酶联免疫斑点试验

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酶联免疫斑点试验检测技术(Elispot)在诊断结核性脑膜炎中的应用

提供，脑脊液Ｔ — ＮＰＲ）平 ≥５０ｃｐｅ／ｌ断为阳ＢＤＡ（Ｃ水０ｏｉｍ判ｓ
性，５０ｃｐｅｍ判断为阴性。检测结果使用Ｐｉ５０软＜０ｏｉ／ｌｓｒｍ．ｓ
件包进行数据统计和统计学分析。两组间率的比较采用卡方
特异性ｒ扰素（Ｆ —）平可以用于结核分枝杆菌感染的干ＩＮｒ水
断为阳性，抗原检测结果为阴性，果判断为阴性；有３种结所脑膜脑炎病例均常规行脑脊液ＡＡ、脊液Ｔ — ＮＰＲ）Ｄ脑ＢＤＡ（Ｃ
检测。脑脊液ＡＡ使用酶标法进行检测，据国内同行Ｄ根２００４年对脑脊液ＡＡ在结核性脑膜脑炎中研究的标准ＪＤ，脑脊液ＡＡ１８ＵＬ判断为阳性，８ＵＬ判断为阴性；Ｄ＞／＜／脑脊
液Ｔ —ＮＢＤＡ荧光定量聚合酶链反应试剂由达安基因有限公司
选非结核性脑膜脑炎病例均通过临床治疗转归及实验室检查最终确诊。
方法
所有病例均抽取乙二胺四乙酸（ＤＡ）凝血５ｍ，ＥＴ抗ｌ送
实验室行Ｅｉｏ检测。检测结果根据斑点数量设定，一反ｌｐｔｓ每
术在结核性脑膜脑炎中的应用价值。
临床资料
、
果
在７例结核性脑膜脑炎的诊断中，ｌｐｔ性者４３Ｅｉｏ阳ｓ５

3例结核确诊病例的酶联免疫斑点实验分析

ｍｕｎｏｓｐｏｔａｓｓａｙｉｎｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒ —
诊右肺中过清音，听诊双肺呼吸音粗，余阴性。实验室检查：痰集菌３＋，血沉：１３０ｍｍ／ｈ；胸片：右肺中
ｃｕｌｏｓｉｓｉｎｆｅｃｔｉｏｎＥＬＩＳＰＯＴＴＥＳＴ．ＭＴＢ）是一种ｒ干扰素释放分析，用酶联免疫斑点技术检测对６ＫＤ早期分泌性靶抗原（ｅａｒｌｙｓｅｃｒｅｔｏｒｙａｎｔｉｇｅｎｔａｒｇｅｔ６，ＥＳＡＴ一６）和１０ＫＤ培养滤过蛋白肽段库（ｃｕｌｔｕｒｅｆｉｌｔｒａｔｅｐｒｏｔｅｉｎ一１０。ＣＦＰ—ｌＯ）反应的酶联免疫以诊
巨大空洞影。入院诊断：双肺继发型肺结核（右肺中空洞）。给予四化抗痨治疗（利福平０．４５ｇ，比嗪酰胺１．５ｇ日１次，口服；静点异烟肼０．３ｇ，卷曲霉素
０．７５ｇ）。
ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｏｆｔｕｂｅｒｃｕｌｉｎ）：１６ｍｍ×１６ｍｍ伴有水泡；
断结核感染，ＥＳＡＴ一６和ＣＦＰ一１０此文中简称为Ａ和Ｂ，具有高度敏感性和特异性，不受机体免疫力及卡介苗接种的影响阻］。现就我所３例确诊结核病例行结核感染酶联免疫斑点实验结果与常规化验结果进行对比分析。

酶联免疫斑点法的操作方法

酶联免疫斑点法的操作方法酶联免疫斑点法是一种广泛应用于免疫学和生物化学领域的分析技术，用于检测和定量分析抗原-抗体相互作用。

下面将详细介绍酶联免疫斑点法的操作方法。

一、实验材料与试剂准备1. 试剂- 抗原：根据实验需要准备相应的抗原。

- 抗体：根据实验需要选择合适的抗体，可以是多克隆抗体也可以是单克隆抗体。

- 酶标记的二抗：选择适当的酶标记二抗，如HRP、碱性磷酸酶等。

- 底物：根据所选择的酶标记物选择相应的底物。

- 缓冲液：根据实验需要选择相应的缓冲液，如PBS、TBST等。

- 洗涤液：常用的洗涤液为PBS或TBST。

- 显色底物：根据所选择的酶标记物选择相应的显色底物，如TMB、BCIP/NBT 等。

2. 实验仪器- 酶标仪：用于测定底物酶解的吸光度或荧光值。

- 扫描仪：用于获得斑点形成的图像。

二、实验步骤1. 制备实验板- 选择合适的固相载体，如微孔板、膜、条或片等。

- 洗涤载体：根据选择的载体类型使用洗涤液充分洗涤载体，通常为3-4次洗涤。

- 固定抗原：将抗原溶液加入载体孔中，进行固定，通常需要孵育一段时间，如1-2小时。

- 停止固定反应：洗涤载体，用洗涤液洗涤3-4次。

2. 孔位的处理- 阻断孔位：加入阻断液阻断非特异性吸附，如BSA、Bovine serum albumin 等。

- 洗涤液洗涤孔位：用洗涤液洗涤3-4次。

3. 添加抗体和酶标记二抗- 加入抗体：添加适当稀释的抗体溶液到孔位中，孵育一段适当的时间，如1-2小时。

- 洗涤液洗涤孔位：用洗涤液洗涤孔位，洗涤3-4次。

- 加入酶标记二抗：添加适当稀释的酶标记二抗溶液到孔位中，孵育适当的时间，如1-2小时。

- 洗涤液洗涤孔位：用洗涤液洗涤孔位3-4次。

4. 显色和停止反应- 加入显色底物：加入适当的显色底物，添加适当的底物溶液，使酶解产生可见的色斑或显色反应。

- 停止反应：根据所使用的显色底物的不同，选择适当的反应停止液。

5. 结果读取与分析- 读取结果：将实验板放入酶标仪测定吸光度或荧光值，记录下各孔位的数值。

酶联免疫斑点技术

酶联免疫斑点技术摘要:介绍了酶联免疫斑点技术(ELISPOT)的发展历程，检测原理及应用方面的相关内容。

关键词：酶联免疫斑点技术；免疫检测技术随着酶免疫分析技术在医学及生物学领域的广泛应用, 使体外检测各种细胞因子和抗体研究有了新的突破。

在研究免疫应答机制时, 以往人们常用酶联免疫吸附试验(ELISA) 检测体液中游离的细胞因子(CK) 或抗体, 但由于游离的循环抗体或CK 半衰期不同, 使之在体液中不断地被代谢或与靶器官结合, 而不能确切地反应体内抗体及CK 水平。

80 年代中期, Sedgw ick、Ho lt 和Czerk in sky 等根据ELISA 技术的基本原理, 建立了体外检测特异性抗体分泌细胞和CK 分泌细胞的固相酶联免疫斑点(ELISPOT) 技术, 因其具有较高的特异性和敏感性, 目前正被国内外广泛应用, 对探索自身免疫系统疾病发病机制具有重要意义。

1.ELISPOT技术的发展史1.1溶血空斑技术.80 年代初用于检测抗体形成细胞, 是对细胞免疫学的重要方法学贡献, 可从单细胞水平研究抗体的产生。

但该方法不够灵敏。

另外, 许多抗原决定簇与红细胞表面耦联困难, 使该方法应用受到限制。

1.2细胞ELISA.以酶标记物取代放射标记定量细胞表面分子, 因微量板内有细胞的存在将会产生较高背景。

另外, 细胞需固定于平板上, 也会引起非特异性结合, 产生假阳性结果。

固定还会引起一些细胞表面抗原的破坏而影响检测的敏感性。

1.3ELISPOT.由于上述原因, 1983 年两个研究小组分别在瑞典和奥地利同时报道了另一抗体分泌细胞的检测技术, 即ELISPOT。

1988 年, 首次用该方法检测CK IFN-γ分泌细胞, 目前已多用此方法检测CK, 其技术方法亦在逐步更新。

多年来作者实验室已用该方法检测重症肌无力及多发性硬化患者外周血的CK 分泌细胞, 共计数百例, 并发表论著数篇, 总结了一些方法学方面的经验。

酶联免疫斑点检测技术对结核性脑膜炎的诊断分析

酶联免疫斑点检测技术对结核性脑膜炎的诊断分析一、酶联免疫斑点检测技术简介酶联免疫斑点检测技术是一种用于检测蛋白质激活的新型生物物理化学技术，该技术利用酶标记的抗体与细胞分泌的干扰素γ（IFN-γ）结合，通过酶作用将显色底物作用聚积在细胞分泌的蛋白质的位置，形成斑点。

通过计数斑点的数量，可以间接反映出细胞分泌的干扰素γ的水平，从而分析细胞免疫功能。

酶联免疫斑点检测技术具有灵敏度高、准确性好、操作简单快捷等优点，已被广泛应用于病毒性感染、肿瘤免疫治疗、自身免疫性疾病等领域。

二、酶联免疫斑点检测技术在结核性脑膜炎诊断中的应用1. IFN-γ的检测IFN-γ是由T细胞和自然杀伤细胞分泌的一种细胞因子，其在机体的抗结核感染和免疫过程中起着非常重要的作用。

结核分枝杆菌感染后，机体会产生大量的IFN-γ，通过检测IFN-γ水平可以判断机体是否感染结核分枝杆菌。

酶联免疫斑点检测技术正是通过检测IFN-γ水平来诊断结核病的一种重要方法。

应用该技术，可以在脑脊液中检测到IFN-γ水平的变化，从而辅助结核性脑膜炎的诊断。

2. 结核分枝杆菌特异性抗原的检测酶联免疫斑点检测技术可以利用结核分枝杆菌特异性抗原来刺激患者的T细胞，进而检测其分泌的IFN-γ水平。

该方法的优势在于可以用特异性的抗原刺激T细胞，从而提高检测的特异性。

结核分枝杆菌特异性抗原包括早期分泌抗原（ESAT-6、Cfp10）和Ag85等，这些抗原可以刺激机体产生特异性的免疫应答，因此可以作为诊断结核性脑膜炎的生物标志物。

三、酶联免疫斑点检测技术的挑战与展望尽管酶联免疫斑点检测技术在结核性脑膜炎诊断中表现出了良好的应用前景，但仍然面临着一些挑战。

酶联免疫斑点检测技术在操作上需要高度的专业技能，对实验人员的要求较高。

目前酶联免疫斑点检测技术的商业化产品尚未完善，需要更多的临床验证和实际应用。

结核分枝杆菌的种类和亚型繁多，不同地区和不同个体对结核分枝杆菌的免疫应答也存在差异，因此需要针对性地选择合适的抗原进行检测，从而提高诊断的特异性和准确性。

酶联免疫斑点法

酶联免疫斑点法酶联免疫斑点法（Enzyme-linked immunospot assay, ELISPOT）是一种用于检测单个细胞分泌物（包括细胞因子、抗体和其他蛋白质）的方法。

该技术将单个细胞和特异性抗体共同培养于多孔的固体基质上，当特异性抗体捕获了细胞分泌物时，就会形成一个“免疫斑点”，而该斑点会通过化学反应显示出来，从而可进行定量分析。

该技术的优点一是提高了灵敏度和特异性，促进了单个细胞分泌物的检测能力。

二是实验条件较容易控制，能够极大地减少误差。

另外，与其他技术相比，ELISPOT技术具有较高的自动化水平和适应性。

同时，该技术可用于评估和比较不同治疗方案或疫苗的效果、评估细胞免疫反应、疾病诊断和监测、评估药物毒性和进行基础研究。

在实验中，ELISPOT可分为两个阶段。

第一阶段是细胞培养，即将感兴趣的细胞和特定的刺激物共同培养。

第二阶段是免疫斑点检测，即将细胞移到多孔的固体基质上，添加特异性抗体进行反应，以发现并定量斑点。

常用的免疫斑点计数仪可以通过电子显微镜对固定、染色的免疫斑点进行准确计数，从而获得准确的结果。

通过该技术，研究人员可以研究细胞免疫和疫苗的作用机制，及早发现传染病或肿瘤的预警信号，以促进更好的预防和治疗。

此外，酶联免疫斑点法也适用于儿童疫苗接种后对疫情的监测和跟踪，以及老年人免疫力的评估。

需要指出的是，这种技术并不能够直接用于临床检测，仅在研究领域发挥作用。

一些商业实验室已经开始使用该技术进行疫苗测试和特定蛋白质的检测，在检测和诊断方面具有很大的潜力。

总之，酶联免疫斑点法是一种基于细胞分泌物检测的技术手段，在生物医学研究、药物开发以及疾病预防和治疗等方面具有较为重要的应用价值。

斑点酶联免疫吸附试验原理

斑点酶联免疫吸附试验原理斑点酶联免疫吸附试验（ELISA）：从表面到内部的探索1. 什么是斑点酶联免疫吸附试验？•斑点酶联免疫吸附试验（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，简称ELISA）是一种常用于检测肿瘤抗原、感染性疾病、药物残留等的生物学分析技术。

•ELISA利用酶标记抗体与待测物相互作用，并通过最终的酶反应产生可见的颜色变化，从而定量或定性分析目标物质的存在和浓度。

2. ELISA的原理与步骤原理概述•ELISA利用了抗体与抗原之间的高度特异性反应，实现对目标物质的检测。

•一般的ELISA试验分为直接ELISA、间接ELISA、间接竞争ELISA 和竞争ELISA四种常见形式。

步骤详解1.试样处理与包被：待测样品中的目标物质与特异性抗体结合，形成目标物-抗体复合物。

2.洗涤：将未结合的其他物质洗去，保证后续反应的准确性。

3.二抗添加：加入与目标物-抗体复合物反应的次级抗体，次级抗体通常与酶分子偶联。

4.洗涤：去除未结合的次级抗体，减少背景干扰。

5.底物添加：加入酶底物，与酶发生反应后会呈现可见的颜色变化。

6.反应停止：通过添加反应停止剂停止酶反应，停止颜色的发展过程。

7.读数与结果分析：使用光谱仪或光密度计读取样品的吸光度或荧光强度，并根据标准曲线计算待测样品中目标物质的浓度或定性判断。

3. ELISA的优势和应用领域•高灵敏度和特异性：ELISA可以检测目标物质的微量浓度，并在复杂样品中准确鉴定。

•定量和定性分析：根据标准曲线，ELISA可以定量测定待测样品中目标物质的浓度，也可用于定性判断目标物质的存在与否。

•广泛应用于医学、农业和生物科学等领域：ELISA在肿瘤学、感染性疾病诊断、食品安全监测等方面有着重要的应用价值。

4. 总结•斑点酶联免疫吸附试验（ELISA）是一种常见且广泛应用于生物学研究和临床诊断的生物分析技术。

•ELISA通过抗体的高度特异性与目标物质之间的相互作用，结合酶标记技术实现对目标物质的检测和分析。

ELISPOT实验技术

酶联免疫斑点技术介绍一、 ELISPOT技术概述1. 技术原理和技术特点ELISPOT全名为酶联免疫斑点检测，英文：Enzyme-linked Immunospot Assay。

它结合了细胞培养技术与酶联免疫吸附技术（即ELISA技术），能够在单细胞水平检测细胞因子的分泌情况。

其技术原理，一句话概括就是：用抗体捕获培养中的细胞分泌的细胞因子，并以酶联斑点显色的方式将其表现出来（Sedgwick JD 2005）。

该技术检测细胞因子具有三大优点：其一，灵敏度高。

在一百万个阴性细胞中只要有一个分泌细胞因子的阳性细胞即可被检测出来。

这是目前为止，最为灵敏的检测技术，灵敏度比传统的的ELISA方法高2-3个数量级。

其二，单细胞水平，活细胞功能检测。

ELISPOT检测的是单个细胞分泌，而非细胞群体的平均分泌。

在检测的过程中，有活细胞培养与抗原刺激阶段，检测的是活细胞的功能，而非死细胞的遗留物。

其三，操作简便经济，可以进行高筒量筛选。

ELISPOT没有复杂的细胞体外扩增过程，不使用同位素，不需要大型的、专门的实验仪器设备。

按照标准化的实验操作，一个实验者可以同时处理数百个样品，效率远远高于其它检测方法（Kalyuzhny AE 2005）。

实验设计在96孔培养板上进行，直接以培养板的塑料板底或者PVDF膜以及硝酸纤维素膜为基质，包被上特异性的单克隆抗体，用以捕获细胞分泌的细胞因子。

（由于涉及到细胞培养的过程，对单克隆抗体的要求要远高于ELISA中的捕获抗体，该抗体需要无毒，不含内毒素，亲和力高等特点。

）之后，在培养板的孔内加入细胞培养基（现在无血清ELISPOT技术已经成熟，培养基中可以不再含有血清）、待检测的细胞以及抗原刺激物进行培养。

在特异性的抗原或者非特异性的有丝分裂原的刺激下，数小时之内，T细胞就会开始分泌各种细胞因子。

细胞因子当即就被位于细胞下方的膜上的单克隆抗体所捕获。

在洗去细胞之后，被捕获的细胞因子可以与生物素标记的第二抗体结合，然后用酶标亲和素再与生物素结合，进行化学酶联显色，就可以在膜的局部形成一个个圆形的斑点。

酶联免疫斑点试验的原理

酶联免疫斑点试验的原理1. 引言酶联免疫斑点试验（Enzyme-Linked ImmunoSpot Assay，简称ELISPOT）是一种用于检测细胞分泌物的敏感且高通量的免疫学技术。

该技术可以定量检测单个细胞分泌的蛋白质或细胞因子，在免疫学研究、药物开发和临床诊断中具有广泛的应用。

2. 原理概述ELISPOT技术基于酶标记抗体和特异性抗原结合的原理。

它通过将待测细胞与特定抗原刺激后，将细胞分泌物捕获到固相载体上，然后使用酶标记二抗进行检测，最后通过显色反应可视化并计数斑点数量。

该技术具有高灵敏度、高特异性和高通量等优势。

3. 实验步骤步骤一：制备固相载体在ELISPOT实验中，常用的固相载体是多孔膜板或膜片。

首先，在载体表面涂覆特异性抗原或抗体，以便捕获待测细胞分泌的特定蛋白质或细胞因子。

步骤二：孵育待测细胞将待测细胞加入到含有特异性抗原的培养基中，使其与抗原发生特异性反应。

通常，实验者会设置对照组，包括阴性对照组（只有培养基）和阳性对照组（含有已知分泌物的细胞）。

步骤三：洗涤将孵育后的细胞用洗涤缓冲液洗去未结合的细胞和其他杂质。

步骤四：二抗处理加入酶标记的二抗（如辣根过氧化物酶标记的抗IgG），使其与待测细胞分泌物中的特异性蛋白质或细胞因子结合。

步骤五：显色反应加入适当的底物和显色剂，通过酶催化作用产生可见信号。

常用的显色剂是BCIP/NBT，在酶催化下会生成紫色斑点。

步骤六：计数和分析使用显微镜对固相载体进行观察，并使用计算机软件或手工计数斑点数量。

斑点的数量代表了待测细胞分泌物的水平。

4. 原理解析特异性抗原和抗体结合固相载体表面涂覆的特异性抗原或抗体与待测细胞分泌物中的特定蛋白质或细胞因子结合。

这种结合是通过免疫反应中抗原与抗体之间的特异性识别实现的。

酶标记二抗检测酶标记二抗是一种能够与待测细胞分泌物中的特异性蛋白质或细胞因子结合并具有酶活性的二级抗体。

常用的酶标记二抗有辣根过氧化物酶标记的抗IgG。

分子医学技能：酶联免疫斑点(ELISPOT)技术

特点：
❖斑点可持久保存并进行计数分析
❖易操作、有效、快速、灵敏度高
✓ 细胞因子的检测不易受非分泌细胞的干扰 ✓ 比传统的ELISA和细胞内细胞因子染色法敏感20-200倍
❖样本量大的情况下实验结果可用计算机图象分析系统进行快速、客观的分析
❖
基
Coating Ab
本
包被培养孔
原
理
根据实验设计加入淋巴细胞及含或不含刺激因子的培养液
酶联免疫斑点(ELISPOT)技术
❖ELISPOT（Enzyme-linked Immunospot Assay）
▪ 结合了细胞培养技术与酶联免疫吸附技术（即 ELISA技术），能够在单细胞水平检测细胞因子的分泌情况；
▪ 用抗体原位捕获培养中的细胞分泌的细胞因子，并以酶联斑点显色的方式将其表现出来。
❖双色ELISPOT结果示意图
蓝色：IFN-γ,红色：IL-2; 蓝色：IFN-γ,红色：IL-17
❖ ELISPOT
▪ B细胞杂交瘤的筛选 ▪ 化合物和药物免疫学反应的检测 ▪ 优化树突细胞和T细胞的抗肿瘤活性 ▪ 靶向疫苗的质控
方 ▪ 自身免疫疾病的诊断和预后分析法 ▪ 自身免疫疾病免疫治疗的监控主 ▪ 过敏性疾病的脱敏治疗的监测要 ▪ 器官移植中排斥反应的预测用 ▪ 微量组织、肿瘤和免疫细胞分泌谱的分析途 ▪ 结核病的诊断
▪ 显色剂I和II应避光保存，不使用时切勿混合
❖ ELISPOT 实验结果示意图
细胞因子A
双抗体包被
❖双色ELISPOT原理
培养细胞细胞因子B
包被抗体
Biotin-检测抗体
HRP-检测抗体 BCIP/NBT底物
AEC底物

免疫斑点试验的实验报告

免疫斑点试验的实验报告实验目的：本实验旨在通过免疫斑点试验（ELISPOT）评估特定抗原刺激下，免疫细胞分泌特定抗体或细胞因子的能力。

免疫斑点试验是一种常用的细胞免疫反应检测方法，广泛应用于疫苗开发、免疫诊断和免疫治疗研究。

实验原理：免疫斑点试验是基于酶联免疫吸附测定（ELISA）的原理发展而来，通过检测细胞因子或抗体在固相上的沉积形成斑点，从而定量分析免疫细胞的分泌活性。

当免疫细胞被特定抗原激活后，它们会分泌细胞因子或抗体，这些分子可以被特定的捕获抗体固定在固相上，随后通过酶标记的检测抗体和底物显色，形成可见的斑点。

实验材料：1. 96孔多孔板2. 细胞培养基3. 特定抗原4. 捕获抗体5. 酶标记的检测抗体6. 底物溶液7. 细胞计数器8. 免疫细胞（如外周血单核细胞）9. 其他必要的试剂和耗材实验方法：1. 将96孔多孔板预先涂覆捕获抗体，封闭未结合位点。

2. 将免疫细胞以适当浓度接种到多孔板中，并加入特定抗原进行刺激。

3. 细胞培养一定时间，使细胞因子或抗体分泌并固定在固相上。

4. 移除培养上清，用洗涤液清洗多孔板，去除未固定的细胞和抗原。

5. 加入酶标记的检测抗体，孵育后再次洗涤。

6. 加入底物溶液，使酶催化底物产生颜色反应。

7. 颜色反应达到适宜程度后，终止反应，使用ELISPOT分析系统计数斑点。

实验结果：实验结果显示，不同浓度的抗原刺激下，免疫细胞产生的斑点数量有显著差异。

高浓度的抗原能显著提高斑点的数量，表明免疫细胞对抗原的反应性增强。

通过比较实验组和对照组的斑点数量，可以评估免疫细胞的活性和分泌能力。

实验讨论：本实验结果表明，免疫斑点试验是一种灵敏且特异的方法，能够定量分析免疫细胞对特定抗原的反应。

斑点的数量与免疫细胞的活性成正比，可以用来评估免疫应答的强度。

此外，通过优化实验条件，如细胞浓度、抗原浓度和培养时间，可以进一步提高实验的准确性和重复性。

实验结论：免疫斑点试验成功地评估了免疫细胞对特定抗原的反应性，为进一步研究免疫细胞的功能和免疫应答机制提供了可靠的实验数据。

酶联免疫斑点试验在医院护理的作用.docx

酶联免疫斑点试验在医院护理的作用结核病(TB)为呼吸道传染病，早期快速诊断已经成为控制结核病的关键因素［1－3］。

结核潜伏感染(LTBI)是宿主虽已被结核分枝杆菌感染但还未发病的一种亚临床状态，痰涂片阴性和(或)放射检查无阳性征象，细菌成休眠状态，故临床早期诊断该病具有较大难度。

机体免疫力低下时，LTB可发展成为活动性肺结核病或其他脏器的结核病变［4－5］。

本研究将T－SPOT．TB应用于检测护理人员的LTBI现状，目的在于了解护理人员结核分枝杆菌潜伏感染情况以及应用T－SPOT．TB检测LTBI的临床优势，降低护理人员结核病感染概率，避免医院交叉感染的发生。

现报道如下。

1资料与方法1．1临床资料将我院各科室工作超过1年的女性护理人员共计20XX年龄26～44岁，平均(35．1±4．2)岁;上岗年限≥3年121名，＜3年80名。

均身体健康，临床表现及影像学检测均未见活动性肺结核症状。

排除应用免疫抑制剂或增强剂及妊娠女性。

1．2方法(1)仪器及试剂。

采用T－SPOT．TB(UK)检测试剂盒，ESCO二级生物安全柜，5%的CO2细胞培养箱，37℃。

(2)外周血T－SPOT．TB试验。

真空采血管中置入肝素抗凝剂并采集每位受检者5ml的外周静脉血，混合摇匀并于4h内予以外周血单个核细胞(PBMC)分离。

将抗凝全血依据1:1比例与培养液混合，再依据(2～3):1比例将被稀释的血氧渐渐加入至Ficoll淋巴细胞分离液上，18℃下以每分钟1000r离心，连续22min以分离PBMC。

予以离心洗涤并做好相关数据记录，最后将细胞量调整到2．5×106/ml。

取出T－SPOT．TB培养板，将温度调整至室温并做好标识，于每个样本的板条处分别加入50μl的阴性对照AIM－V与阳性对照(PHA)，抗原A与B各50μL。

然后再在4个孔内均加入100μL 细胞悬液，置于37℃5%的CO2细胞培养箱内培养16～20h。

ELISPOT酶联免疫斑点分析

ELISPOT酶联免疫斑点分析ELISPOT 技术简介随着酶联免疫分析技术在医学及生物学领域的广泛应用, 使体外检测各种细胞因子及抗体研究有了新的突破。

在研究免疫应答机制时以往常用用酶联免疫吸附法（ELISA ）检测体液中游离的细胞因子（CK ）或抗体，但由于游离的循环抗体或CK 的半哀期不同，使之在体液中不断的被代谢或与靶器官结合，而不能确切的反映体内的抗体及CK 的水平。

80 年代，国外的科研工作者根据ELISA 技术的基本原理，建立了体外检测特异性抗体分泌细胞和CK 分泌细胞的固相酶联免疫斑点技术（ELISPOT ）。

因其具有较高的特异性和敏感性，目前正被国内外广泛应用，对探索自身免疫系统疾病发病机制具有重要意义。

ELISPOT 法源自ELISA ，又突破传统ELISA 法，是定量ELISA 技术的延伸和新的发展。

两者都是检测细胞产生的细胞因子或其他可溶性蛋白，它们最大的不同在于：•ELISA 通过显色反应，在酶标仪上测定吸光度，与标准曲线比较得出可溶性蛋白总量。

•ELISPOT 也是通过显色反应，在细胞分泌这种可溶性蛋白的相应位置上显现清晰可辨的斑点，可直接在显微镜下人工计数斑点或通过德国AID的ELISPOT 分析系统对斑点进行计数，1 个斑点代表1 个细胞，从而计算出分泌该蛋白的细胞的频率。

（某些研究不仅要测细胞因子生成量，还需检测分泌此细胞因子的细胞频率）•由于是单细胞水平检测，ELISPOT 比ELISA 和有限稀释法等更灵敏，能从20 万-30 万细胞中检出1 个分泌该蛋白的细胞。

•捕获抗体为BD 、R&D 、Mabtech 、Diaclone 生产的高亲和力、高特异性、低内毒素单抗，在研究者以刺激剂激活细胞时，不会影响活化细胞分泌细胞因子。

ELISPOT 检测原理细胞受到刺激后局部产生细胞因子，此细胞因子被特异单克隆抗体捕获。

细胞分解后，被捕获的细胞因子与生物素标记的二抗结合，其后再与碱性磷酸酶标记的亲和素结合。

分子医学技能-免疫：酶联免疫斑点(ELISPOT)技术

非无菌
PBST洗板10次
加入生物素标记的detector Ab
370C孵育1小时后，PBST洗板5次
加入酶标抗生物素抗体(GABA)
370C孵育1小时后，PBST洗板5次
40C暗处混合显色剂I和II, 加入显色剂I/II,
暗处室温孵育20-30分钟
显微镜下观察至斑点形成，去离子水清洗培养板室温干燥后
酶联免疫斑点(ELISPOT)技术
一、ELISPOT检测细胞因子实验技术
❖Байду номын сангаас
基
Coating Ab
本
包被培养孔
并经BSA阻断
原
理
根据实验设计加入淋巴细胞及含或不含刺激因子的培养液
孵育
活化的淋巴细胞可分泌细胞因子与Coating Ab结合
洗除细胞，依次加入生物素标记的抗细胞因子抗体及酶标抗生物素抗体进行反应
106抗原呈递细胞（APC）中混入特定数量的IFN-γ+的T淋巴细胞，经下列方法检测： ▪ ELISPOT ▪ 细胞内细胞因子染色（FACS） ▪ ELISA
X坐标： 106 APC中实际IFN-γ+T细胞数量 Y坐标：各检测方法的检测结果
▪ B细胞杂交瘤的筛选
ELISPOT
▪ 化合物和药物免疫学反应的检测
预先将所检测细胞孵育24-42小时
40C过夜 0.05%PBS-Tween20(PBST)
洗板5次
每孔加入1%BSA阻断
370C孵育1小时
按实验设计加入含或不含刺激剂的培养液及一定数目细胞孵育5-24小时
或者
脾淋巴细胞
单核细胞或
直接取外周血

有关酶联免疫斑点实验（ELISpot）常见疑难问题解答

有关酶联免疫斑点实验（ELISpot）常见疑难问题解答酶联免疫斑点实验 (enzyme linked immunospot assay,ELISpot) 是⼀种在96孔板内的⼀百万个细胞中实现对单个分泌细胞进⾏定量检测的新型的免疫酶技术。

灵敏度⾼，易操作，成本相对流式细胞术较低，已被⼴泛应⽤于癌症研究，疾病探索以及疫苗研发等领域。

ELISpot原理：将细胞置于包被有特异性抗体的96孔板中培养，在有刺激的条件下，细胞分泌的细胞因⼦或免疫球蛋⽩会被包被抗体捕获。

移除细胞后，被捕获的细胞因⼦可进⼀步使⽤⽣物素标记的⼆抗来标识，其后再与酶标记的亲和素作⽤，并加⼊底物使其呈⾊，有反应作⽤的细胞会留下直径⼤⼩不等的染⾊斑点。

1. 加⼊细胞到含有（或不含）刺激物中培养；2. 阳性细胞开始分泌细胞因⼦，细胞因⼦就近被包被抗体捕获；3. 移出细胞，清洗板⼦，加⼊⽣物素标记的检测抗体，形成“抗体-抗原-抗体”夹⼼结构；4. 为了观察膜上斑点的形成，加⼊酶标记的亲和素；5. 加⼊显⾊底物，在酶的催化分解下，⽣成不可溶的⾊素，就近沉淀在局部的膜上形成斑点；6. 斑点计数（可⼈⼯计数，也可⽤⾃动读板仪计数），数据处理，结果分析。

常见疑难问题解答：1.您推荐哪种ELISpot板⼦？我们建议使⽤PVDF膜的96孔ELISpot板⼦，有效结合⼤量捕获抗体，前提是膜⽤⼄醇预处理（即活化）。

2.板的颜⾊是否重要，我应选择⽩⾊板⼦还是透明板⼦？⽩⾊和透明ELISpot板具有相同类型的PVDF膜。

这两种颜⾊在读板仪中略有不同，但并不重要。

（如果有没有添加液体的漏掉的孔，透明的板⼦很容易看见。

）3.包被前为什么要⽤⼄醇对ELISpot板进⾏预处理？ELISpot板⼦的膜具有多孔疏⽔结构。

为了使⼤量捕获抗体能够结合，应该⽤⼄醇处理膜以使其亲⽔。

这是获得⾼质量斑点所必需的致密抗体包被层。

4.如何清洗和清空ELISpot板？可以使⽤多通道移液器⼿动清洗板⼦。

免疫酶斑点试验

应用领域
临床诊断
药物筛选
用于检测感染性疾病、自身免疫性疾病、肿瘤等疾病的相关抗原或抗体，辅助临床诊断和制定治疗方案。
用于筛选和鉴定药物的靶点、研究药物的免疫活性等。
食品安全检测
环境监测
用于检测食品中的病原微生物、毒素等有害物质。
用于检测环境中的有害物质、污染物等，保障环境安全。
02
免疫酶斑点试验的原理与技术
肿瘤
免疫酶斑点试验也可用于肿瘤标志物的检测，如癌胚抗原、甲胎蛋白等，有助于肿瘤的早期发现和监测。
在药物研发中的应用
新药筛选
免疫酶斑点试验可用于筛选和鉴定具有药理活性的小分子化合物，为新药研发提供有力支持。
药物代谢研究
通过免疫酶斑点试验可以研究药物在体内的代谢过程，了解药物在体内的分布、代谢和排泄情况，为药物设计和优化提供依据。
04
免疫酶斑点试验的结果分析
阳性结果的判定
01
02
03
斑点颜色明显
如果斑点颜色深且清晰，与背景形成明显对比，通常被认为是阳性结果。
斑点大小
斑点大小超过一定阈值通常被认为是阳性，具体阈值可能因试验而异。
周围晕圈
在阳性结果中，有时会出现围绕斑点的浅色晕圈，这有助于识别阳性斑点。
阴性结果的判定
药物疗效评估
免疫酶斑点试验可检测药物对靶点的抑制作用，评估药物的疗效和安全性，为临床用药提供参考。
在生物科学研究中的应用
01
蛋白质组学研究
免疫酶斑点试验可用于蛋白质组学研究，检测蛋白质的表达和修饰情况，
了解蛋白质的功能和作用机制。
02
细胞信号转导研究
通过免疫酶斑点试验可以检测细胞内信号转导通路的活性变化，了解细

酶联免疫斑点技术 -回复

酶联免疫斑点技术-回复酶联免疫斑点技术（Enzyme-linked Immunosorbent Assay, ELISA）是一种常用于测定抗原或抗体的高度敏感和特异性的实验方法。

本文将详细介绍ELISA的原理、步骤和应用。

一、ELISA的原理ELISA技术基于抗原与抗体之间的特异性相互作用。

ELISA通常使用多孔板作为试剂的固相载体，先在孔板上固定特定抗原或抗体，再根据需要加入待测样品和检测抗体。

通过特异性抗原-抗体反应的信号产生，可以对待测物进行定量或定性分析。

ELISA有两种基本的原理：直接ELISA和间接ELISA。

1. 直接ELISA：直接ELISA是利用特异性抗体与待测物发生直接的非共价相互作用。

在这种方法中，待测物溶液被加入到已有特异性抗体固定在多孔板上的反应孔中。

如果待测物包含目标抗原，它将与特异性抗体结合，并固定在多孔板上。

然后，加入适量的检测抗体，该抗体被标记有一种酶，例如辣根过氧化物酶（HRP）。

最后，加入合适的底物，当酶与底物反应时，也就是产生了颜色，可以通过酶促反应的信号强度来确定待测物的浓度。

2. 间接ELISA：间接ELISA是通过待测物与特异性抗体结合，然后再加入检测抗体与该复合物结合。

首先，待测物溶液被加入到已有特异性抗体固定在多孔板上的反应孔中。

如果待测物中含有目标抗原，它将与特异性抗体结合并固定在多孔板上。

然后，在充分洗涤去除未结合的物质后，加入标记有检测抗体的二抗。

这些二抗一般与小鼠、兔子等动物蛋白特异性抗体结合，并与待测物-抗体复合物发生特异性反应。

最后，如同直接ELISA，加入适当的底物来检测酶促反应。

以上是ELISA技术的两种基本原理，根据待测物的特性和实验需求，可以选择合适的方法进行分析。

二、ELISA的步骤ELISA方法通常包括固相处理、解离、检测抗体的加入、洗涤、底物发色反应和测定等步骤。

1. 固相处理：将特异性抗体固定在多孔板上。

根据需要，可以使用直接ELISA或间接ELISA的原理选择适合的抗体。

酶联免疫斑点试验流程图

酶联免疫斑点试验流程图英文回答：Enzyme-Linked Immunospot (ELISPOT) Assay Workflow. Materials:ELISPOT plate.Capture antibody.Cell suspension.Antigen or stimuli.Detection antibody.Substrate (e.g., chromogen or enzyme substrate)。

Procedure:1. Plate Coating: Capture antibody is coated onto the ELISPOT plate overnight at 4°C.2. Cell Addition: Cell suspension is added to the coated plate and incubated to allow cells to adhere (e.g., 4-18 hours at 37°C).3. Antigen Stimulation: Antigen or stimuli is added to the wells to activate antigen-specific cells.4. Cell Incubation: Cells are incubated with antigen or stimuli for a specific time (e.g., 16-24 hours) a t 37°C.5. Cell Removal: Cells are washed away, leaving behind spots corresponding to secreted cytokines or other molecules.6. Detection Antibody Addition: Detection antibody specific for the target cytokine or molecule is added and incubated to bind to the spots.7. Substrate Addition: Substrate is added to visualize the bound detection antibody, generating colored spots.8. Spot Counting: Spots are counted using an automated or manual method.Interpretation:The number of spots represents the number of cells that have secreted the target cytokine or molecule in response to the antigen or stimuli. This information can be used to assess cell-mediated immune responses, cytokine production, and immune cell activation.中文回答：酶联免疫斑点试验流程图。