技术，可用于检测单个细胞
的分泌物，如细胞因子、抗体、酶等。
该技术广泛应用于疾病诊断、
药物筛选、疫苗研究等领域。
ELISPOT的原理是利用特定的抗体捕获分泌物，然后使用酶标记的二
抗或底物来检测捕获的分泌物。
具体步骤如下：
1. 准备试板：将多孔板涂上特定的抗体，使其能够捕获分泌物。
2. 细胞处理：将待检测的细胞加入试板中，使其与涂有抗体的孔相互
作用。
3. 洗涤：将试板洗涤，去除未结合的细胞和其他杂质。
4. 二抗标记：加入酶标记的二抗，使其与捕获的分泌物结合。
5. 洗涤：将试板洗涤，去除未结合的二抗和其他杂质。
6. 底物反应：加入底物，使其与酶标记的二抗反应，产生可见的斑点。
ELISPOT的优点是灵敏度高、特异性好、操作简单、结果可靠。
它可
以检测单个细胞的分泌物，因此可以用于研究细胞免疫应答、肿瘤免
疫学、感染病毒的免疫学等领域。
此外，ELISPOT还可以用于药物筛
选和疫苗研究，帮助科学家们开发更有效的药物和疫苗。
ELISPOT的缺点是需要较长的实验时间和较高的成本，同时需要专业
的实验技能和设备。
此外，ELISPOT只能检测单个细胞的分泌物，无
法检测细胞表面分子的表达情况。
总之，ELISPOT是一种重要的免疫学检测技术，具有广泛的应用前景。
随着技术的不断发展，ELISPOT将会在疾病诊断、药物筛选、疫苗研
究等领域发挥越来越重要的作用。
酶联免疫斑点技术(ELISPOT)及其应用研究进展
者方 面 具有 ９％ ９ 的符 合 率 。当 比较 Ｔ Ｔ方 法和 自 Ｓ
建 Ｅ ＩＰ Ｔ方 法 时发现 ， ６ 的 Ｔ Ｔ阳 性 受试 者是 ＬＳ Ｏ ３％ Ｓ Ｅ Ｉ Ｐ Ｔ阴性 ， ２ 的 Ｔ Ｔ阴 性 受 试 者 是 Ｅ Ｉ Ｐ Ｔ Ｌ ＳＯ １％ Ｓ ＬＳ Ｏ 阳性 。另 外 ， ８ 的 Ｅ ＩＰ Ｔ Ｍ Ｔ阴性 受 试 者 是 ７％ ＬＳ Ｏ— Ｐ Ｅ Ｉ Ｐ Ｔ Ｂ Ｇ阳 性 ， 这 些 人 中 大 部 分 都 接 种 过 Ｌ ＳＯ —Ｃ
胞 中检 出 １ 分 泌待 检 Ｃ 个 Ｋ的细 胞 ， 其灵 敏 度 非 常 高 。 为其 使用 了识 别 Ｃ 子 中 ２ 不 同表 位 因 Ｋ分 个 的 ２种 单克 隆抗 体 ，因而 这种 方 法有 着 高度 的特
异性 ［。 过显 色 反应 ， ５通 ］ 在细 胞 分泌 可溶 性 蛋 白的 相应位 置 上显 现清 晰 可辨 的斑 点 ，可 直接 在 显 微 镜下 人工 计数 ，或通过 Ｅ ＩＰ Ｔ分 析 系 统对 斑 点 Ｌ ＳＯ
领 域 。本 文介 绍 了 Ｅ Ｉ Ｐ Ｔ的原 理 和特 点 ，对 Ｅ ＩＰ Ｔ的应 用 研 究进 展 进行 了综述 。 Ｌ ＳＯ ＬＳＯ 关 键 词 ：酶联 免疫 斑 点 （Ｌ Ｓ Ｏ 应 用 Ｅ ＩＰ Ｔ 中 图分 类 号 ：￥ ５ ． ＋ ８ ２ ４３ 文 献 标 识 码 ：Ａ
进 行计 数 ， 进行 高通 量 筛选 ， 率远 远 高 于其他 检 效
测 方法 ［。Ｅ Ｉ Ｐ Ｔ自创 立 至今 ２ ６ ＬＳＯ ］ ０多 年来 不 断发
Ａ ｓ ｙＥ ＩＰ Ｔ 技术 是利 用预 先包 被好 抗 原或抗 ｓａ ，ＬＳ Ｏ ） 体 的微量 板从 单细 胞 水平 检测 特异 性 抗 体分 泌 细 胞或特异 性细胞 因子 （ｙｏ ｉｅＣ） ｃ ｔｋ ｎ，Ｋ 分泌细 胞 的免 疫 学检测技 术 。 ９ ３年 ，ｅｇ ｉｋ 和 Ｃ ｅｋｎ ｋ １８ Ｓ ｄｗ ｃ ｔ ｚｒ ｉｓ ｙ 嘲 等根据 酶 联免疫 吸 附试验 （Ｌ Ｓ） Ｅ ＩＡ 的基 本原 理 结
酶联免疫斑点技术及其在结核诊断中的研究进展
作者单位 ：北京市结核病胸部肿瘤研究所结核病分子生物学研 究室 通讯作者 ：张宗德 ，电子信箱 ：ｚｄ １＠１３ｃ ｒ ｚ ４ ７ ６ ．ｏ ｎ
结核 病与 胸部 肿 瘤 ２０ ０ ８年 第 ４ 期 胞 。Ｅ ＩＰ 简 单 、 稳定 、灵 敏 ，不 受细 胞 Ｌ Ｓ ＯＴ 因子 代 谢等 因素 的 影 响 ，可 在单 细胞 水 平 检 测 淋 巴 细胞 对 特 异 性 抗 原 的 反 应 能 力及 计 数 特 异性 抗 原 刺 激 下 分 泌 性 淋 巴细 胞产 生 的 情 况 ，能够 比较 真 实 地 反 映 体 内 细胞 因子 的 水 平 ，Ｅ Ｉ Ｐ 现 已被 运 用 于 各 种疾 病 诊 断 和 Ｌ Ｓ ＯＴ 科 学研 究 中 。 Ｔ Ｔ 应 用 的纯 化 蛋 白衍生 物 （ｕｉｅ Ｓ所 ｐ ｒ ｉｄ ｆ ｐｏ ｉｄｒ ａｖｓ Ｐ ｒｔｎ ｅｉ ｔ ｅ，Ｐ Ｄ）是 存在于结 核分枝 杆 ｅ ｖｉ
产 生 多 种 细胞 因子 发 挥 免疫 效 应 ，其 中 Ｙ干 扰 素 （Ｆ Ｙ）是 最 为 关键 的细 胞 因子 。 因 ＩＮ—
此 ，检 ￣ ｌＮ— 水 平或 分 泌ＩＮ— ｇ Ｆ Ｆ Ｙ的 效应 Ｔ 细 胞 的水 平就可 以判 断是 否存在 结核 感染 。 Ｅ ＩＰ Ｔ 通 过 检测 分 泌 细 胞 因子 的细 ＬＳ 量 夹 ， Ｌ Ｓ Ｌ Ｓ ＯＴ ￣Ｅ Ｉ Ａ方 法 ：
结核 诊断 技 术 ，它是通 过抗 原特 异性Ｔ 巴细 淋 胞 反应 频 率 来 检 测结 核 感 染 患 者 的 细胞 免 疫
功能 。
１酶联免疫斑点技术的原理
结 核 病 的 免疫 学 机 制 主要 是 机 体 对结 核
２ ９５
敏 感度 均 为 ８ ％，健 康 成 人 中Ｐ Ｄ－Ｌ Ｓ ＯＴ ０ Ｐ Ｅ ＩＰ 的 敏 感 度为 ９ ％；英 国健 康 成 人 中两 种 肽 段 ８
ELISPOT技术简介及实验步骤
one spot
ELISPOT技术优点
• 高灵敏度：单个细胞水平检测，极低频的阳性细胞检
出率——百万分之一
• 高通量：每个研究人员每天可做上百样本的检测 • 冻存标本的检测 • 安全：无放射性污染 • 高性价比：一般细胞实验室即可进行。
ELISPOT应用
• 疫苗开发：评估疫苗效力，或疫苗注射路径影响 • 传染疾病研究：HBV-ELISPOT、TB-ELISPOT • 过敏机制探讨：IL-4诱导免疫球蛋白亚型转换，其它参与
双因子酶联斑点检测
IFN-
IL-4
IFN-/IL-4
双因子荧光斑点检测
IFN-
IL-13
IFN-/IL-13
多色荧光斑点检测
IFN-
IFN-/TNF-/IL-10
TNF-
IL-10
BioRreader 读板
BioReader 3000
BioReader 5000
BioReader 4000
8.ELISPOT技术服务
ELISPOT 全国用户培训 ELISPOT 试剂开发服务
3.试剂的准备
*预包被ELISPOT技术
™ 预包被ELISPOT 试剂盒
6.实验室质控
*ELISPOT质控技术
冻干多价非特异性刺激物 PHA和PMA/IMC ELISPOT细胞质控品
PBMC-SPOTTM细胞
F肽特异性刺激肽
1
B2
1.1
22
69
2,818
6,715
Real Plate B3
1.2
30
77
3,466
11,915
Real Plate D5
12.2
65
酶联免疫斑点法
酶联免疫斑点法酶联免疫斑点法（Enzyme-linked immunospot assay, ELISPOT）是一种用于检测单个细胞分泌物（包括细胞因子、抗体和其他蛋白质）的方法。
该技术将单个细胞和特异性抗体共同培养于多孔的固体基质上，当特异性抗体捕获了细胞分泌物时，就会形成一个“免疫斑点”，而该斑点会通过化学反应显示出来，从而可进行定量分析。
该技术的优点一是提高了灵敏度和特异性，促进了单个细胞分泌物的检测能力。
二是实验条件较容易控制，能够极大地减少误差。
另外，与其他技术相比，ELISPOT技术具有较高的自动化水平和适应性。
同时，该技术可用于评估和比较不同治疗方案或疫苗的效果、评估细胞免疫反应、疾病诊断和监测、评估药物毒性和进行基础研究。
在实验中，ELISPOT可分为两个阶段。
第一阶段是细胞培养，即将感兴趣的细胞和特定的刺激物共同培养。
第二阶段是免疫斑点检测，即将细胞移到多孔的固体基质上，添加特异性抗体进行反应，以发现并定量斑点。
常用的免疫斑点计数仪可以通过电子显微镜对固定、染色的免疫斑点进行准确计数，从而获得准确的结果。
通过该技术，研究人员可以研究细胞免疫和疫苗的作用机制，及早发现传染病或肿瘤的预警信号，以促进更好的预防和治疗。
此外，酶联免疫斑点法也适用于儿童疫苗接种后对疫情的监测和跟踪，以及老年人免疫力的评估。
需要指出的是，这种技术并不能够直接用于临床检测，仅在研究领域发挥作用。
一些商业实验室已经开始使用该技术进行疫苗测试和特定蛋白质的检测，在检测和诊断方面具有很大的潜力。
总之，酶联免疫斑点法是一种基于细胞分泌物检测的技术手段，在生物医学研究、药物开发以及疾病预防和治疗等方面具有较为重要的应用价值。
酶联免疫法在农产品质量安全检测中的应用研究进展
酶联免疫法在农产品质量安全检测中的应用研究进展酶联免疫法（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）是一种广泛应用于农产品质量安全检测中的生物技术方法。
它通过利用抗原与特异性抗体的结合来检测目标物质的存在和浓度。
酶联免疫法在农产品质量安全领域的应用研究一直处于不断发展的状态，下面将对其在不同农产品中的应用进展进行简要综述。
在农产品的有害微生物检测中，酶联免疫法是一种简便、快速、敏感和特异性较高的方法。
鲜活水果和蔬菜中常常会存在大肠杆菌和沙门氏菌等致病微生物的污染，这些微生物会引起食物中毒，威胁消费者的健康。
研究者通过制备适当的抗体，可以将酶联免疫法用于检测这些致病菌的存在和浓度。
通过 ELISA 可以在短时间内迅速筛测出微生物污染，并为农产品的质量安全提供及时保障。
在农产品的农药残留检测中，酶联免疫法也发挥了重要作用。
农药的过量使用或残留会对农产品和环境造成不良影响，对农产品中农药残留的监测和控制成为质量安全的重要环节。
酶联免疫法通过制备特异性抗体，可以快速、精确地检测农产品中的农药残留。
研究者利用酶标抗体的高特异性和敏感性，可以实现对不同种类农药残留的同时检测，极大地提高了检测效率。
在农产品的转基因成分检测中，酶联免疫法也有很高的应用潜力。
转基因农产品是通过基因工程技术将外源基因导入到作物中，以改善其特性或产量。
转基因农产品引起了广泛的争议，需要对其安全性进行严格的监管和检测。
酶联免疫法可以通过特异性的抗体对目标转基因成分进行筛查和定量分析，能够准确地检测转基因农产品的各种成分，以及评估其对人体健康和环境的潜在影响。
酶联免疫法在农产品质量安全检测中的应用研究进展丰富多样。
不仅可以应用于有害微生物、农药残留和转基因成分等的检测，还可以结合其他技术方法进一步提高检测的灵敏性和准确性。
随着科学技术的不断发展，酶联免疫法在农产品质量安全领域的应用前景将更加广阔。
酶联免疫斑点技术在结核病诊断中的应用
（ 阳性率 ３ ． ％ ） 正常对 照 ３ ７８ ， ０例 中有 ２例 阳性 （ 阳性率 ６ ７ 。结核抗体诊 断结核病 的灵敏 度为 ３ ． ％ ， ． ％）Байду номын сангаас８ ３ 特异
度为 ９ ． ％ ；Ｐ ３ ３ Ｐ Ｄ试验痰 菌 阳性患 者 ５ ７例 中阳性 ２ ７例 （ 阳性率４ ．％ ） 痰 菌阴性 结核 ３ ７４ ， ７例 患 者中 阳性 ２ ０例 （ 阳性率５ ．％ ） 正常对照 ３ ４１ ， ０例 中有 ３例 阳性 （ 阳性 率 １ ．％ ） ０ ０ 。见表 １ 。
观察结果 ， 测量硬结 （ 横径 ＋纵 径 ）２ 均径 ≥５ｍ ／， ｍ为 阳
性 反 应 ，０～１ ｎ 为 中 度 阳 性 ， ０ｍ 或 有 水 泡 、 ｌ ９ｉ ｌ ｎ ≥２ ｍ 双
例数
５ ７ ３ ７ ３ Ｏ
Ｅ ＩＰ ＬＳＵｒ百分率 结核抗体 百分率 Ｐ Ｄ试验 百分率 Ｐ
４ ２ ２ ７ １ ７． ３ ７ ７ ０ ３． ３． ３ ２ ２ １ ４ ２ ３ ． ８６ ３ ８ ７． ６７ ． ２ ７ ２ ０ ３ ４ ． ７４ ５ １ ４． １ ． ００
２１ ００年 第 ２ ２卷 第 ８期
２ １ Ｖｏ ． ２ Ｎｏ ８ ０ ０， １ ２ ．
上 海 预 防 医 学 杂志
Ｓ ａ ｇ ａ ｏ ｍ ￣ ｏ ｒ ｖ ｎ ｉｅ Ｍｅ ｉｉ ｅ ｈ ｎ ｈ ｉＪ ｕ ｆ Ｐ ｅ ｅ ｔｖ ｄ ｃｎ
文章 编 号 ：０４— ２ １ ２ １ ０ ０ ２ 一０ １０ ９ ３ （０ ０）８— ４ ｔ ２
１ ２ 方 法 ．
③ 结核患 者 Ｅ ＩＰ Ｔ 结核 抗体 、Ｐ ＬＳ Ｏ 、 Ｐ Ｄ试验 的特征 ： Ｅ ＩＰ Ｔ试 验 阳 性 预 测 值 为 ９ ． ％ ， 性 预 测 值 为 ＬＳ Ｏ ８６ 阴 ５ ．％ ， ｏ ｄｎ指数 为 ７ ． ％ ， 核抗 体为 阳性预 测值 ３７ Ｙ ｕｅ ０１ 结
酶联免疫斑点试验的原理
酶联免疫斑点试验的原理1. 引言酶联免疫斑点试验（Enzyme-Linked ImmunoSpot Assay，简称ELISPOT）是一种用于检测细胞分泌物的敏感且高通量的免疫学技术。
该技术可以定量检测单个细胞分泌的蛋白质或细胞因子，在免疫学研究、药物开发和临床诊断中具有广泛的应用。
2. 原理概述ELISPOT技术基于酶标记抗体和特异性抗原结合的原理。
它通过将待测细胞与特定抗原刺激后，将细胞分泌物捕获到固相载体上，然后使用酶标记二抗进行检测，最后通过显色反应可视化并计数斑点数量。
该技术具有高灵敏度、高特异性和高通量等优势。
3. 实验步骤步骤一：制备固相载体在ELISPOT实验中，常用的固相载体是多孔膜板或膜片。
首先，在载体表面涂覆特异性抗原或抗体，以便捕获待测细胞分泌的特定蛋白质或细胞因子。
步骤二：孵育待测细胞将待测细胞加入到含有特异性抗原的培养基中，使其与抗原发生特异性反应。
通常，实验者会设置对照组，包括阴性对照组（只有培养基）和阳性对照组（含有已知分泌物的细胞）。
步骤三：洗涤将孵育后的细胞用洗涤缓冲液洗去未结合的细胞和其他杂质。
步骤四：二抗处理加入酶标记的二抗（如辣根过氧化物酶标记的抗IgG），使其与待测细胞分泌物中的特异性蛋白质或细胞因子结合。
步骤五：显色反应加入适当的底物和显色剂，通过酶催化作用产生可见信号。
常用的显色剂是BCIP/NBT，在酶催化下会生成紫色斑点。
步骤六：计数和分析使用显微镜对固相载体进行观察，并使用计算机软件或手工计数斑点数量。
斑点的数量代表了待测细胞分泌物的水平。
4. 原理解析特异性抗原和抗体结合固相载体表面涂覆的特异性抗原或抗体与待测细胞分泌物中的特定蛋白质或细胞因子结合。
这种结合是通过免疫反应中抗原与抗体之间的特异性识别实现的。
酶标记二抗检测酶标记二抗是一种能够与待测细胞分泌物中的特异性蛋白质或细胞因子结合并具有酶活性的二级抗体。
常用的酶标记二抗有辣根过氧化物酶标记的抗IgG。
结核感染T细胞斑点试验技术进展及现状分析
结核感染T细胞斑点试验技术进展及现状分析结核病是公共卫生中的一种常见传染性疾病，其在传染性疾病致死中所占的比重一直比较高，也是公共卫生需要长期关注的疾病。
结核病在临床上主要表现为咯血、咳痰、肺部空洞等症状，具有不易控制、易复发、具有发病率高、耐药率高等特点，严重影响患者的生活质量，也对人口生命健康危害极大，故早期进行准确鉴别诊断，指导临床治疗，对改善患者预后具有重要意义[1-2]。
痰培养结核分枝杆菌是临床诊断结核病的“金标准”，但存在检测时间较长、结核细菌生长缓慢、对于技术人员要求较高等不足，不利于早期诊断，难以满足临床需要。
结核感染T细胞检测(T-SPOT.TB)属γ干扰素释放试验类型，是诊断肺结核的重要途径，其采取特异性结核分枝杆菌抗原，当前在临床上得到广泛使用[3]。
现就该项目技术进展及现状报道如下：1结核感染T细胞斑点试验（T-SPOT.TB）原理和特点1.1 γ干扰素释放试验（IGRA）简介目前用于临床γ干扰素释放试验（IGRA）主要有两种，一种是QFT-GIT试验，该试验采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测结核特异性抗原刺激致敏T细胞释放γ干扰素浓度。
另外一种就是结核感染T细胞斑点试验（T-SPOT.TB），该试验的方法是采用酶联免疫斑点试验（ELISPOT）检测外周血结核特异性抗原刺激分泌IFN-γ的Ｔ淋巴细胞数量[4]。
IGRA已有20多个国家发布了应用指南[5],2014年中华医学会结核病学分会和《中华结核和呼吸杂志》编辑委员会组织相关专家发布了《γ干扰素释放试验在中国应用的建议》，对IGRA在活动性结核病及潜伏性结核（LTBI）诊断的应用建议。
2017年卫健委发布卫生标准WS288-2017《肺结核诊断》中将γ干扰素释放试验（IGRA）阳性作为结核病诊断实验室检查项目。
卫健委于2020年4月2日发布的《中国结核病预防控制工作技术规范》中明确结核潜伏感染检测方法、人群及预防性治疗方案。
酶联免疫斑点试验诊断结核的敏感性和特异性研究
２ １ 不 同人群 中结核 分 枝杆 菌 抗 原 特异 性 Ｔ细胞 ．
反应频率比较
・
结 核组 中 １６例结 核性 率 为 ９ ．％ ， 对 照 组 ２ ３４ 而 ４例
中仅 有 １例 ＴＳ Ｏ ・Ｔ 检 测 阳 性 ， 性 率 为 —Ｐ Ｔ Ｂ 阳
实 验室 诊 断 方 法 虽 然 较 多 ， 诊 断 阳性 率 均 不 到 但 ６％， ０ 临床应 用 效 果 不佳 。而 以结 核分 枝 杆 菌 特 异 性 一 扰 素 酶 联 免 疫 斑 点 检 测 技 术 为 基 础 的 Ｔ 干 ． Ｓ Ｏ ・ Ｂ试 剂 盒 在 欧美 国家 获得 了广 泛 应 用 。 由 ＰＴ Ｔ 于该 试剂 盒 和酶联 斑 点 分 析 仪 价 格 昂贵 、 验 操 作 实 技 术 及实 验 室条件 要 求 较 高导 致 在 我 国应 用 较少 。
三者相 比 ， 差异有统 计学 意义 （ ０ Ｏ ） 特 异性 与 三者 相 Ｐ＜ ． １ ，
比， 差异 无统计学意义 。表 明酶 联免疫 斑点 ＴＳ Ｏ Ｔ －Ｐ Ｔ・ Ｂ实
产并提供 。结核分枝杆菌抗体诊断试剂盒（ 胶体金
法） 由法 国 Ｖ Ｄ Ａ Ｅ Ａ Ｌ Ｂ公 司 生 产 ， 海 鸿 泰 生 物 工 上 程 有 限公 司提 供 。 １３ 方法 ． ＴＳＯ Ｔ —Ｐ Ｔ・ Ｂ试 验 ， 用 肝 素 抗 凝 管采 使 集 受 检 者 静 脉 血 ５ｍｌ加 入 Ｆｃｌ淋 巴细 胞 分 离 液 ， ｉ ｌ ｏ
ｘ 检 验对 各组 检 出 阳性 率进 行 统计 学分 析 。
２ 结 果
该研究采用 ＴＳ Ｏ Ｔ 试验与其它多种结核检测 —Ｐ Ｔ・ Ｂ
技术 对 １０例 受 检 者 进 行 检 测 ， 估 ＴＳ Ｏ ・ Ｂ ３ 评 ．Ｐ Ｔ Ｔ
分子医学技能：酶联免疫斑点(ELISPOT)技术
特点：
❖斑点可持久保存并进行计数分析
❖易操作、有效、快速、灵敏度高
✓ 细胞因子的检测不易受非分泌细胞的干扰 ✓ 比传统的ELISA和细胞内细胞因子染色法敏感20-200倍
❖样本量大的情况下实验结果可用计算机图象分 析系统进行快速、客观的分析
❖
基
Coating Ab
本
包被培养孔
原
理
根据实验设 计加入淋巴 细胞及含或 不含刺激因 子的培养液
酶联免疫斑点(ELISPOT)技术
❖ELISPOT（Enzyme-linked Immunospot Assay）
▪ 结合了细胞培养技术与酶联免疫吸附技术（即 ELISA技术），能够在单细胞水平检测细胞因子 的分泌情况；
▪ 用抗体原位捕获培养中的细胞分泌的细胞因子， 并以酶联斑点显色的方式将其表现出来。
❖双色ELISPOT结果示意图
蓝色：IFN-γ,红色：IL-2; 蓝色：IFN-γ,红色：IL-17
❖ ELISPOT
▪ B细胞杂交瘤的筛选 ▪ 化合物和药物免疫学反应的检测 ▪ 优化树突细胞和T细胞的抗肿瘤活性 ▪ 靶向疫苗的质控
方 ▪ 自身免疫疾病的诊断和预后分析 法 ▪ 自身免疫疾病免疫治疗的监控 主 ▪ 过敏性疾病的脱敏治疗的监测 要 ▪ 器官移植中排斥反应的预测 用 ▪ 微量组织、肿瘤和免疫细胞分泌谱的分析 途 ▪ 结核病的诊断
▪ 显色剂I和II应避光保存，不使用时切勿混合
❖ ELISPOT 实 验 结 果 示 意 图
细胞因子A
双抗体包被
❖双色ELISPOT原理
培养细胞 细胞因子B
包被抗体
Biotin-检测抗体
HRP-检测抗体 BCIP/NBT底物
AEC底物
斑点酶联免疫吸附试验（DOT-ELISA）
目次前言 (Ⅱ)1 范围 (1)2 规范性引用文件 (1)3 术语和定义 (1)4 检样要求 (1)5 检疫方法 (1)5. 1群体检疫......................................................................................................１5.1.1免疫核实......................................................................................................１5.1.2现场检查......................................................................................................１5. 2 流行病学调查................................................................................................１5. 3 解剖检查......................................................................................................１5. 4 病理学检查 (2)5. 5 病原电镜检查 (2)5. 6 免疫学检验 (2)5.6.1 斑点酶联免疫吸附试验(Dot-ELISA) (2)5.6.2葡萄球菌A蛋白协同凝集试验（SPA-COA） (2)5.7逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）检测 (2)6 无害化处理 (2)附录A （规范性附录）流行病学调查 (3)附录B （规范性附录）斑点酶联免疫吸附试验(Dot-ELISA) (4)附录C （规范性附录）葡萄球菌A蛋白协同凝集试验（SPA-COA） (5)附录D （规范性附录）逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）检测 (6)参考文献 (8)前言本标准的附录A、附录B、附录C、附录D为规范性附录。
免疫斑点试验的实验报告
免疫斑点试验的实验报告实验目的：本实验旨在通过免疫斑点试验（ELISPOT）评估特定抗原刺激下，免疫细胞分泌特定抗体或细胞因子的能力。
免疫斑点试验是一种常用的细胞免疫反应检测方法，广泛应用于疫苗开发、免疫诊断和免疫治疗研究。
实验原理：免疫斑点试验是基于酶联免疫吸附测定（ELISA）的原理发展而来，通过检测细胞因子或抗体在固相上的沉积形成斑点，从而定量分析免疫细胞的分泌活性。
当免疫细胞被特定抗原激活后，它们会分泌细胞因子或抗体，这些分子可以被特定的捕获抗体固定在固相上，随后通过酶标记的检测抗体和底物显色，形成可见的斑点。
实验材料：1. 96孔多孔板2. 细胞培养基3. 特定抗原4. 捕获抗体5. 酶标记的检测抗体6. 底物溶液7. 细胞计数器8. 免疫细胞（如外周血单核细胞）9. 其他必要的试剂和耗材实验方法：1. 将96孔多孔板预先涂覆捕获抗体，封闭未结合位点。
2. 将免疫细胞以适当浓度接种到多孔板中，并加入特定抗原进行刺激。
3. 细胞培养一定时间，使细胞因子或抗体分泌并固定在固相上。
4. 移除培养上清，用洗涤液清洗多孔板，去除未固定的细胞和抗原。
5. 加入酶标记的检测抗体，孵育后再次洗涤。
6. 加入底物溶液，使酶催化底物产生颜色反应。
7. 颜色反应达到适宜程度后，终止反应，使用ELISPOT分析系统计数斑点。
实验结果：实验结果显示，不同浓度的抗原刺激下，免疫细胞产生的斑点数量有显著差异。
高浓度的抗原能显著提高斑点的数量，表明免疫细胞对抗原的反应性增强。
通过比较实验组和对照组的斑点数量，可以评估免疫细胞的活性和分泌能力。
实验讨论：本实验结果表明，免疫斑点试验是一种灵敏且特异的方法，能够定量分析免疫细胞对特定抗原的反应。
斑点的数量与免疫细胞的活性成正比，可以用来评估免疫应答的强度。
此外，通过优化实验条件，如细胞浓度、抗原浓度和培养时间，可以进一步提高实验的准确性和重复性。
实验结论：免疫斑点试验成功地评估了免疫细胞对特定抗原的反应性，为进一步研究免疫细胞的功能和免疫应答机制提供了可靠的实验数据。
酶联免疫斑点法在新发传染病疫苗研究中的应用
［ 图分 类 号 ］ Ｒ ９ ． 中 ３ ２１
［ 献标识码］ Ａ 文
［ 文章 编 号 ］ １０ － ０ ２２ １）１ ０ ３— ４ ０ ９ ０ ０ （ １ — １５ ０ ０ ０
［ 要 ］ 酶 联 免 疫斑 点 法 （ＬＳ Ｏ ） 一项 具 有 较 高 敏感 性和 特 异 性 的 细胞 免 疫 学检 测 技 术 ， 摘 Ｅ ＩＰ Ｔ 是 目前 常 用 于 疫苗 开 发
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ELISPOT酶联免疫斑点分析
ELISPOT酶联免疫斑点分析ELISPOT 技术简介随着酶联免疫分析技术在医学及生物学领域的广泛应用, 使体外检测各种细胞因子及抗体研究有了新的突破。
在研究免疫应答机制时以往常用用酶联免疫吸附法（ELISA ）检测体液中游离的细胞因子（CK ）或抗体，但由于游离的循环抗体或CK 的半哀期不同，使之在体液中不断的被代谢或与靶器官结合，而不能确切的反映体内的抗体及CK 的水平。
80 年代，国外的科研工作者根据ELISA 技术的基本原理，建立了体外检测特异性抗体分泌细胞和CK 分泌细胞的固相酶联免疫斑点技术（ELISPOT ）。
因其具有较高的特异性和敏感性，目前正被国内外广泛应用，对探索自身免疫系统疾病发病机制具有重要意义。
ELISPOT 法源自ELISA ，又突破传统ELISA 法，是定量ELISA 技术的延伸和新的发展。
两者都是检测细胞产生的细胞因子或其他可溶性蛋白，它们最大的不同在于：•ELISA 通过显色反应，在酶标仪上测定吸光度，与标准曲线比较得出可溶性蛋白总量。
•ELISPOT 也是通过显色反应，在细胞分泌这种可溶性蛋白的相应位置上显现清晰可辨的斑点，可直接在显微镜下人工计数斑点或通过德国AID的ELISPOT 分析系统对斑点进行计数，1 个斑点代表1 个细胞，从而计算出分泌该蛋白的细胞的频率。
（某些研究不仅要测细胞因子生成量，还需检测分泌此细胞因子的细胞频率）•由于是单细胞水平检测，ELISPOT 比ELISA 和有限稀释法等更灵敏，能从20 万-30 万细胞中检出1 个分泌该蛋白的细胞。
•捕获抗体为BD 、R&D 、Mabtech 、Diaclone 生产的高亲和力、高特异性、低内毒素单抗，在研究者以刺激剂激活细胞时，不会影响活化细胞分泌细胞因子。
ELISPOT 检测原理细胞受到刺激后局部产生细胞因子，此细胞因子被特异单克隆抗体捕获。
细胞分解后，被捕获的细胞因子与生物素标记的二抗结合，其后再与碱性磷酸酶标记的亲和素结合。
临床分析中的免疫学检测技术研究进展
临床分析中的免疫学检测技术研究进展免疫学检测技术在临床分析中的应用广泛，为疾病诊断、预后评估和治疗策略制定提供了重要依据。
随着科技的不断进步，免疫学检测技术也在不断发展和完善。
本文将对近年来临床分析中的免疫学检测技术研究进展进行探讨。
一、流式细胞术流式细胞术是一种常见的免疫学检测技术，它通过对细胞表面分子的荧光标记，结合激光扫描和计算机分析，可以对细胞进行准确快速的分析。
近年来，流式细胞术在临床分析中的应用得到了广泛关注。
例如，流式细胞术可以用于研究免疫细胞亚群的分布和功能，对某些免疫相关疾病的诊断和治疗具有重要意义。
二、ELISA技术ELISA（酶联免疫吸附实验）是一种高度敏感、特异性强的免疫学检测技术。
它通过将待测物抗原或抗体与酶标记的试剂结合，然后通过底物的酶法反应来检测目标分子的含量。
ELISA技术广泛应用于临床分析领域，如肿瘤标志物检测、感染性疾病的诊断和药物浓度的监测等。
三、免疫组化技术免疫组化技术通过对组织标本中的特定蛋白进行染色和检测，来评估组织中相应蛋白的表达情况。
免疫组化技术在癌症诊断和分子病理学研究中广泛应用。
它不仅可以区分不同类型的肿瘤，还可以评估肿瘤的分级和预后。
随着免疫组化技术的发展，越来越多的免疫标记物被用于临床分析中，为疾病的早期筛查和治疗提供了重要参考。
四、免疫荧光技术免疫荧光技术是通过标记抗体或抗原的荧光物质来进行免疫学检测的一种方法。
它具有高度特异性和灵敏性，是疾病诊断和免疫细胞识别的重要工具。
免疫荧光技术在自身免疫性疾病、感染性疾病和器官移植等方面的应用得到了广泛研究和推广。
五、蛋白质芯片技术蛋白质芯片技术是一种高通量的免疫学检测技术，可以在一个小的芯片上同时检测成百上千个蛋白质的表达水平。
蛋白质芯片技术在研究蛋白质组学、蛋白质互作和生物标志物鉴定方面具有重要的应用。
在临床分析中，蛋白质芯片技术可以用于疾病早期诊断、个体化治疗和预后评估等方面。
六、单细胞技术传统的免疫学检测技术主要依赖于大量的细胞样本，而单细胞技术可以对单个细胞进行分析，为细胞免疫学研究提供了新思路。
酶联免疫斑点技术介绍
酶联免疫斑点技术介绍(总19页)--本页仅作为文档封面，使用时请直接删除即可----内页可以根据需求调整合适字体及大小--酶联免疫斑点技术介绍一、 ELISPOT技术概述1. 技术原理和技术特点ELISPOT全名为酶联免疫斑点检测，英文：（Enzyme-linked Immunospot Assay）。
它结合了细胞培养技术与酶联免疫吸附技术（即ELISA技术），能够在单细胞水平检测细胞因子的分泌情况。
其技术原理，一句话概括就是：用抗体捕获培养中的细胞分泌的细胞因子，并以酶联斑点显色的方式将其表现出来（Sedgwick JD 2005）。
该技术检测细胞因子具有三大优点：其一，灵敏度高。
在一百万个阴性细胞中只要有一个分泌细胞因子的阳性细胞即可被检测出来。
这是目前为止，最为灵敏的检测技术，灵敏度比传统的的ELISA方法高2-3个数量级。
其二，单细胞水平，活细胞功能检测。
ELISPOT检测的是单个细胞分泌，而非细胞群体的平均分泌。
在检测的过程中，有活细胞培养与抗原刺激阶段，检测的是活细胞的功能，而非死细胞的遗留物。
其三，操作简便经济，可以进行高筒量筛选。
ELISPOT没有复杂的细胞体外扩增过程，不使用同位素，不需要大型的、专门的实验仪器设备。
按照标准化的实验操作，一个实验者可以同时处理数百个样品，效率远远高于其它检测方法（Kalyuzhny AE 2005）。
实验设计在96孔培养板上进行，直接以培养板的塑料板底或者PVDF膜以及硝酸纤维素膜为基质，包被上特异性的单克隆抗体，用以捕获细胞分泌的细胞因子。
（由于涉及到细胞培养的过程，对单克隆抗体的要求要远高于ELISA中的捕获抗体，该抗体需要无毒，不含内毒素，亲和力高等特点。
）之后，在培养板的孔内加入细胞培养基（现在无血清ELISPOT技术已经成熟，培养基中可以不再含有血清）、待检测的细胞以及抗原刺激物进行培养。
在特异性的抗原或者非特异性的有丝分裂原的刺激下，数小时之内，T细胞就会开始分泌各种细胞因子。
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（ 稿 日期 ：０ ０ ０ — ２ 收 ２ １ － ７２ ）
酶 联 免 疫 斑 点 检 测 技 术 研 究 进 展
聂 华 综 述 ， 世 勇 审 校 （ 北 省 襄 樊 市 中心 血 站 郝 湖 ４ １０ ） ４ ０ ０
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的发 展 ， 为进 一 步深 入 研 究 白藜 芦 醇 抗 白血病 作 用 的分 子 机 制
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作 用 及 其 可 能 的 分 子 机 制 Ｅ ］ 西 安 交 通 大 学 学 报 ： 学 Ｊ． 医
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【 键 词 】 酶 联 免 疫 吸 附 测 定 ； 免 疫 印 迹 法 ； 实 验 室 技 术 和 方 法 关 Ｄ ：０ ３ ６ ／．ｓｎ １ ７ — ４ ５ ２ １ ． １ ０ ３ 文 献 标 志 码 ： 文 章 编 号 ： ６ ２ ９ ５ （ ０ １ ０ —０ ２ ０ ＯＩ １ ． ９ ９ ｊ ｉｓ ． ６ ２ ９ ５ ． ０ １ Ｏ ． ４ Ａ １ ７ ～ ４ ５ ２ １ ） １０ ８ — ３
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［ ３ 吴 剑锋 ， 佐 君 ． ＡＫ／ Ｔ ９ 沈 Ｊ Ｓ ＡＴ信 号 通 路 及 其 与 肿 瘤 侵 袭 、 转 移 的关 系［ ］ Ｃ ｅ ｉ ， ０ ９ ２ （ ） １ ６ １ ９ Ｊ ． ｈ ｍ Ｌ ｆ ２ ０ ， ９ ２ ：７ — ７ ． ｅ
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参 考 文 献
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