酶联免疫斑点法的操作方法
酶联免疫斑点试验
酶联免疫斑点试验
酶联免疫斑点试验（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，简称ELISPOT）是一种高灵敏度的免疫学检测技术，可用于检测单个细胞
的分泌物，如细胞因子、抗体、酶等。
该技术广泛应用于疾病诊断、
药物筛选、疫苗研究等领域。
ELISPOT的原理是利用特定的抗体捕获分泌物，然后使用酶标记的二
抗或底物来检测捕获的分泌物。
具体步骤如下：
1. 准备试板：将多孔板涂上特定的抗体，使其能够捕获分泌物。
2. 细胞处理：将待检测的细胞加入试板中，使其与涂有抗体的孔相互
作用。
3. 洗涤：将试板洗涤，去除未结合的细胞和其他杂质。
4. 二抗标记：加入酶标记的二抗，使其与捕获的分泌物结合。
5. 洗涤：将试板洗涤，去除未结合的二抗和其他杂质。
6. 底物反应：加入底物，使其与酶标记的二抗反应，产生可见的斑点。
ELISPOT的优点是灵敏度高、特异性好、操作简单、结果可靠。
它可
以检测单个细胞的分泌物，因此可以用于研究细胞免疫应答、肿瘤免
疫学、感染病毒的免疫学等领域。
此外，ELISPOT还可以用于药物筛
选和疫苗研究，帮助科学家们开发更有效的药物和疫苗。
ELISPOT的缺点是需要较长的实验时间和较高的成本，同时需要专业
的实验技能和设备。
此外，ELISPOT只能检测单个细胞的分泌物，无
法检测细胞表面分子的表达情况。
总之，ELISPOT是一种重要的免疫学检测技术，具有广泛的应用前景。
随着技术的不断发展，ELISPOT将会在疾病诊断、药物筛选、疫苗研
究等领域发挥越来越重要的作用。
酶联免疫操作方法
酶联免疫操作方法
酶联免疫操作方法是一种用于检测和定量分析特定蛋白质的技术方法。
以下是一般的酶联免疫操作方法的步骤：
1. 杂交：将待检的抗原或抗体固定在固相载体上，如微孔板或膜。
可以通过直接插入法或被动吸附法将抗原或抗体与载体结合。
2. 阻断：在固相载体上，加入一种非特异性蛋白质（如牛血清蛋白，BSA）或洗脱缓冲液来阻断未被固定的表面；这样可以减少非特异性结合。
3. 反应：加入待测样品，使其与固相上的抗原或抗体结合。
待测样品可能是抗原，也可能是抗体。
4. 洗涤：用洗涤缓冲液彻底洗涤固相载体，以去除未结合的物质，尤其是非特异性结合。
5. 标记：加入与待检测物质相匹配的标记物，如酶标签，荧光标记或放射性标记。
6. 反应：与酶标签或其他标记物相互作用，生成底物反应产物。
这种反应可用于颜色变化、荧光或放射性计数等信号读取。
7. 终止反应：加入终止试剂停止底物反应。
8. 测量：测量反应产物的信号强度，通过比较标准曲线或对照样品来定量待测物质的浓度。
以上是一般酶联免疫操作方法的步骤，不同的实验可以根据需要进行适当的调整。
酶联免疫斑点试验流程图
酶联免疫斑点试验流程图英文回答：Enzyme-Linked Immunospot (ELISPOT) Assay Workflow. Materials:ELISPOT plate.Capture antibody.Cell suspension.Antigen or stimuli.Detection antibody.Substrate (e.g., chromogen or enzyme substrate)。
Procedure:1. Plate Coating: Capture antibody is coated onto the ELISPOT plate overnight at 4°C.2. Cell Addition: Cell suspension is added to the coated plate and incubated to allow cells to adhere (e.g., 4-18 hours at 37°C).3. Antigen Stimulation: Antigen or stimuli is added to the wells to activate antigen-specific cells.4. Cell Incubation: Cells are incubated with antigen or stimuli for a specific time (e.g., 16-24 hours) a t 37°C.5. Cell Removal: Cells are washed away, leaving behind spots corresponding to secreted cytokines or other molecules.6. Detection Antibody Addition: Detection antibody specific for the target cytokine or molecule is added and incubated to bind to the spots.7. Substrate Addition: Substrate is added to visualize the bound detection antibody, generating colored spots.8. Spot Counting: Spots are counted using an automated or manual method.Interpretation:The number of spots represents the number of cells that have secreted the target cytokine or molecule in response to the antigen or stimuli. This information can be used to assess cell-mediated immune responses, cytokine production, and immune cell activation.中文回答：酶联免疫斑点试验流程图。
酶联免疫斑点技术 -回复
酶联免疫斑点技术-回复酶联免疫斑点技术（Enzyme-linked Immunosorbent Assay, ELISA）是一种常用于测定抗原或抗体的高度敏感和特异性的实验方法。
本文将详细介绍ELISA的原理、步骤和应用。
一、ELISA的原理ELISA技术基于抗原与抗体之间的特异性相互作用。
ELISA通常使用多孔板作为试剂的固相载体，先在孔板上固定特定抗原或抗体，再根据需要加入待测样品和检测抗体。
通过特异性抗原-抗体反应的信号产生，可以对待测物进行定量或定性分析。
ELISA有两种基本的原理：直接ELISA和间接ELISA。
1. 直接ELISA：直接ELISA是利用特异性抗体与待测物发生直接的非共价相互作用。
在这种方法中，待测物溶液被加入到已有特异性抗体固定在多孔板上的反应孔中。
如果待测物包含目标抗原，它将与特异性抗体结合，并固定在多孔板上。
然后，加入适量的检测抗体，该抗体被标记有一种酶，例如辣根过氧化物酶（HRP）。
最后，加入合适的底物，当酶与底物反应时，也就是产生了颜色，可以通过酶促反应的信号强度来确定待测物的浓度。
2. 间接ELISA：间接ELISA是通过待测物与特异性抗体结合，然后再加入检测抗体与该复合物结合。
首先，待测物溶液被加入到已有特异性抗体固定在多孔板上的反应孔中。
如果待测物中含有目标抗原，它将与特异性抗体结合并固定在多孔板上。
然后，在充分洗涤去除未结合的物质后，加入标记有检测抗体的二抗。
这些二抗一般与小鼠、兔子等动物蛋白特异性抗体结合，并与待测物-抗体复合物发生特异性反应。
最后，如同直接ELISA，加入适当的底物来检测酶促反应。
以上是ELISA技术的两种基本原理，根据待测物的特性和实验需求，可以选择合适的方法进行分析。
二、ELISA的步骤ELISA方法通常包括固相处理、解离、检测抗体的加入、洗涤、底物发色反应和测定等步骤。
1. 固相处理：将特异性抗体固定在多孔板上。
根据需要，可以使用直接ELISA或间接ELISA的原理选择适合的抗体。
酶联免疫试验操作方法
酶联免疫试验操作方法酶联免疫试验（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，简称ELISA）是一种常用的实验方法，用于检测样本中特定抗原或抗体的存在与数量。
ELISA方法的原理是将特定的抗原或抗体与检测物质打标记，然后通过可以与标记物结合的特异性抗体反应来检测目标物质的存在与浓度。
下面将介绍ELISA的操作方法。
1. 试剂准备：(1) 底物：将所需底物溶于缓冲液，根据实验需求选择适当的底物，如TMB、ABTS等。
(2) 酶标记抗体：将所需的酶标记抗体充分稀释至适当浓度，通常为1:1000至1:10000。
(3) 试样：将待测样品按照需要进行稀释或处理。
如果检测抗体，则需将样品加入酶标记抗体反应，在室温下孵育。
(4) 洗涤缓冲液：常见的洗涤缓冲液为PBS-T（含有Tween 20）。
准备好PBS-T或其他适当的洗涤液，以用于洗涤步骤。
(5) 制备标准曲线：根据实验需求，选择适当的标准品并制备浓度梯度的标准曲线。
2. 板涂覆：(1) 取出ELISA板，将所需抗原或抗体稀释至适当浓度，加入每个孔中。
每个样品需设置多个平行孔，以进行可靠的实验结果分析。
(2) 封闭非特异性结合位点：将孔板封闭，并将其置于37C恒温箱中孵育1至2小时。
3. 底物-标记物结合：(1) 倾倒每个孔的液态，并在每个孔中分别加入酶标记的抗体。
通过抗体与抗原或抗体结合，在孔中形成免疫复合物。
(2) 将孔板置于恒温箱中，在室温下孵育1至2小时，促使免疫反应的发生。
4. 孔洗涤：(1) 将液体倾倒，然后用洗涤缓冲液充分洗涤每个孔，以去除未结合的抗体。
(2) 每孔洗涤的次数及洗涤时间依实验需求而定，通常为3至5次，每次洗涤持续约30秒。
5. 底物反应：(1) 将稀释好的底物加入每个孔中，底物与酶标记结合物质反应，形成可见的颜色变化。
(2) 在室温下进行底物反应，反应时间依抗体的检测结果而定，通常为15分钟至1小时。
酶联免疫的操作方法
酶联免疫的操作方法酶联免疫是一种常见的免疫测定方法，常用于检测抗原或抗体的存在和浓度。
其操作方法如下：1. 抗原包被：首先，将待检测样品中的抗原加入到含有特异性抗体的孔或固相载体表面，通过吸附或共价键结合的方式，将抗原固定在孔或固相载体上。
这样做是为了使抗原与特异性抗体充分结合，形成抗原-抗体复合物。
2. 洗涤：将包被好的板子或固相载体进行洗涤，去除非特异性结合物，减少误差的发生。
3. 反应：将与抗原-抗体复合物结合的二抗（或识别抗体）加入孔或固相载体中，与复合物发生特异性结合。
该二抗预先被连接上与酶（通常是辣根过氧化物酶HRP）结合的分子，因此称之为辣根过氧化物酶标记的二抗。
4. 洗涤：将孔或固相载体进行洗涤，去除非特异性结合物。
5. 底物添加：将染色底物加入孔或固相载体中，底物在酶的作用下，发生可见的颜色反应。
该底物通常是染色体底物或亚硝酸4-硫酸钠。
6. 反应停止：通过加入酸或碱，停止底物的反应，并阻止底物继续发色。
7. 反应评估：测量底物反应产生的颜色强度或发光强度，使用光度计或发光仪等设备进行测定。
酶联免疫方法优点如下：- 高灵敏度：酶标记可提供较强的信号，使检测到的目标物浓度可达到可靠的程度。
- 特异性：通过使用具有特异性的抗体或抗原，酶联免疫能够准确检测目标物。
- 简单易行：操作相对简单，无需复杂的实验条件和设备。
- 可量化：根据底物反应的强度，可以定量测定目标物的含量。
- 高通量：酶联免疫可同时处理多个样品，提高工作效率。
然而，酶联免疫也有一些局限性，例如：- 检测范围受限：传统的酶联免疫方法通常只能在较低至中等浓度范围内进行可靠的检测，对于高浓度的目标物可能不敏感。
- 受干扰物影响：某些样品中可能含有干扰物质，如脂质、乳糖、硫醇等，它们可能影响酶的活性或干扰底物的测定。
- 特异性限制：一些高度相似的抗原或抗体可能导致交叉反应，从而降低特异性。
总的来说，酶联免疫是一种常用的免疫测定方法，通过将抗原或抗体固定在固相载体上，并利用酶的催化反应使其产生可见的颜色或发光信号，从而实现对目标物的检测和定量。
酶联免疫斑点法
酶联免疫斑点法酶联免疫斑点法（Enzyme-linked immunospot assay, ELISPOT）是一种用于检测单个细胞分泌物（包括细胞因子、抗体和其他蛋白质）的方法。
该技术将单个细胞和特异性抗体共同培养于多孔的固体基质上，当特异性抗体捕获了细胞分泌物时，就会形成一个“免疫斑点”，而该斑点会通过化学反应显示出来，从而可进行定量分析。
该技术的优点一是提高了灵敏度和特异性，促进了单个细胞分泌物的检测能力。
二是实验条件较容易控制，能够极大地减少误差。
另外，与其他技术相比，ELISPOT技术具有较高的自动化水平和适应性。
同时，该技术可用于评估和比较不同治疗方案或疫苗的效果、评估细胞免疫反应、疾病诊断和监测、评估药物毒性和进行基础研究。
在实验中，ELISPOT可分为两个阶段。
第一阶段是细胞培养，即将感兴趣的细胞和特定的刺激物共同培养。
第二阶段是免疫斑点检测，即将细胞移到多孔的固体基质上，添加特异性抗体进行反应，以发现并定量斑点。
常用的免疫斑点计数仪可以通过电子显微镜对固定、染色的免疫斑点进行准确计数，从而获得准确的结果。
通过该技术，研究人员可以研究细胞免疫和疫苗的作用机制，及早发现传染病或肿瘤的预警信号，以促进更好的预防和治疗。
此外，酶联免疫斑点法也适用于儿童疫苗接种后对疫情的监测和跟踪，以及老年人免疫力的评估。
需要指出的是，这种技术并不能够直接用于临床检测，仅在研究领域发挥作用。
一些商业实验室已经开始使用该技术进行疫苗测试和特定蛋白质的检测，在检测和诊断方面具有很大的潜力。
总之，酶联免疫斑点法是一种基于细胞分泌物检测的技术手段，在生物医学研究、药物开发以及疾病预防和治疗等方面具有较为重要的应用价值。
斑点酶联免疫吸附试验原理
斑点酶联免疫吸附试验原理斑点酶联免疫吸附试验（ELISA）：从表面到内部的探索1. 什么是斑点酶联免疫吸附试验？•斑点酶联免疫吸附试验（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，简称ELISA）是一种常用于检测肿瘤抗原、感染性疾病、药物残留等的生物学分析技术。
•ELISA利用酶标记抗体与待测物相互作用，并通过最终的酶反应产生可见的颜色变化，从而定量或定性分析目标物质的存在和浓度。
2. ELISA的原理与步骤原理概述•ELISA利用了抗体与抗原之间的高度特异性反应，实现对目标物质的检测。
•一般的ELISA试验分为直接ELISA、间接ELISA、间接竞争ELISA 和竞争ELISA四种常见形式。
步骤详解1.试样处理与包被：待测样品中的目标物质与特异性抗体结合，形成目标物-抗体复合物。
2.洗涤：将未结合的其他物质洗去，保证后续反应的准确性。
3.二抗添加：加入与目标物-抗体复合物反应的次级抗体，次级抗体通常与酶分子偶联。
4.洗涤：去除未结合的次级抗体，减少背景干扰。
5.底物添加：加入酶底物，与酶发生反应后会呈现可见的颜色变化。
6.反应停止：通过添加反应停止剂停止酶反应，停止颜色的发展过程。
7.读数与结果分析：使用光谱仪或光密度计读取样品的吸光度或荧光强度，并根据标准曲线计算待测样品中目标物质的浓度或定性判断。
3. ELISA的优势和应用领域•高灵敏度和特异性：ELISA可以检测目标物质的微量浓度，并在复杂样品中准确鉴定。
•定量和定性分析：根据标准曲线，ELISA可以定量测定待测样品中目标物质的浓度，也可用于定性判断目标物质的存在与否。
•广泛应用于医学、农业和生物科学等领域：ELISA在肿瘤学、感染性疾病诊断、食品安全监测等方面有着重要的应用价值。
4. 总结•斑点酶联免疫吸附试验（ELISA）是一种常见且广泛应用于生物学研究和临床诊断的生物分析技术。
•ELISA通过抗体的高度特异性与目标物质之间的相互作用，结合酶标记技术实现对目标物质的检测和分析。
酶联免疫斑点技术介绍
酶联免疫斑点技术介绍一、ELISPOT技术概述1. 技术原理和技术特点ELISPOT全名为酶联免疫斑点检测，英文：（Enzyme-linked Immunospot Assay）。
它结合了细胞培养技术与酶联免疫吸附技术（即ELISA技术），能够在单细胞水平检测细胞因子的分泌情况。
其技术原理，一句话概括就是：用抗体捕获培养中的细胞分泌的细胞因子，并以酶联斑点显色的方式将其表现出来（Sedgwick JD 2005）。
该技术检测细胞因子具有三大优点：其一，灵敏度高。
在一百万个阴性细胞中只要有一个分泌细胞因子的阳性细胞即可被检测出来。
这是目前为止，最为灵敏的检测技术，灵敏度比传统的的ELISA方法高2-3个数量级。
其二，单细胞水平，活细胞功能检测。
ELISPOT检测的是单个细胞分泌，而非细胞群体的平均分泌。
在检测的过程中，有活细胞培养与抗原刺激阶段，检测的是活细胞的功能，而非死细胞的遗留物。
其三，操作简便经济，可以进行高筒量筛选。
ELISPOT没有复杂的细胞体外扩增过程，不使用同位素，不需要大型的、专门的实验仪器设备。
按照标准化的实验操作，一个实验者可以同时处理数百个样品，效率远远高于其它检测方法（Kalyuzhny AE 2005）。
实验设计在96孔培养板上进行，直接以培养板的塑料板底或者PVDF膜以及硝酸纤维素膜为基质，包被上特异性的单克隆抗体，用以捕获细胞分泌的细胞因子。
（由于涉及到细胞培养的过程，对单克隆抗体的要求要远高于ELISA中的捕获抗体，该抗体需要无毒，不含内毒素，亲和力高等特点。
）之后，在培养板的孔内加入细胞培养基（现在无血清ELISPOT技术已经成熟，培养基中可以不再含有血清）、待检测的细胞以及抗原刺激物进行培养。
在特异性的抗原或者非特异性的有丝分裂原的刺激下，数小时之内，T细胞就会开始分泌各种细胞因子。
细胞因子当即就被位于细胞下方的膜上的单克隆抗体所捕获。
在洗去细胞之后，被捕获的细胞因子可以与生物素标记的第二抗体结合，然后用酶标亲和素再与生物素结合，进行化学酶联显色，就可以在膜的局部形成一个个圆形的斑点。
酶联免疫斑点试验的原理
酶联免疫斑点试验的原理1. 引言酶联免疫斑点试验（Enzyme-Linked ImmunoSpot Assay，简称ELISPOT）是一种用于检测细胞分泌物的敏感且高通量的免疫学技术。
该技术可以定量检测单个细胞分泌的蛋白质或细胞因子，在免疫学研究、药物开发和临床诊断中具有广泛的应用。
2. 原理概述ELISPOT技术基于酶标记抗体和特异性抗原结合的原理。
它通过将待测细胞与特定抗原刺激后，将细胞分泌物捕获到固相载体上，然后使用酶标记二抗进行检测，最后通过显色反应可视化并计数斑点数量。
该技术具有高灵敏度、高特异性和高通量等优势。
3. 实验步骤步骤一：制备固相载体在ELISPOT实验中，常用的固相载体是多孔膜板或膜片。
首先，在载体表面涂覆特异性抗原或抗体，以便捕获待测细胞分泌的特定蛋白质或细胞因子。
步骤二：孵育待测细胞将待测细胞加入到含有特异性抗原的培养基中，使其与抗原发生特异性反应。
通常，实验者会设置对照组，包括阴性对照组（只有培养基）和阳性对照组（含有已知分泌物的细胞）。
步骤三：洗涤将孵育后的细胞用洗涤缓冲液洗去未结合的细胞和其他杂质。
步骤四：二抗处理加入酶标记的二抗（如辣根过氧化物酶标记的抗IgG），使其与待测细胞分泌物中的特异性蛋白质或细胞因子结合。
步骤五：显色反应加入适当的底物和显色剂，通过酶催化作用产生可见信号。
常用的显色剂是BCIP/NBT，在酶催化下会生成紫色斑点。
步骤六：计数和分析使用显微镜对固相载体进行观察，并使用计算机软件或手工计数斑点数量。
斑点的数量代表了待测细胞分泌物的水平。
4. 原理解析特异性抗原和抗体结合固相载体表面涂覆的特异性抗原或抗体与待测细胞分泌物中的特定蛋白质或细胞因子结合。
这种结合是通过免疫反应中抗原与抗体之间的特异性识别实现的。
酶标记二抗检测酶标记二抗是一种能够与待测细胞分泌物中的特异性蛋白质或细胞因子结合并具有酶活性的二级抗体。
常用的酶标记二抗有辣根过氧化物酶标记的抗IgG。
酶联免疫 操作方法有哪些
酶联免疫操作方法有哪些
酶联免疫可分为直接法和间接法两种操作方法。
下面是两种方法的简要步骤：
直接法：
1. 准备试样：将待测样品加入试验管中。
2. 添加原抗体：加入经过纯化的特异性原抗体，并与待测样品中的抗原结合。
3. 清洗步骤：将试管中的物质洗涤以去除未结合的物质。
4. 添加检测物酶标记的二抗：将与原抗体结合的酶标记的二抗加入试管中，与原抗体结合。
5. 清洗步骤：再次将试管中的物质洗涤以去除未结合的物质。
6. 反应步骤：加入合适的底物，与酶标记的二抗反应，产生可测量的物质（例如发色反应）。
7. 结果测定：测定产生的物质的光密度或颜色，用于定量或定性分析。
间接法：
1. 准备试样：将待测样品加入试验管中。
2. 添加一抗：加入经过纯化的特异性一抗，与待测样品中的抗原结合。
3. 清洗步骤：将试管中的物质洗涤以去除未结合的物质。
4. 添加检测物酶标记的二抗：加入与一抗结合的酶标记的二抗，与一抗结合。
5. 清洗步骤：再次将试管中的物质洗涤以去除未结合的物质。
6. 添加底物：加入合适的底物，与酶标记的二抗反应，产生可测量的物质（例如发色反应）。
7. 结果测定：测定产生的物质的光密度或颜色，用于定量或定性分析。
请注意，这只是酶联免疫操作方法的简要步骤，具体的操作流程可能会因不同的实验目的和试剂而有所不同。
对于准确的操作方法，请参考具体的实验方法和相关的实验室操作手册。
ELISPOT技术简介及实验步骤
PBMC
存活率≥90%
存活率≥80%
存活率≤70%
培 养
负对照，无刺激物
Lympho-Spot™ Primate 无血清培养基
基
种
类
4 SFC 无刺激物；
1244 SFC CEF刺激
负对照，无刺激物 10%进口胎牛血清
400,000 Hu-PBMC Lympho-Spot™ Vs FBS
400,000 Hu-PBMC Lympho-Spot™无血清培养基
Table :
Real Plate
Number of Counts / Table
Table Number :
3
24/11/2003
50
Average Values
Cummulated values
Experiment Well
Spots/Well
Opt. Density * Area
area **
Coat with antibodies
ELISPOT原理
Wash and add enzyme-labeled streptavidin
Add cytokine secreting T cells
Wash and add biotinylated antibodies
biotin
Wash and add substrate to allow spot formation
100
150
200
ELISPOT单孔量化分析
光密度与细胞因子相对量化分析
BioSys GmbH
每孔斑点数目与每孔TOD值的比 较
Karben
JK
File :
tang
ELISPOT技术原理及其操作
LDA 能够对特异性 CTL 细胞进行定量,曾在很多年中被认为是 CTL 检测的“金标 准”，它使人们能够详细了解免疫反应动力学和记忆毒性 T 淋巴细胞(memorial CTL, mCTL) 亚群的细胞周期。但该方法需要高强度抗原刺激, 这会加快效应 CTL(eCTL)凋亡,且不能定量测定 eCTL 细胞数量或测定值偏低。其次,该方法较繁 琐,培养时间可长达 2～3 周，而且很容易造成 T 细胞数量损失。
ELISPOT 技术
在免疫学领域中,对于疾病以及疫苗研究不仅仅局限于体液免疫应答,细胞介导 的免疫应答(cell mediated immune response , CMI)也是人们所关注的,而 T 细 胞在 CMI 中起关键作用。在研究细胞免疫应答保护作用及其机理方面,有多种研 究 方 法 可 以 使 用 ， 如 ： ELISA （ 酶 标 记 免 疫 附 测 定 法 ， enzyme-linked immunosorbent assay）、流式细胞分析术（flow cytometry）、定量 RT-PCR 以及这里要介绍的近年使用越来越多的 ELISPOT。作为一项新型的免疫酶技术 ——酶联免疫斑点法(enzyme linked immunospot assay, ELISPOT) ,是从单细 胞水平检测分泌抗体细胞(ASC) 或分泌细胞因子(CK) 细胞的一项细胞免疫学 检测技术。由于该方法敏感性高,易操作,成本相对流式细胞分析术也较低，已被 广泛用于分泌 CK 细胞检测或 ASC 测定中。下面将从原理、具体实验操作、技术
与 ELISPOT 法相比较,胞内 CK 染色法(intra-cellular CK staining,ICS) 主要 应用细胞内累积细胞因子的染色和多色参数的 FACS 法,是检测循环淋巴细胞中 抗原特异性 T 淋巴细胞的可行方法,而 ELISPOT 法却可以检测所有分泌 CK 的 eCTL 。
分子医学技能：酶联免疫斑点(ELISPOT)技术
特点：
❖斑点可持久保存并进行计数分析
❖易操作、有效、快速、灵敏度高
✓ 细胞因子的检测不易受非分泌细胞的干扰 ✓ 比传统的ELISA和细胞内细胞因子染色法敏感20-200倍
❖样本量大的情况下实验结果可用计算机图象分 析系统进行快速、客观的分析
❖
基
Coating Ab
本
包被培养孔
原
理
根据实验设 计加入淋巴 细胞及含或 不含刺激因 子的培养液
酶联免疫斑点(ELISPOT)技术
❖ELISPOT（Enzyme-linked Immunospot Assay）
▪ 结合了细胞培养技术与酶联免疫吸附技术（即 ELISA技术），能够在单细胞水平检测细胞因子 的分泌情况；
▪ 用抗体原位捕获培养中的细胞分泌的细胞因子， 并以酶联斑点显色的方式将其表现出来。
❖双色ELISPOT结果示意图
蓝色：IFN-γ,红色：IL-2; 蓝色：IFN-γ,红色：IL-17
❖ ELISPOT
▪ B细胞杂交瘤的筛选 ▪ 化合物和药物免疫学反应的检测 ▪ 优化树突细胞和T细胞的抗肿瘤活性 ▪ 靶向疫苗的质控
方 ▪ 自身免疫疾病的诊断和预后分析 法 ▪ 自身免疫疾病免疫治疗的监控 主 ▪ 过敏性疾病的脱敏治疗的监测 要 ▪ 器官移植中排斥反应的预测 用 ▪ 微量组织、肿瘤和免疫细胞分泌谱的分析 途 ▪ 结核病的诊断
▪ 显色剂I和II应避光保存，不使用时切勿混合
❖ ELISPOT 实 验 结 果 示 意 图
细胞因子A
双抗体包被
❖双色ELISPOT原理
培养细胞 细胞因子B
包被抗体
Biotin-检测抗体
HRP-检测抗体 BCIP/NBT底物
AEC底物
斑点酶联免疫吸附试验（DOT-ELISA）
目次前言 (Ⅱ)1 范围 (1)2 规范性引用文件 (1)3 术语和定义 (1)4 检样要求 (1)5 检疫方法 (1)5. 1群体检疫......................................................................................................１5.1.1免疫核实......................................................................................................１5.1.2现场检查......................................................................................................１5. 2 流行病学调查................................................................................................１5. 3 解剖检查......................................................................................................１5. 4 病理学检查 (2)5. 5 病原电镜检查 (2)5. 6 免疫学检验 (2)5.6.1 斑点酶联免疫吸附试验(Dot-ELISA) (2)5.6.2葡萄球菌A蛋白协同凝集试验（SPA-COA） (2)5.7逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）检测 (2)6 无害化处理 (2)附录A （规范性附录）流行病学调查 (3)附录B （规范性附录）斑点酶联免疫吸附试验(Dot-ELISA) (4)附录C （规范性附录）葡萄球菌A蛋白协同凝集试验（SPA-COA） (5)附录D （规范性附录）逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）检测 (6)参考文献 (8)前言本标准的附录A、附录B、附录C、附录D为规范性附录。
分子医学技能-免疫：酶联免疫斑点(ELISPOT)技术
非无菌
PBST洗板10次
加入生物素标记 的detector Ab
370C孵育1小时后，PBST洗板5次
加入酶标抗生物素抗体(GABA)
370C孵育1小时后，PBST洗板5次
40C暗处混合显色剂I和II, 加入显色剂I/II,
暗处室温孵育20-30分钟
显微镜下观察至斑点形成， 去离子水清洗培养板 室温干燥后
酶联免疫斑点(ELISPOT)技术
一、ELISPOT检测细胞因子实验技术
❖Байду номын сангаас
基
Coating Ab
本
包被培养孔
并经BSA阻断
原
理
根据实验设 计加入淋巴 细胞及含或 不含刺激因 子的培养液
孵育
活化的淋巴细胞可分泌细胞 因子与Coating Ab结合
洗除细胞，依次加入生物素 标记的抗细胞因子抗体及酶 标抗生物素抗体进行反应
106抗原呈递细胞（APC）中混入特定数 量的IFN-γ+的T淋巴细胞 ，经下列方 法检测： ▪ ELISPOT ▪ 细胞内细胞因子染色（FACS） ▪ ELISA
X坐标： 106 APC中实际IFN-γ+T细胞数量 Y坐标： 各检测方法的检测结果
▪ B细胞杂交瘤的筛选
ELISPOT
▪ 化合物和药物免疫学反应的检测
预先将所检测细胞 孵育24-42小时
40C过夜 0.05%PBS-Tween20(PBST)
洗板5次
每孔加入1%BSA阻断
370C孵育1小时
按实验设计 加入含或不含刺激剂的培养液 及一定数目细胞孵育5-24小时
或者
脾 淋 巴 细 胞
单 核 细 胞 或
直 接 取 外 周 血
酶联免疫法操作方法
酶联免疫法操作方法酶联免疫法（ELISA）是一种常用的生物化学技术，可以用于检测生物样品中特定的分子或抗原。
这种技术通常用于医学、疾病诊断、生命科学研究等领域。
本文将对酶联免疫法的操作方法进行详细讲解。
1. 材料准备酶联免疫法需要使用许多化学试剂和实验室设备。
以下是您需要准备的材料和设备清单：- 酶标仪：用于检测酶反应的仪器。
- 酶标板：一个96孔板，用于承载样品和试剂。
- 一组特定抗体：一组适当的抗体，用于特定抗原的检测。
- 酵素标记抗体：与特定抗体配对的抗体。
- 色素反应底物：反应底物一般为辣根过氧化酶（HRP），可以加速反应。
- 缓冲液：用于控制pH 值。
- 洗涤缓冲液：用于除去未结合的抗体。
- 减少反应的溶剂：例如乙醇或醋酸。
2. 酶标板涂层- 将一组特定抗体叠加在酶标板上，至少在每个阱中基本完成。
- 冷藏或浸泡后，高温杀菌30分钟，使其粘附在阱壁上。
3. 样品和对照添加- 在练习之前，使用缓冲液中的或本地实验室中已知的标准，制备出标准曲线。
其他实验室设施可以提供您所需的标准曲线。
- 将准备好的标准曲线涂在第一行子孔中。
- 取一个样品孔，加入预处理样品。
- 取一个对照阱，一个不含想要检测的抗原和一个包含缓冲液的孔。
4. 抗原结合- 对孔进行洗涤，去掉阻止抗体绑定的所有未结合蛋白质和其他物质。
- 添加酵素标记型抗体，较少磷的酵素标记反应产物将被通过底部反应条件发生变化，使其与标准曲线匹配。
5. 颜色的开发和减少反应- 对酶标板进行染色反应，将底物添加到孔中，添加适量的少量底物和过氧化物，这样将产生所需的产品。
- 减少反应的过程是使用一定浓度的乙醇或醋酸来中断反应。
- 首先可以使用组织吸气纸吸去孔中液体，再用洗涤缓冲液反复洗涤以去除底物和其他离子，以减少背景噪音而无指结束反应。
6. 酶标仪检测- 使用酶标仪检测每个孔的吸光度，以比较样品吸收和标准曲线的吸收。
吸光度与知道浓度的标准曲线相对应。
酶联免疫斑点检测仪安全操作及保养规程
酶联免疫斑点检测仪安全操作及保养规程1. 引言酶联免疫斑点检测仪（ELISPOT）是一种常用于免疫学研究的实验设备。
为了保证实验室人员的安全以及设备的正常运行，需要遵守一系列安全操作和保养规程。
本文档将详细介绍酶联免疫斑点检测仪的安全操作及保养规程。
2. 设备安全操作规程2.1. 设备放置酶联免疫斑点检测仪应放置在干燥、通风良好的实验室台面上，远离易燃物质和化学品。
确保设备周围有足够的空间，以便进行样本处理和操作。
2.2. 电源连接在连接电源之前，确保电源插座符合设备的电压需求，并且接地可靠。
插头和插座之间不得出现松动或有暴露导线，以避免电击和火灾的风险。
2.3. 操作面板操作面板的按钮和旋钮应该平稳有序，无松动或不良接触的现象。
在操作前确保设备处于待机状态，并按照说明书正确操作。
2.4. 样本处理在进行样本处理时，应佩戴实验室安全手套和实验服。
避免直接接触样本和试剂，避免吸入样本和试剂的挥发物。
使用标准的生物安全柜进行操作，避免污染和交叉感染的风险。
2.5. 实验室安全酶联免疫斑点检测仪操作过程中要遵守实验室安全规范，包括正确处理和处置化学品废液、正确使用实验室设备、遵循生物安全操作等。
实验室人员应接受相关的培训和指导，了解实验室安全操作的要求。
3. 设备保养规程3.1. 定期清洁定期清洁酶联免疫斑点检测仪能够确保设备的正常运行，延长设备的使用寿命。
清洁过程中应注意以下事项：•使用干净的、柔软的布进行擦拭，避免使用含有酸、碱等化学成分的清洗剂。
•清洁时，应关闭设备并拔掉电源插头，以免发生意外。
•清洗过程中，应注意保护设备上的显示屏、按钮和插口，避免水或清洁剂渗入设备内部。
3.2. 定期维护定期对酶联免疫斑点检测仪进行维护能够及时发现设备的故障和问题，确保设备的正常运行。
维护工作应交由专业的技术人员进行，包括设备内部的清洁、零部件的更换等。
3.3. 备品备件在保养过程中，应随时准备备品备件，以备需要更换的情况。
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酶联免疫斑点法的操作方法
酶联免疫斑点法是一种广泛应用于免疫学和生物化学领域的分析技术，用于检测和定量分析抗原-抗体相互作用。
下面将详细介绍酶联免疫斑点法的操作方法。
一、实验材料与试剂准备
1. 试剂
- 抗原：根据实验需要准备相应的抗原。
- 抗体：根据实验需要选择合适的抗体，可以是多克隆抗体也可以是单克隆抗体。
- 酶标记的二抗：选择适当的酶标记二抗，如HRP、碱性磷酸酶等。
- 底物：根据所选择的酶标记物选择相应的底物。
- 缓冲液：根据实验需要选择相应的缓冲液，如PBS、TBST等。
- 洗涤液：常用的洗涤液为PBS或TBST。
- 显色底物：根据所选择的酶标记物选择相应的显色底物，如TMB、BCIP/NBT 等。
2. 实验仪器
- 酶标仪：用于测定底物酶解的吸光度或荧光值。
- 扫描仪：用于获得斑点形成的图像。
二、实验步骤
1. 制备实验板
- 选择合适的固相载体，如微孔板、膜、条或片等。
- 洗涤载体：根据选择的载体类型使用洗涤液充分洗涤载体，通常为3-4次洗涤。
- 固定抗原：将抗原溶液加入载体孔中，进行固定，通常需要孵育一段时间，如1-2小时。
- 停止固定反应：洗涤载体，用洗涤液洗涤3-4次。
2. 孔位的处理
- 阻断孔位：加入阻断液阻断非特异性吸附，如BSA、Bovine serum albumin 等。
- 洗涤液洗涤孔位：用洗涤液洗涤3-4次。
3. 添加抗体和酶标记二抗
- 加入抗体：添加适当稀释的抗体溶液到孔位中，孵育一段适当的时间，如1-2小时。
- 洗涤液洗涤孔位：用洗涤液洗涤孔位，洗涤3-4次。
- 加入酶标记二抗：添加适当稀释的酶标记二抗溶液到孔位中，孵育适当的时间，如1-2小时。
- 洗涤液洗涤孔位：用洗涤液洗涤孔位3-4次。
4. 显色和停止反应
- 加入显色底物：加入适当的显色底物，添加适当的底物溶液，使酶解产生可见的色斑或显色反应。
- 停止反应：根据所使用的显色底物的不同，选择适当的反应停止液。
5. 结果读取与分析
- 读取结果：将实验板放入酶标仪测定吸光度或荧光值，记录下各孔位的数值。
- 数据分析：根据实验设计进行数据分析，如计算抗原或抗体浓度。
以上就是酶联免疫斑点法的详细操作方法。
该方法广泛应用于医学诊断、生物学研究以及食品安全等领域，因其简便、灵敏和可靠性而备受青睐。
在实验操作过程中，需要严格控制实验的温度、时间和试剂的浓度，以确保实验结果的准确性。