酶联免疫检测法
酶联免疫分析的基本类型和原理
酶联免疫分析的基本类型和原理酶联免疫分析（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA）是一种灵敏的免疫学分析方法，广泛应用于生物医学领域，包括基础研究、临床诊断、药物筛选等。
该方法基于抗原-抗体的特异性结合反应，将酶与抗体或抗原的结合，通过酶促反应的放大效应，实现对蛋白质的灵敏检测。
一、酶联免疫分析的基本类型根据实验设计的不同，酶联免疫分析可以分为直接法和间接法两大类。
1.直接法：将酶标记的抗体直接与抗原反应，通过检测抗原-抗体-酶复合物的吸光度来定量抗原。
这种方法适用于检测抗原含量较高的样品，如病毒、细菌等。
2.间接法：将酶标记的抗抗体与特异性抗体反应，通过检测抗抗体-抗体-酶复合物的吸光度来定量特异性抗体。
这种方法适用于检测特异性抗体含量较高的样品，如血清、血浆等。
二、酶联免疫分析的原理酶联免疫分析的原理是利用抗原-抗体的特异性结合反应，将酶与抗体或抗原的结合，通过酶促反应的放大效应，实现对蛋白质的灵敏检测。
具体步骤如下：1.包被：将抗原或抗体包被在固相载体（如聚苯乙烯酶标板孔）上，使其与样品中的抗原或抗体结合。
2.温育：将包被后的样品放入温育箱中，保持一定温度和湿度，使抗原-抗体结合反应充分进行。
3.洗涤：洗涤未结合的游离抗原或抗体，去除未结合的物质，使后续步骤中的酶促反应更加特异。
4.加入酶标抗体或酶标抗原：将酶标记的抗体或抗原加入到洗涤后的样品中，使其与已结合的抗原或抗体特异性结合。
5.温育：将样品再次放入温育箱中，保持一定温度和湿度，使酶促反应充分进行。
6.洗涤：洗涤未结合的游离酶标抗体或酶标抗原，去除未结合的物质，使后续步骤中的显色反应更加特异。
7.显色：加入底物溶液，使其与已结合的酶标抗体或酶标抗原中的酶发生显色反应，生成有色产物。
8.终止反应：加入终止液，停止显色反应，使有色产物不再生成。
9.检测：用酶标仪测定各孔的光密度值，通过与标准曲线比较，计算出样品中待测抗原或抗体的浓度。
酶联免疫检测方法
酶联免疫检测方法
酶联免疫检测是一种常用的生物技术方法，它结合了酶标记和免疫反
应的原理，可用于检测生物样品中特定分子的含量，如蛋白质、抗体、激
素等。
具体步骤如下：
1.准备样品：从生物样品中提取目标分子，例如血液、尿液、细胞等。
2.免疫反应：将一定浓度的目标分子加入到反应孔中，并加入与目标
分子特异性的抗体，使两者发生免疫反应。
3.洗涤：对反应孔进行洗涤，以去除未与抗体结合的杂质以及剩余的
抗体。
4.添加荧光标记的二抗：向反应孔中加入荧光标记的二抗，使其与已
结合的抗体形成复合物。
5.洗涤：对反应孔进行再次洗涤，以去除未结合的荧光标记的二抗。
6.酶标记：向反应孔中加入用酶标记的物质（如酶标记的抗体），使
其与已结合的荧光标记的二抗形成复合物。
7.洗涤：对反应孔进行最后一次洗涤，以去除未结合的酶标记化合物。
8.反应染色：向反应孔中加入染色物质，使其与酶标记化合物发生颜
色反应，形成分析结果。
最终，检测结果可以通过测量反应孔中染色物质的光密度或荧光强度
来评估样品中目标分子的浓度。
酶联免疫检测方法具有高灵敏度、高特异
性和高通量等优点，广泛应用于医学、生物工程、食品安全等领域。
酶联免疫法
酶联免疫吸附试验（又称酵素免疫分析法，Enzyme-linked immunoassay，简称ELISA）利用抗原抗体之间专一性键结之特性，对检体进行检测；由于结合于固体承载物(一般为塑胶孔盘)上之抗原或抗体仍可具有免疫活性，因此设计其键结机制后，配合酵素呈色反应，即可显示特定抗原或抗体是否存在，并可利用呈色之深浅进行定量分析。
根据待测样品与键结机制的不同，ELISA可设计出各种不同类型的检测方式，主要以三明治法（sandwich）、间接法（indirect）、以及竞争法（Competitive）三种为主，以下为各种方法之介绍.三明治法常用于检测大分子抗原，一般之操作步骤为:1.将具有专一性之抗体固著（coating）于塑胶孔盘上，完成后洗去多余抗体2.加入待测检体，检体中若含有待测之抗原，则其会与塑胶孔盘上的抗体进行专一性键结3.洗去多余待测检体，加入另一种对抗原专一之一次抗体，与待测抗原进行键结4.洗去多余未键结一次抗体，加入带有酵素之二次抗体，与一次抗体键结5.洗去多余未键结二次抗体，加入酵素受质使酵素呈色，以肉眼或仪器读取呈色结果三明治法分别以两种抗体对检体中的抗原进行两次专一性辨认，因此专一性相当高，但此待测抗原必须是多价抗原，如此才可获得两种以上的专一性抗体，以分别进行夹心；而且此法需要足够的表位空间以进行抗原抗体的夹心，所以并不适用于半抗原或小分子抗原等分子量较小之标的。
间接法间接法常用于检测抗体，一般之操作步骤为：1.将已知之抗原固著于塑胶孔盘上，完成后洗去多余之抗原2.加入待测检体，检体中若含有待测之一次抗体，则其会与塑胶孔盘上的抗原进行专一性键结3.洗去多余待测检体，加入带有酵素之二次抗体，与待测之一次抗体键结4.洗去多余未键结二次抗体，加入酵素受质使酵素呈色，藉仪器（ELISA reader）测定塑胶盘中的吸光值（OD值），以评估有色终产物的含量即可测量待测抗原的含量。
竞争法竞争法是一种较少用到的ELISA检测机制，一般用于检测小分子抗原，其操作步骤为：1.将具有专一性之抗体固著于塑胶孔盘上，完成后洗去多余抗体2.加入待测检体，使检体中的待测抗原与塑胶孔盘上的抗体进行专一性键结3.加入带有酵素之抗原，此抗原也可与塑胶孔盘上的抗体进行专一性键结，由于塑胶孔盘上固著的抗体数量有限，因此当检体中抗原的量越多，则带有酵素之抗原可键结的固著抗体就越少，亦即，两种抗原皆竞相与塑胶孔盘上抗体键结，即所谓竞争法之由来。
酶联免疫分析法
②用已知抗体检测未知抗原； ③定性或定量检测体内多种大分子物质； ④用已知抗体检测某些药物、激素等多种半抗原物质。
第一节 酶联免疫分析概述
二、酶标识免疫分析法及常用标识酶 1、免疫分析法分类
第一节 酶联免疫分析概述
白都是抗体。 • 例如无免疫活性旳免疫球蛋白（如骨髓瘤蛋白）就不
是抗体，尽管其构造与抗体相同。 • 抗体主要存在于血清内，但在其他体液及外分泌液中
也有存在。 • 抗原抗体分子之间存在着构造互补性和亲和性，使得
抗原与相应抗体之间极易发生结合反应，这种反应具 有高特异性（即专一性）和可逆性。
第一节 酶联免疫分析概述
• Gal催化β-D-半乳糖苷水解反应旳最适pH为7.5，转 化效率很高，且比HRP易于标识，背景值低，稳定性 好。
• Gal比活力应不少于30U/mg，5℃能保存1～2年。
第二节 酶联免疫吸附分析法
一、光度酶联免疫分析 1 、 酶 联 免 疫 吸 附 分 析 （ enzyme-linked
immunosorbent assay，ELISA）原理 ①使抗原或抗体结合到某种固相载体表面； ②抗原或抗体与某种酶联结成酶标抗原或抗体； ③在测定时，使受检标本和酶标抗原或抗体按不同旳环
值也略高。 • ELISA载体旳形式有小试管、小珠和微量反应板。
第二节 酶联免疫吸附分析法
3、固相载体旳包被与封闭 （1）包被（coating）指将抗原或抗体连接到固相载体
上旳过程。 • 以聚苯乙烯微量反应板为例，一般先将抗原或抗体溶
于pH 9.6旳碳酸盐缓冲液（或pH 7.2旳磷酸盐缓冲 液，pH 7～8旳Tris-HCl缓冲液）中，加满反应孔， 置4℃过夜，洗涤即可。 • 包被浓度随载体和包被物旳性质可有很大旳变化，每 批材料需经过试验与酶结合物旳浓度协调选定。 • 一般蛋白质旳包被浓度为0.1～20µg/ml。
酶联免疫法;酶联免疫吸附试验法
酶联免疫法;酶联免疫吸附试验法
酶联免疫法（Enzyme-linked Immunosorbent Assay，ELISA）
是一种常用的免疫学实验技术，用于检测样本中特定蛋白质或其他
分子的存在。
酶联免疫法通过利用特异性抗体与特定抗原结合的原
理来进行检测。
这种方法的原理是将待检测的抗原或抗体与特定的
酶标记的抗体或抗原结合，然后通过酶的底物来检测酶的活性，从
而确定待检测物质的存在或浓度。
酶联免疫法主要分为直接ELISA、间接ELISA、竞争ELISA和间
接竞争ELISA等几种类型。
直接ELISA直接将被检测的抗原或抗体
吸附在固相载体上，然后加入与其特异性结合的酶标记的抗体或抗原，通过酶的底物来检测酶活性。
间接ELISA则是在固相载体上吸
附抗原后，再加入特异性抗体和酶标记的抗体，以增强检测的灵敏度。
竞争ELISA则是将待检测的抗原与酶标记的抗原竞争结合，通
过竞争程度来检测待检测物质的浓度。
间接竞争ELISA结合了间接ELISA和竞争ELISA的特点，可以用于检测抗体的浓度。
酶联免疫吸附试验法（Enzyme-linked Immunosorbent Assay，ELISA）是一种高度敏感和特异性的实验技术，广泛应用于医学诊断、生物学研究和生物制药工业等领域。
它的优点包括操作简便、成本
低廉、高通量性和可定量性等，因此被广泛用于检测疾病标志物、药物残留、植物病原体和基因工程产品等。
同时，酶联免疫法也有一些局限性，比如可能受到干扰物质的影响、需要一定的实验条件和设备等。
因此，在使用酶联免疫法时需要综合考虑其优缺点，并结合具体的实验要求来选择合适的方法和条件。
酶联免疫吸附法原理
酶联免疫吸附法原理酶联免疫吸附法（ELISA）是一种常用的生物化学分析方法，它基于抗体与抗原相互作用的原理，可以用于检测特定蛋白质的存在和浓度。
酶联免疫吸附法具有高灵敏度、高特异性和易操作等优点，因此在医学诊断、生物学研究和生物制药等领域得到了广泛的应用。
首先，酶联免疫吸附法的原理是基于抗体与抗原的特异性结合。
在实验中，首先将待检测的抗原溶液加入到微孔板中，使其吸附在孔板表面。
然后，加入特异性的一抗抗体，与待检测的抗原发生特异性结合。
接着，加入酶标记的二抗抗体，它会与一抗抗体结合形成复合物。
最后，加入底物，酶与底物发生反应产生可测的信号，通过测定信号的强度来确定待检测抗原的存在和浓度。
其次，酶联免疫吸附法的原理还包括两种常用的方法，间接法和夹心法。
间接法是指在待检测抗原与一抗抗体结合后，再加入酶标记的二抗抗体，通过二抗抗体与一抗抗体的结合来增强检测信号。
夹心法是指在待检测抗原与一抗抗体结合后，再加入抗原特异性的酶标记抗体，形成抗原-抗体-酶标记抗体的夹心复合物，从而增强检测信号。
此外，酶联免疫吸附法还可以根据检测信号的产生方式分为颜色反应法和发光反应法。
颜色反应法是指在酶与底物发生反应后产生可见的颜色变化，通过比色计或酶标仪来测定信号强度。
发光反应法是指在酶与底物发生化学反应产生发光信号，通过发光计来测定信号强度。
发光反应法具有高灵敏度和低背景信号的优点，因此在一些对灵敏度要求较高的实验中得到了广泛的应用。
总的来说，酶联免疫吸附法原理简单、灵敏度高、特异性强，操作简便，可以同时检测多个样品，因此在科研和临床诊断中得到了广泛的应用。
随着生物技术的不断发展，酶联免疫吸附法在蛋白质检测、疾病诊断和药物研发等领域将会发挥越来越重要的作用。
乙肝酶联免疫法检测的原理
乙肝酶联免疫法检测的原理乙肝酶联免疫法是一种常用的乙肝病毒感染诊断方法，其原理是基于抗原抗体反应来检测乙肝病毒表面抗原（HBsAg）和抗体（抗-HBs）的存在。
它通过将HBsAg 或抗-HBs抗体与酶标记的二抗结合，然后通过酶标底物反应产生可测量的信号，从而确定乙肝病毒感染的存在。
乙肝酶联免疫法的操作步骤主要包括试剂配置、标本处理、免疫反应、洗涤和检测。
以下详细介绍这些步骤及其原理：1. 试剂配置：首先，需要配置好抗原和抗体的试剂。
乙肝酶联免疫法常用的抗原有HBsAg和抗-HBs抗体，抗体则常用具有酶标记的二抗。
此外，还需配置其他试剂，如缓冲液、阻断剂和洗涤液等。
2. 标本处理：将需要检测的血清标本或其他生物体液（如尿液）进行处理，除去非特异性的干扰物质，并将其置于试剂板或其他检测材料上。
3. 免疫反应：在样本中加入抗-HBs酶标记复合物，复合物中的二抗可以与抗体结合，形成抗原-抗体-酶标记试剂的复合物。
然后，加入HBsAg或抗-HBs抗体，使之与复合物中的抗体结合，形成特异性抗原-抗体复合物。
4. 洗涤：洗去没有结合的非特异性抗体或其他干扰物，以减少误差。
这一步骤基于特异性抗原-抗体结合力强于非特异性结合的原理。
5. 检测：加入酶标底物，在适当的条件下进行反应。
酶标底物随后会被酶催化，产生显色或荧光等检测信号。
信号的强度可以反映出目标物的浓度，进而判断样本中是否存在乙肝病毒感染。
乙肝酶联免疫法的原理基于免疫学的基本原理。
乙肝病毒表面抗原（HBsAg）和抗体（抗-HBs）在乙肝感染过程中分别作为病毒的外壳蛋白和宿主免疫系统的产物，它们之间可以发生抗原抗体反应。
通过将HBsAg或抗-HBs抗体与酶标记的二抗结合，允许使用酶标底物作为信号产生体，从而可以定量或半定量地检测HBsAg或抗-HBs的存在。
乙肝酶联免疫法具有许多优点，如操作简便、结果快速、灵敏度高和特异性强等。
然而，也存在一些局限性，如易受到样本中其他抗体的干扰、需要定期校准和质控等。
酶联免疫操作方法
酶联免疫操作方法
酶联免疫操作方法是一种用于检测和定量分析特定蛋白质的技术方法。
以下是一般的酶联免疫操作方法的步骤：
1. 杂交：将待检的抗原或抗体固定在固相载体上，如微孔板或膜。
可以通过直接插入法或被动吸附法将抗原或抗体与载体结合。
2. 阻断：在固相载体上，加入一种非特异性蛋白质（如牛血清蛋白，BSA）或洗脱缓冲液来阻断未被固定的表面；这样可以减少非特异性结合。
3. 反应：加入待测样品，使其与固相上的抗原或抗体结合。
待测样品可能是抗原，也可能是抗体。
4. 洗涤：用洗涤缓冲液彻底洗涤固相载体，以去除未结合的物质，尤其是非特异性结合。
5. 标记：加入与待检测物质相匹配的标记物，如酶标签，荧光标记或放射性标记。
6. 反应：与酶标签或其他标记物相互作用，生成底物反应产物。
这种反应可用于颜色变化、荧光或放射性计数等信号读取。
7. 终止反应：加入终止试剂停止底物反应。
8. 测量：测量反应产物的信号强度，通过比较标准曲线或对照样品来定量待测物质的浓度。
以上是一般酶联免疫操作方法的步骤，不同的实验可以根据需要进行适当的调整。
酶联免疫吸附筛查法
酶联免疫吸附筛查法酶联免疫吸附试验(Enzyme-linked immunosorbent assay，简称ELISA) 利用抗原抗体之间专一性键结之特性，对检体进行检测；由于结合于固体承载物(一般为塑胶孔盘)上之抗原或抗体仍可具有免疫活性，因此设计其键结机制后，配合酵素呈色反应，即可显示特定抗原或抗体是否存在，并可利用呈色之深浅进行定量分析。
ELISA的基本原理有三条：（1）抗原或抗体能以物理性地吸附于固相载体表面，可能是蛋白和聚苯乙烯表面间的疏水性部分相互吸附，并保持其免疫学活性；（2）抗原或抗体可通过共价键与酶连接形成酶结合物，而此种酶结合物仍能保持其免疫学和酶学活性；（3）酶结合物与相应抗原或抗体结合后，可根据加入底物的颜色反应来判定是否有免疫反应的存在，而且颜色反应的深浅是与标本中相应抗原或抗体的量成正比例的，因此，可以按底物显色的程度显示试验结果。
测定抗原主要有：1、竞争法（Competition method）：本法首先将特异性抗体吸附于固相载体表面，我们把抗原和抗体吸附到固相载体表面的这个过程，称为包被 （Coated），也可叫做致敏。
经洗涤后分成两组：一组加酶标记抗原和被测抗原的混合液，而另一组只加酶标记抗原，再经孵育洗涤后加底物显色，这两组底物降解量之差，即为我们所要测定的未知抗原的量。
这种方法所测定的抗原只要有一个结合部位即可，因此，对小分子抗原如激素和药物之类的测定常用此法。
该法的优点是快，因为只有一个保温洗涤过程。
但需用较多量的酶标记抗原为其缺点。
2、双抗体夹心法：本法首先也是用特异性抗体包被于固相载体，经洗涤后加入含有抗原之待测样品，如待检样品中有相应抗原存在，即可与包被于固相载体上的特异性抗体结合，经保温孵育洗涤后，即可加入酶标记特异性抗体，再经孵育洗涤后，加底物显色进行测定，底物降解的量即为欲测抗原的量。
这种方法欲测的抗原必须有两个可以与抗体结合的部位，因为其一端要包被于固相载体上的抗体作用，而另一端则要与酶标记特异性抗体作用。
酶联免疫胶体金法
酶联免疫胶体金法（enzyme-linked immunogold assay，ELIGA）是一种常用的免疫试验方法，用于检测特定抗原或抗体的存在。
它结合了酶标技术和胶体金技术的优点，具有高灵敏度和高特异性的特点。
酶联免疫胶体金法的原理是将与特定抗原或抗体结合的胶体金标记物用作检测信号。
标记的胶体金微粒具有良好的稳定性和可视性，能够在光学显微镜下观察到。
该方法主要包括以下步骤：
1. 样品处理：对待检样品进行处理，如提取目标抗原或抗体。
2. 固相吸附：将处理后的样品加入固相吸附物（如酶标板、膜片等），使目标物质固定在上面。
3. 阻断：用适当的阻断液封闭非特异性吸附位点，减少假阳性反应。
4. 孵育：加入特异性原抗体或特异性标记的抗原，使其与固相上的目标物质结合。
5. 清洗：通过洗涤的方式去除未结合的物质，减少背景干扰。
6. 标记：加入胶体金标记物，使其与特异性抗体或抗原结合。
7. 可视化：使用适当的显色底物，使得胶体金变成颜色或形成可见沉淀。
8. 停止反应：加入停止液或停止酶作用，使反应停止。
9. 分析：使用光学显微镜或分光光度计等设备对结果进行观察和分析。
酶联免疫胶体金法广泛应用于生物医学研究、临床诊断和生物工程领域，可用于检测病原微生物、肿瘤标记物、抗体、激素等生物分子的存在和定量分析。
酶联免疫法方法学确认
酶联免疫法方法学确认酶联免疫法（ELISA）是一种广泛应用于生物医学研究和临床诊断的免疫分析技术。
它通过特异性抗体与抗原结合，然后利用酶标记的二抗与一抗结合，通过酶催化底物产生颜色反应，从而定量测定目标物质的含量。
为了确保ELISA方法的准确性、可靠性和可重复性，需要进行方法学确认。
方法学确认主要包括以下几个方面：1. 线性范围：确定ELISA方法的检测范围，即标准曲线的最低和最高浓度。
通常要求线性范围至少覆盖待测样品中目标物质的最低和最高浓度。
2. 精确度：评估ELISA方法的测量结果与真实值之间的一致性。
可以通过重复测量同一浓度的标准品或质控品，计算均值、标准差和变异系数等指标来评价精确度。
3. 准确度：评估ELISA方法测量结果与已知真实值之间的符合程度。
可以通过将标准品或质控品与参考方法进行比较，计算回收率和偏差等指标来评价准确度。
4. 灵敏度：评估ELISA方法对低浓度目标物质的检测能力。
可以通过测量不同浓度的标准品，计算检出限和定量限等指标来评价灵敏度。
5. 特异性：评估ELISA方法对目标物质的识别能力，以及与其他类似物质的区分能力。
可以通过交叉反应试验和干扰试验等方法来评价特异性。
6. 精密度：评估ELISA方法在不同实验条件下的稳定性和重复性。
可以通过重复测量同一浓度的标准品或质控品，计算日内和日间变异系数等指标来评价精密度。
7. 试剂盒性能评估：对购买的商业试剂盒进行性能评估，包括线性范围、精确度、准确度、灵敏度、特异性和精密度等方面。
8. 质量控制：建立合适的质控体系，包括选择适当的质控品、确定质控规则和频率、监测系统误差等，以确保ELISA方法的稳定性和可靠性。
通过对ELISA方法进行严格的方法学确认，可以确保其在实际应用中的准确性、可靠性和可重复性，为生物医学研究和临床诊断提供有力支持。
酶联免疫吸附测定法
实验器材和药品
固相载体在ELISA测定过程中作为吸附 剂和容器。 最常用的是聚苯乙烯和聚氯乙 烯 。它们有较强的吸附蛋白质的性能，抗 体或蛋白质抗原吸附其上后仍保留原来的 免疫学活性。 微量滴定板，量滴定板为8×12的96孔 式。ELISA板的特点是可以同时进行大量标 本的检测，并可在特制的比色计上迅速读 出结果。聚苯乙烯经射线照射后，其吸附 性增加。
酶联免疫吸附测定法
基本原理 它采用抗原与抗体的特异反应将待
测物与酶连接，然后通过酶与底物产生 颜色反应，用于定量测定。测定的对象 可以是抗体也可以是抗原。
在这种测定方法中有3种必要的试剂：
①固相的抗原或抗体（免疫吸附剂） ②酶标记的抗原或抗体（标记物） ③酶作用的底物（显色剂）
它是检测抗原最常用ELISA，适用于检测分子中具有至少两个抗原决定簇的多价抗原。 其基本工作原理是：利用连接于固相载体上的抗体和酶标抗体分别与样品中被检测抗原分子上两个抗原决定簇结合，形成固相抗体-抗 原-酶标抗体免疫复合物。 HRP反应终止液为硫酸，一般采用2mol/L 它是检测抗原最常用ELISA，适用于检测分子中具有至少两个抗原决定簇的多价抗原。 阳性对照品(positive control)和阴性对照品(negative control) 在这种测定方法中有3种必要的试剂： 加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体(经滴定后的稀释度)0. DNM-9602 标配酶标分析仪 05%吐温20的磷酸盐缓冲液。 实验原理 双抗体夹心法
05%吐温20的磷酸盐缓冲液。 产物为黄色的对硝基酚，在405nm波长处有吸收峰。 1ml于已包被之反应孔中，置37℃孵育1小时。
实验原理 双抗体心法
双抗体夹心法，属于非竞争结合测定。它是检测 抗原最常用ELISA，适用于检测分子中具有至少 两个抗原决定簇的多价抗原。 其基本工作原理是：利用连接于固相载体上 的抗体和酶标抗体分别与样品中被检测抗原分子 上两个抗原决定簇结合，形成固相抗体-抗原-酶 标抗体免疫复合物。复合物的形成量与待测抗原 的含量成正比。测定复合物中的酶作用于加入的 底物后生成的有色物质量(OD值)，即可确定待测 抗原含量。
酶联免疫法
酶联免疫法酶联免疫法是一种灵敏度非常高的检测技术，它可以用来检测微量物质，广泛应用于各种生物学研究中。
酶联免疫法的这种特殊特性，使它在医学检验、环境污染监测、食品安全检测以及其他科学研究中得到了广泛的应用。
一、酶联免疫法简介酶联免疫法，又称酶连接免疫吸附测定（ELISA），是一种常见的生物分子检测技术，可以检测出极低的抗原浓度。
它是一种免疫学技术，它通过特异性抗体和酶的特殊反应，以达到非常灵敏的检测效果。
酶联免疫法的基本原理是：首先，将要检测的样品（抗原或抗体）和特异性抗体在反应板上发生反应，然后，将一种酶修饰的抗原特异性抗体溶解液加入，反应结束后，再加入酶的底物溶液，底物溶液中的特异性酶会与反应板上的抗原特异性抗体结合，形成抗原-酶复合物，最后用测定仪测定抗原-酶复合物的光谱，从而得到检测结果。
二、酶联免疫法的应用1、医学检验酶联免疫法在医学检验方面，可以用于检测各种病毒、细菌及其抗原，如肝炎、梅毒、登革热等；也可以用于检测抗体，如抗体检测、免疫球蛋白检测等；还可以用于检测放射性标记的抗原或抗体，用于免疫学研究与临床诊断。
2、食品安全检测酶联免疫法可以用于检测各种污染物，如残留农药、重金属、疾病菌等，以确保食品安全。
3、环境污染监测酶联免疫法可以用于环境污染监测，可以检测出游离态的污染物，如氨、氯、硫酸盐等，以及致病菌、抗药性菌等，为控制环境污染提供重要的参考数据。
4、其他科学研究除了上述应用外，酶联免疫法还可以用于其他科学研究，如生物化学、分子生物学、遗传学、细胞生物学等，可以用来研究蛋白质、核酸、糖蛋白等生物物质。
三、酶联免疫法的优缺点1、优点a) 酶联免疫法的灵敏度很高，可以检测出极低的抗原浓度；b) 反应快速，结果准确；c) 操作简单，容易稳定；d) 可以同时检测多个抗原或抗体，效率高；e) 反应条件可以调整，可以根据不同的样品进行调整。
2、缺点a) 需要一定的抗体，而抗体的生产时间较长；b) 对抗原的特异性较弱；c) 稀释抗体可能会引起误差；d) 检测时，可能会受到干扰物的影响。
酶联免疫吸附测定法
检测方法
检测方法
双抗体夹心法 双抗体夹心法双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，操作步骤如下： 一、将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体：洗涤除去未结合的抗体及杂质。 二、加受检标本：使之与固相抗体接触反应一段时间，让标本中的抗原与固相载体上的抗体结合，形成固相 抗原复合物。洗涤除去其他未结合的物质。 三、加酶标抗体：使固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时固相载体 上带有的酶量与标本中受检物质的量正相关。 四、加底物：夹心式复合物中的酶催化底物成为有色产物。根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量。 根据同样原理，将大分子抗体分别制备固相抗原和酶标抗原结合物，即可用双抗原夹心法测定标本中的抗体。 在临床检验中，此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原，例如HBsAg、HBeAg、AFP、hCG等。只要获得针 对受检抗原的异性抗体，就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法。如抗体的来源为抗血清，包被和酶 标用的抗体最好分别取自不同种属的动物。如应用单克隆抗体，一般选择两个针对抗原上不同决定簇的单抗，分 别用于包被固相载体和制备酶结合物。
酶联免疫吸附测定法
保持其免疫活性的测定方法
01 检测简介
03 注意事项
目录
02 基本原理 04 检测步骤
05 检测方法
07 酶标记法
目录
06 标记用酶 08 效果测定
基本信息
1971年瑞典学者Engvall和Perlmann,荷兰学者Van Weerman和Schuurs分别报道将免疫技术发展为检测体液 中微量物质的固相免疫测定方法，即酶联免疫吸附测定法 (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay, ELISA)。 ELISA已成为分析化学领域中的前沿课题，它是一种特殊的试剂分析方法，是在免疫酶技术( immunoenzymatic techniques )的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术。
《酶联免疫分析法》课件
酶联免疫分析法广泛应用于医学、生物学、环境科学等领域。
分类：直接法、间接法、双抗体夹心法、竞争法等 应用：临床诊断、药物研发、食品安全检测、环境监测等领域 优点：灵敏度高、特异性强、操作简便、成本低等 局限性：存在假阳性和假阴性结果，需要标准化操作和严格的质量控制
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CONTENTS
PART ONE
PART TWO
酶联免疫分析法（ELISA）是一种免疫学检测方法，用于检测样品中的抗原或抗体。
原理：利用抗原-抗体特异性结合的原理，通过酶催化底物产生颜色反应，从而定量或定性检测样品中的抗原或 抗体。
优点：灵敏度高，特异性强，检测速度快，操作简便 缺点：成本较高，需要专业人员操作，容易受到环境因素影响
PART THREE
抗原选择：选择合适的抗原，如蛋 白质、多肽等
抗原标记：将抗原与酶或荧光素等 标记物结合
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抗原纯化：通过离心、层析等方法 纯化抗原
抗原保存：将标记好的抗原保存在 适当的条件下，如低温、避光等
检测水中有机污染物：如农药、多 环芳烃等
检测土壤中的污染物：如重金属、 有机氯农药等
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检测空气中的污染物：如二氧化硫、 氮氧化物等
检测生物体内的污染物：如农药残 留、重金属等
蛋白质定量分析：通过酶联免疫分析法检测蛋白质的浓度 抗体检测：通过酶联免疫分析法检测抗体的存在和浓度 细胞因子检测：通过酶联免疫分析法检测细胞因子的存在和浓度 基因表达分析：通过酶联免疫分析法检测基因的表达水平和调控机制
酶联免疫吸附测定法
酶联免疫吸附测定法（ELISA）1.定义 (3)2.原理 (3)2.1抗原抗体反应 (3)2.2免疫测定在临床检验中的应用 (5)3.ELISA的类型 (5)3.1双抗体夹心法测抗原： (6)3.2双抗原夹心法测抗体 (6)3.3间接法测抗体 (6)3.4竞争法测抗体 (7)3.5竞争性测抗原 (7)3.6捕获包被法测抗体 (7)3.7ABS-ELISA法 (8)4.ELISA试剂的组成 (9)4.1固相载体： (9)4.2包被的方式 (9)4.3包被用抗原：天然抗原、重组抗原、合成多肽抗原。
(10)4.4包被的条件： (10)4.5洗涤液： (10)4.7酶的催化性； (11)4.8结合物的制备 (11)4.9结合物的保存 (12)4.10酶的底物 (12)4.11酶反应终止液 (12)4.12参考标准品 (13)4.13加样： (13)4.14保温 (13)4.15保温方式： (13)4.16室温温育的反应 (13)4.17洗涤 (14)4.18显色 (14)4.19比色 (14)4.20酶标比色仪 (15)4.21结果判定 (15)4.22定量测定 (16)4.23ELISA的操作要点 (16)1.定义酶联免疫吸附测定法（Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay），简称ELISA，采用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接，然后通过酶与底物产生颜色反应，对受检物质进行定性或定量分析的一种检测方法。
2.原理采用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接，然后通过酶与底物产生颜色反应，可对受检物质的定性或定量分析。
2.1抗原抗体反应2.1.1可逆性抗原与抗体结合形成抗原抗体复合物的过程是一种动态平衡，其反应式为：Ag+Ab→Ag·Ab抗体的亲和力（affinity），可以用平衡常数K表示：K=[Ag·Ab]／[Ag][Ab]，Ag·Ab的解离程度与K值有关。
酶联免疫法方法学确认
酶联免疫法方法学确认酶联免疫法（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）是一种常用的生化分析技术，广泛应用于不同领域的免疫学研究、临床诊断和药物开发等方面。
本文将就酶联免疫法的方法学确认进行详细论述。
1. 引言酶联免疫法是一种将免疫学原理与酶学技术相结合的高灵敏度定量分析方法。
该方法通过利用抗原与特异性抗体的结合来检测目标物质，一般情况下将抗原固定在固相载体上，通过检测标记在抗体上的酶来定量目标物质。
酶联免疫法具有高灵敏度、高特异性和高通量等优势，适用于不同类型的样品和目标物质。
方法学确认是确保酶联免疫法准确可靠的重要步骤，下文将对方法学确认的关键步骤进行探讨。
2. 样品的处理与制备在进行酶联免疫法之前，样品的处理与制备是非常重要的步骤。
样品的选择取决于研究的目的和需求，可以是血清、尿液、细胞组织等。
在样品处理过程中，需要注意样品的保存和保存条件，以免对目标物质的活性与稳定性产生影响。
同时，样品的制备要遵循标准操作规程，确保样品的纯度和质量。
例如，在血清样品处理中，需要注意避免血浆中的凝块或其他颗粒物对结果的影响。
3. 抗原与抗体的选择酶联免疫法的核心是抗原与抗体的特异性结合，因此抗原和抗体的选择是至关重要的。
抗原的选择应基于研究的目的，需要充分考虑样品来源和目标物质的特性。
抗体的选择也需根据抗原的性质和特异性来确定。
在此过程中，可以通过相关文献的查阅与实验室经验的积累进行指导。
4. 实验步骤与优化酶联免疫法的实验步骤包括固相抗原的包被、样品处理、抗体的结合与检测等。
每个步骤的参数和条件需要进行优化，以达到最佳的灵敏度和特异性。
例如，在抗原的包被步骤中，可以优化抗原的浓度和包被时间，以提高固相抗原的结合效率。
在样品处理步骤中，可以选择适当的稀释倍数和处理时间，以消除干扰物质对结果的干扰。
抗体的结合与检测步骤也需要优化相应的条件，以确保准确的定量分析。
5. 阳性对照与阴性对照在酶联免疫法的方法学确认中，阳性对照与阴性对照的选择与使用是必不可少的。
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酶联免疫检测法
一、概述
酶联免疫检测法是一种常见的生物分子检测方法，它利用酶作为标记
物来检测目标分子，具有高灵敏度、高特异性、易操作等优点，广泛
应用于医学、生物学、化学等领域。
二、原理
酶联免疫检测法基于抗原-抗体反应原理，包括直接酶联免疫吸附试验（ELISA）、间接ELISA、竞争ELISA和间接竞争ELISA等多种类型。
其中，最常见的是直接和间接ELISA。
1. 直接ELISA
直接ELISA是将已知抗体固定在微孔板上，并加入待检样本中含有目
标抗原的溶液，经过一定条件下的反应后，再加入与目标抗原结合的
酶标记二抗，在适当条件下进行染色反应并测定吸光度值。
其优点是
操作简单快捷，但缺点是灵敏度略低。
2. 间接ELISA
间接ELISA是将已知抗体固定在微孔板上，并加入待检样本中含有目
标抗原的溶液，在适当条件下进行反应后加入与目标抗原结合的一抗，再加入与一抗结合的酶标记二抗，在适当条件下进行染色反应并测定
吸光度值。
其优点是灵敏度高，但操作稍复杂。
三、步骤
酶联免疫检测法的基本步骤如下：
1. 预处理样本：根据不同的样本类型和检测要求，可以进行不同的处理方法，如离心、洗涤、稀释等。
2. 固定抗原或抗体：将已知抗体或抗原固定在微孔板上。
3. 加入待检样本：加入含有目标分子的待检样本。
4. 洗涤：将未结合的物质洗去。
5. 加入酶标记二抗或一抗：根据实验设计需要选择适当的酶标记二抗或一抗，并加入微孔板中与目标分子结合。
6. 洗涤：将未结合的物质洗去。
7. 加入底物：加入适当底物后，在适当条件下进行染色反应。
8. 停止反应并测定吸光度值：在反应停止后，使用光谱仪等设备测定吸光度值，并根据标准曲线计算待检样本中目标分子的浓度。
四、应用
酶联免疫检测法在医学、生物学、化学等领域有广泛的应用，常见的应用包括：
1. 临床诊断：如肝炎病毒、艾滋病毒等感染的诊断。
2. 药物检测：如抗生素、激素等药物残留的检测。
3. 食品安全：如农药残留、食品添加剂等的检测。
4. 生命科学：如蛋白质表达水平、基因表达水平等的定量分析。
五、总结
酶联免疫检测法是一种简单易行且灵敏度高的生物分子检测方法，具有广泛应用前景。
在实验过程中需要注意实验设计和条件控制，以保证结果准确可靠。