酶联免疫斑点法
酶联免疫斑点技术介绍
酶联免疫斑点技术介绍本页仅作为文档封面，使用时可以删除This document is for reference only-rar21year.March酶联免疫斑点技术介绍一、 ELISPOT技术概述1. 技术原理和技术特点ELISPOT全名为酶联免疫斑点检测，英文：（Enzyme-linked Immunospot Assay）。
它结合了细胞培养技术与酶联免疫吸附技术（即ELISA技术），能够在单细胞水平检测细胞因子的分泌情况。
其技术原理，一句话概括就是：用抗体捕获培养中的细胞分泌的细胞因子，并以酶联斑点显色的方式将其表现出来（Sedgwick JD 2005）。
该技术检测细胞因子具有三大优点：其一，灵敏度高。
在一百万个阴性细胞中只要有一个分泌细胞因子的阳性细胞即可被检测出来。
这是目前为止，最为灵敏的检测技术，灵敏度比传统的的ELISA方法高2-3个数量级。
其二，单细胞水平，活细胞功能检测。
ELISPOT检测的是单个细胞分泌，而非细胞群体的平均分泌。
在检测的过程中，有活细胞培养与抗原刺激阶段，检测的是活细胞的功能，而非死细胞的遗留物。
其三，操作简便经济，可以进行高筒量筛选。
ELISPOT没有复杂的细胞体外扩增过程，不使用同位素，不需要大型的、专门的实验仪器设备。
按照标准化的实验操作，一个实验者可以同时处理数百个样品，效率远远高于其它检测方法（Kalyuzhny AE 2005）。
实验设计在96孔培养板上进行，直接以培养板的塑料板底或者PVDF膜以及硝酸纤维素膜为基质，包被上特异性的单克隆抗体，用以捕获细胞分泌的细胞因子。
（由于涉及到细胞培养的过程，对单克隆抗体的要求要远高于ELISA中的捕获抗体，该抗体需要无毒，不含内毒素，亲和力高等特点。
）之后，在培养板的孔内加入细胞培养基（现在无血清ELISPOT技术已经成熟，培养基中可以不再含有血清）、待检测的细胞以及抗原刺激物进行培养。
在特异性的抗原或者非特异性的有丝分裂原的刺激下，数小时之内，T细胞就会开始分泌各种细胞因子。
酶联免疫斑点试验检测技术(Elispot)在诊断结核性脑膜炎中的应用
提供 ， 脑脊液 Ｔ — Ｎ Ｐ Ｒ） 平 ≥５０ ｃｐｅ／ ｌ 断 为 阳 ＢＤ Ａ（ Ｃ 水 ０ ｏ ｉ ｍ 判 ｓ
性 ， ５ ０ｃｐｅ ｍ 判 断 为 阴 性 。 检 测 结 果 使 用 Ｐｉ ５０软 ＜ ０ ｏｉ ／ ｌ ｓ ｒｍ ． ｓ
件包进行数据统计和统计学分析。两组 间率 的比较采用卡方
特 异 性 ｒ 扰 素 （Ｆ —） 平 可 以 用 于 结 核 分 枝 杆 菌 感 染 的 干 ＩＮ ｒ 水
断为 阳性 ， 抗 原 检 测 结 果 为 阴性 ， 果 判 断 为 阴 性 ； 有 ３种 结 所 脑 膜 脑 炎 病 例 均 常 规 行 脑 脊 液 Ａ Ａ、 脊 液 Ｔ — Ｎ Ｐ Ｒ） Ｄ 脑 Ｂ Ｄ Ａ（ Ｃ
检测 。脑脊 液 Ａ Ａ使 用 酶 标 法 进 行 检 测 ， 据 国 内 同行 Ｄ 根 ２０ ０４年对脑脊 液 Ａ Ａ在结 核性脑 膜脑 炎 中研 究 的标准 Ｊ Ｄ ， 脑脊液 Ａ Ａ１８Ｕ Ｌ判断为 阳性 ， ８Ｕ Ｌ判断为阴性 ； Ｄ ＞ ／ ＜ ／ 脑脊
液 Ｔ —Ｎ Ｂ Ｄ Ａ荧 光 定 量 聚 合 酶 链 反 应 试剂 由达 安 基 因有 限 公 司
选 非 结 核 性 脑 膜 脑 炎 病 例 均 通过 临床 治 疗 转 归 及 实 验室 检 查 最终确诊 。
方 法
所 有 病 例 均抽 取 乙 二 胺 四 乙 酸 （ Ｄ Ａ） 凝 血 ５ｍ ， ＥＴ 抗 ｌ送
实 验 室 行 Ｅｉ ｏ检 测 。检 测 结 果 根 据 斑 点 数 量 设 定 ， 一 反 ｌｐ ｔ ｓ 每
术 在 结 核 性 脑 膜脑 炎 中 的应 用 价 值 。
临 床 资 料
、
果
在 ７ 例 结 核 性 脑 膜 脑 炎 的 诊 断 中 ，ｌｐ ｔ 性 者 ４ ３ Ｅｉ ｏ 阳 ｓ ５
酶联免疫斑点试验
酶联免疫斑点试验
酶联免疫斑点试验（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，简称ELISPOT）是一种高灵敏度的免疫学检测技术，可用于检测单个细胞
的分泌物，如细胞因子、抗体、酶等。
该技术广泛应用于疾病诊断、
药物筛选、疫苗研究等领域。
ELISPOT的原理是利用特定的抗体捕获分泌物，然后使用酶标记的二
抗或底物来检测捕获的分泌物。
具体步骤如下：
1. 准备试板：将多孔板涂上特定的抗体，使其能够捕获分泌物。
2. 细胞处理：将待检测的细胞加入试板中，使其与涂有抗体的孔相互
作用。
3. 洗涤：将试板洗涤，去除未结合的细胞和其他杂质。
4. 二抗标记：加入酶标记的二抗，使其与捕获的分泌物结合。
5. 洗涤：将试板洗涤，去除未结合的二抗和其他杂质。
6. 底物反应：加入底物，使其与酶标记的二抗反应，产生可见的斑点。
ELISPOT的优点是灵敏度高、特异性好、操作简单、结果可靠。
它可
以检测单个细胞的分泌物，因此可以用于研究细胞免疫应答、肿瘤免
疫学、感染病毒的免疫学等领域。
此外，ELISPOT还可以用于药物筛
选和疫苗研究，帮助科学家们开发更有效的药物和疫苗。
ELISPOT的缺点是需要较长的实验时间和较高的成本，同时需要专业
的实验技能和设备。
此外，ELISPOT只能检测单个细胞的分泌物，无
法检测细胞表面分子的表达情况。
总之，ELISPOT是一种重要的免疫学检测技术，具有广泛的应用前景。
随着技术的不断发展，ELISPOT将会在疾病诊断、药物筛选、疫苗研
究等领域发挥越来越重要的作用。
固相酶联免疫斑点技术
固相酶联免疫斑点技术固相酶联免疫斑点技术，听起来是不是有点高大上？它就是个帮助我们检测各种物质的好帮手。
想象一下，你在厨房里做饭，随手把各种调料都放进锅里。
这个技术就像是把你的调料品分类，帮你找出锅里究竟有什么。
很酷吧！不过，咱们今天不聊做饭，而是来聊聊这个小家伙。
固相酶联免疫斑点技术，咱们可以把它简称为ELISAD。
这个名字虽然长得像外星人，但它的原理其实非常简单。
就像你在学校里做的实验，往显微镜底下看看细胞。
它利用了一种叫抗体的东西，专门识别目标物质。
你可以把抗体想象成个非常挑剔的朋友，只有看到自己喜欢的东西才会欢呼雀跃。
哦，对了，这个过程可有趣了，简直就像在举办一场盛大的聚会。
你知道吗，这个技术的关键在于“固相”这个词。
也就是说，它需要把目标物质固定在某个地方。
就像钉子钉在墙上一样，稳稳当当地呆在那里。
这样一来，抗体就能方便地找到它们的“朋友”，然后通过一系列反应，给你展示结果。
简直像是一场寻宝游戏，越找越有趣。
再说说检测的过程。
想象一下，你的朋友们都来了，大家一起来参加这个聚会。
每个人都有自己的名字，抗体的名字就是它们识别的目标。
如果你想知道锅里有多少盐，抗体就像个侦探，带着放大镜一一查看。
检测出来的结果，就像是聚会结束后的成绩单，让你一目了然。
哇，真是个聪明的办法！而且这个技术的应用范围可广了，简直是无所不能。
医学、环境监测、食品安全，哪儿都能看到它的身影。
比如，检测血液里的病原体，确保咱们的身体健康。
这就像是找个医生给你做体检，提前发现问题，早早处理。
谁不想健康长寿呢？想想看，等你老了，还能和孙子孙女一起追逐打闹，那多好啊！说到这里，不得不提一下，固相酶联免疫斑点技术还有个好处，就是操作相对简单。
没那么复杂，就像做个蛋炒饭，火候掌握得当，就能出奇迹。
它不需要太多设备，就像是家里简单的厨具，也能搞定一桌好菜。
快速的反应时间也让它在急诊和研究中倍受青睐。
想想看，当你急需结果时，它能像闪电一样给你答案，真是太贴心了！技术再好也难免有些小缺陷。
研究酶联免疫斑点法检测在涂阴肺结核患者的诊断价值
研究酶联免疫斑点法检测在涂阴肺结核患者的诊断价值目的探讨酶联免疫斑点法（ELISPOT）在涂阴肺结核患者中的诊断价值。
方法将2016年5月～2017年3月期间我院收治的346例肺结核患者，其中A 组涂阴肺结核患者（180例）、B组为非涂阴肺结核患者（166例），两组均采用ELISPOT检测肺泡灌洗液、外周血液中分泌的结核抗原特异性干扰素的T淋巴细胞水平，之后绘制出两组患者的工作特征曲线（ROC），并计算出曲线下的面积；将A组肺泡灌洗液做结核分枝杆菌核酸扩增荧光检测、涂片抗酸染色、培养分枝杆菌，比较诊断价值与阳性率。
结果A组、B组患者的血液ELISPOT 检测的特异性分别为84.44%（152/180）与90.96%（151/166）；肺泡灌洗液ELISPOT 检测的特异性分别为92.78%（167/180）与94.58%（157/166）（P>0.05）；A组、B组患者的肺泡灌洗液ELISPOT检测的ROC曲线下面积分别为0.938与0.869，差异有统计学意义（P＜0.05）；涂阴肺结核的肺泡灌洗液ELISPOT 检测的阳性率为91.67%（165/180），而结核分枝杆菌核酸扩增荧光检测、涂片抗酸染色、培养分枝杆菌的阳性率分别为34.44%（62/180）、15.56%（28/180）、31.67%（57/180）（P＜0.05）。
结论在涂阴肺结核患者的临床诊断中，应用ELISPOT 检测肺泡灌洗液中分泌的结核抗原特异性干扰素的T淋巴细胞水平，检测效率高、敏感性与特异性强，可作为涂阴肺结核的诊断方法予以推广。
[Abstract] Objective To discuss the value of ELISPOT in Diagnosis of Smear negative pulmonary tuberculosis. Methods 346 cases with TB from May 1 2016 to March 2017 year in our hospital were selected as objects.The group A was smear negative pulmonary tuberculosis patients （180 cases），and the group B was non smear negative pulmonary tuberculosis patients （166 cases）.Bronchoalveolar lavage fluid and peripheral blood IFN-y T levels of two groups were detected by ELISPOT.The curve of the two groups （ROC）was drew，and AUC was calculated.Mycobacterium tuberculosis nucleic acid amplification fluorescence detection，Smear fast stain，and mycobacteria culture in bronchoalveolar lavage fluid of group A were done.Diagnostic value and positive rate were compared. Results Specificities of ELISPOT for blood in group A and group B were 84.44%（152/180）and 90.96%（151/166）；Specificities of ELISPOT for bronchoalveolar lavage fluid in group A and group B were 92.78%（167/180）and 94.58%（157/166）（P>0.05）.AUC of ELISPOT for bronchoalveolar lavage fluid in group A and group B were 0.938與0.869 （P＜0.05）；The positive rate of ELISPOT for bronchoalveolar lavage fluid in smear negative pulmonary tuberculosis was 91.67%（165/180），and the positive rate of Mycobacterium tuberculosis nucleic acid amplification fluorescence detection，Smear fast stain，and mycobacteria culture were 34.44%（62/180），15.56%（28/180），31.67%（57/180）（P＜0.05）. Conclusion In the clinical diagnosis of smear negative pulmonary tuberculosis patients，application of ELISPOT detection of IFN-y T levels in bronchoalveolar lavage fluid is of high detection efficiency，and high sensitivity and specificity，which can be used as a method for diagnosis of smear negative pulmonary tuberculosis to be promoted.[Key words] Smear negative pulmonary tuberculosis；Enzyme-linked immunosorbent assay；Bronchoalveolar lavage fluid；Diagnostic value我院应用该技术来检测肺泡灌洗液中分泌的结核抗原特异性干扰素的T淋巴细胞水平，并与其它检测方法进行了比较，旨在探讨ELISPOT在涂阴肺结核患者中的诊断价值，现报道如下。
酶联免疫斑点法的操作方法
酶联免疫斑点法的操作方法酶联免疫斑点法是一种广泛应用于免疫学和生物化学领域的分析技术，用于检测和定量分析抗原-抗体相互作用。
下面将详细介绍酶联免疫斑点法的操作方法。
一、实验材料与试剂准备1. 试剂- 抗原：根据实验需要准备相应的抗原。
- 抗体：根据实验需要选择合适的抗体，可以是多克隆抗体也可以是单克隆抗体。
- 酶标记的二抗：选择适当的酶标记二抗，如HRP、碱性磷酸酶等。
- 底物：根据所选择的酶标记物选择相应的底物。
- 缓冲液：根据实验需要选择相应的缓冲液，如PBS、TBST等。
- 洗涤液：常用的洗涤液为PBS或TBST。
- 显色底物：根据所选择的酶标记物选择相应的显色底物，如TMB、BCIP/NBT 等。
2. 实验仪器- 酶标仪：用于测定底物酶解的吸光度或荧光值。
- 扫描仪：用于获得斑点形成的图像。
二、实验步骤1. 制备实验板- 选择合适的固相载体，如微孔板、膜、条或片等。
- 洗涤载体：根据选择的载体类型使用洗涤液充分洗涤载体，通常为3-4次洗涤。
- 固定抗原：将抗原溶液加入载体孔中，进行固定，通常需要孵育一段时间，如1-2小时。
- 停止固定反应：洗涤载体，用洗涤液洗涤3-4次。
2. 孔位的处理- 阻断孔位：加入阻断液阻断非特异性吸附，如BSA、Bovine serum albumin 等。
- 洗涤液洗涤孔位：用洗涤液洗涤3-4次。
3. 添加抗体和酶标记二抗- 加入抗体：添加适当稀释的抗体溶液到孔位中，孵育一段适当的时间，如1-2小时。
- 洗涤液洗涤孔位：用洗涤液洗涤孔位，洗涤3-4次。
- 加入酶标记二抗：添加适当稀释的酶标记二抗溶液到孔位中，孵育适当的时间，如1-2小时。
- 洗涤液洗涤孔位：用洗涤液洗涤孔位3-4次。
4. 显色和停止反应- 加入显色底物：加入适当的显色底物，添加适当的底物溶液，使酶解产生可见的色斑或显色反应。
- 停止反应：根据所使用的显色底物的不同，选择适当的反应停止液。
5. 结果读取与分析- 读取结果：将实验板放入酶标仪测定吸光度或荧光值，记录下各孔位的数值。
酶联免疫斑点技术
酶联免疫斑点技术摘要:介绍了酶联免疫斑点技术(ELISPOT)的发展历程，检测原理及应用方面的相关内容。
关键词：酶联免疫斑点技术；免疫检测技术随着酶免疫分析技术在医学及生物学领域的广泛应用, 使体外检测各种细胞因子和抗体研究有了新的突破。
在研究免疫应答机制时, 以往人们常用酶联免疫吸附试验(ELISA) 检测体液中游离的细胞因子(CK) 或抗体, 但由于游离的循环抗体或CK 半衰期不同, 使之在体液中不断地被代谢或与靶器官结合, 而不能确切地反应体内抗体及CK 水平。
80 年代中期, Sedgw ick、Ho lt 和Czerk in sky 等根据ELISA 技术的基本原理, 建立了体外检测特异性抗体分泌细胞和CK 分泌细胞的固相酶联免疫斑点(ELISPOT) 技术, 因其具有较高的特异性和敏感性, 目前正被国内外广泛应用, 对探索自身免疫系统疾病发病机制具有重要意义。
1.ELISPOT技术的发展史1.1溶血空斑技术.80 年代初用于检测抗体形成细胞, 是对细胞免疫学的重要方法学贡献, 可从单细胞水平研究抗体的产生。
但该方法不够灵敏。
另外, 许多抗原决定簇与红细胞表面耦联困难, 使该方法应用受到限制。
1.2细胞ELISA.以酶标记物取代放射标记定量细胞表面分子, 因微量板内有细胞的存在将会产生较高背景。
另外, 细胞需固定于平板上, 也会引起非特异性结合, 产生假阳性结果。
固定还会引起一些细胞表面抗原的破坏而影响检测的敏感性。
1.3ELISPOT.由于上述原因, 1983 年两个研究小组分别在瑞典和奥地利同时报道了另一抗体分泌细胞的检测技术, 即ELISPOT。
1988 年, 首次用该方法检测CK IFN-γ分泌细胞, 目前已多用此方法检测CK, 其技术方法亦在逐步更新。
多年来作者实验室已用该方法检测重症肌无力及多发性硬化患者外周血的CK 分泌细胞, 共计数百例, 并发表论著数篇, 总结了一些方法学方面的经验。
酶联免疫斑点试验流程图
酶联免疫斑点试验流程图英文回答：Enzyme-Linked Immunospot (ELISPOT) Assay Workflow. Materials:ELISPOT plate.Capture antibody.Cell suspension.Antigen or stimuli.Detection antibody.Substrate (e.g., chromogen or enzyme substrate)。
Procedure:1. Plate Coating: Capture antibody is coated onto the ELISPOT plate overnight at 4°C.2. Cell Addition: Cell suspension is added to the coated plate and incubated to allow cells to adhere (e.g., 4-18 hours at 37°C).3. Antigen Stimulation: Antigen or stimuli is added to the wells to activate antigen-specific cells.4. Cell Incubation: Cells are incubated with antigen or stimuli for a specific time (e.g., 16-24 hours) a t 37°C.5. Cell Removal: Cells are washed away, leaving behind spots corresponding to secreted cytokines or other molecules.6. Detection Antibody Addition: Detection antibody specific for the target cytokine or molecule is added and incubated to bind to the spots.7. Substrate Addition: Substrate is added to visualize the bound detection antibody, generating colored spots.8. Spot Counting: Spots are counted using an automated or manual method.Interpretation:The number of spots represents the number of cells that have secreted the target cytokine or molecule in response to the antigen or stimuli. This information can be used to assess cell-mediated immune responses, cytokine production, and immune cell activation.中文回答：酶联免疫斑点试验流程图。
酶联免疫斑点检测技术对结核性脑膜炎的诊断分析
酶联免疫斑点检测技术对结核性脑膜炎的诊断分析一、酶联免疫斑点检测技术简介酶联免疫斑点检测技术是一种用于检测蛋白质激活的新型生物物理化学技术，该技术利用酶标记的抗体与细胞分泌的干扰素γ（IFN-γ）结合，通过酶作用将显色底物作用聚积在细胞分泌的蛋白质的位置，形成斑点。
通过计数斑点的数量，可以间接反映出细胞分泌的干扰素γ的水平，从而分析细胞免疫功能。
酶联免疫斑点检测技术具有灵敏度高、准确性好、操作简单快捷等优点，已被广泛应用于病毒性感染、肿瘤免疫治疗、自身免疫性疾病等领域。
二、酶联免疫斑点检测技术在结核性脑膜炎诊断中的应用1. IFN-γ的检测IFN-γ是由T细胞和自然杀伤细胞分泌的一种细胞因子，其在机体的抗结核感染和免疫过程中起着非常重要的作用。
结核分枝杆菌感染后，机体会产生大量的IFN-γ，通过检测IFN-γ水平可以判断机体是否感染结核分枝杆菌。
酶联免疫斑点检测技术正是通过检测IFN-γ水平来诊断结核病的一种重要方法。
应用该技术，可以在脑脊液中检测到IFN-γ水平的变化，从而辅助结核性脑膜炎的诊断。
2. 结核分枝杆菌特异性抗原的检测酶联免疫斑点检测技术可以利用结核分枝杆菌特异性抗原来刺激患者的T细胞，进而检测其分泌的IFN-γ水平。
该方法的优势在于可以用特异性的抗原刺激T细胞，从而提高检测的特异性。
结核分枝杆菌特异性抗原包括早期分泌抗原（ESAT-6、Cfp10）和Ag85等，这些抗原可以刺激机体产生特异性的免疫应答，因此可以作为诊断结核性脑膜炎的生物标志物。
三、酶联免疫斑点检测技术的挑战与展望尽管酶联免疫斑点检测技术在结核性脑膜炎诊断中表现出了良好的应用前景，但仍然面临着一些挑战。
酶联免疫斑点检测技术在操作上需要高度的专业技能，对实验人员的要求较高。
目前酶联免疫斑点检测技术的商业化产品尚未完善，需要更多的临床验证和实际应用。
结核分枝杆菌的种类和亚型繁多，不同地区和不同个体对结核分枝杆菌的免疫应答也存在差异，因此需要针对性地选择合适的抗原进行检测，从而提高诊断的特异性和准确性。
酶联免疫斑点技术 -回复
酶联免疫斑点技术-回复酶联免疫斑点技术（Enzyme-linked Immunosorbent Assay, ELISA）是一种常用于测定抗原或抗体的高度敏感和特异性的实验方法。
本文将详细介绍ELISA的原理、步骤和应用。
一、ELISA的原理ELISA技术基于抗原与抗体之间的特异性相互作用。
ELISA通常使用多孔板作为试剂的固相载体，先在孔板上固定特定抗原或抗体，再根据需要加入待测样品和检测抗体。
通过特异性抗原-抗体反应的信号产生，可以对待测物进行定量或定性分析。
ELISA有两种基本的原理：直接ELISA和间接ELISA。
1. 直接ELISA：直接ELISA是利用特异性抗体与待测物发生直接的非共价相互作用。
在这种方法中，待测物溶液被加入到已有特异性抗体固定在多孔板上的反应孔中。
如果待测物包含目标抗原，它将与特异性抗体结合，并固定在多孔板上。
然后，加入适量的检测抗体，该抗体被标记有一种酶，例如辣根过氧化物酶（HRP）。
最后，加入合适的底物，当酶与底物反应时，也就是产生了颜色，可以通过酶促反应的信号强度来确定待测物的浓度。
2. 间接ELISA：间接ELISA是通过待测物与特异性抗体结合，然后再加入检测抗体与该复合物结合。
首先，待测物溶液被加入到已有特异性抗体固定在多孔板上的反应孔中。
如果待测物中含有目标抗原，它将与特异性抗体结合并固定在多孔板上。
然后，在充分洗涤去除未结合的物质后，加入标记有检测抗体的二抗。
这些二抗一般与小鼠、兔子等动物蛋白特异性抗体结合，并与待测物-抗体复合物发生特异性反应。
最后，如同直接ELISA，加入适当的底物来检测酶促反应。
以上是ELISA技术的两种基本原理，根据待测物的特性和实验需求，可以选择合适的方法进行分析。
二、ELISA的步骤ELISA方法通常包括固相处理、解离、检测抗体的加入、洗涤、底物发色反应和测定等步骤。
1. 固相处理：将特异性抗体固定在多孔板上。
根据需要，可以使用直接ELISA或间接ELISA的原理选择适合的抗体。
斑点酶联免疫吸附试验原理
斑点酶联免疫吸附试验原理斑点酶联免疫吸附试验（ELISA）：从表面到内部的探索1. 什么是斑点酶联免疫吸附试验？•斑点酶联免疫吸附试验（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，简称ELISA）是一种常用于检测肿瘤抗原、感染性疾病、药物残留等的生物学分析技术。
•ELISA利用酶标记抗体与待测物相互作用，并通过最终的酶反应产生可见的颜色变化，从而定量或定性分析目标物质的存在和浓度。
2. ELISA的原理与步骤原理概述•ELISA利用了抗体与抗原之间的高度特异性反应，实现对目标物质的检测。
•一般的ELISA试验分为直接ELISA、间接ELISA、间接竞争ELISA 和竞争ELISA四种常见形式。
步骤详解1.试样处理与包被：待测样品中的目标物质与特异性抗体结合，形成目标物-抗体复合物。
2.洗涤：将未结合的其他物质洗去，保证后续反应的准确性。
3.二抗添加：加入与目标物-抗体复合物反应的次级抗体，次级抗体通常与酶分子偶联。
4.洗涤：去除未结合的次级抗体，减少背景干扰。
5.底物添加：加入酶底物，与酶发生反应后会呈现可见的颜色变化。
6.反应停止：通过添加反应停止剂停止酶反应，停止颜色的发展过程。
7.读数与结果分析：使用光谱仪或光密度计读取样品的吸光度或荧光强度，并根据标准曲线计算待测样品中目标物质的浓度或定性判断。
3. ELISA的优势和应用领域•高灵敏度和特异性：ELISA可以检测目标物质的微量浓度，并在复杂样品中准确鉴定。
•定量和定性分析：根据标准曲线，ELISA可以定量测定待测样品中目标物质的浓度，也可用于定性判断目标物质的存在与否。
•广泛应用于医学、农业和生物科学等领域：ELISA在肿瘤学、感染性疾病诊断、食品安全监测等方面有着重要的应用价值。
4. 总结•斑点酶联免疫吸附试验（ELISA）是一种常见且广泛应用于生物学研究和临床诊断的生物分析技术。
•ELISA通过抗体的高度特异性与目标物质之间的相互作用，结合酶标记技术实现对目标物质的检测和分析。
ELISPOT技术简介及实验步骤
PBMC
存活率≥90%
存活率≥80%
存活率≤70%
培 养
负对照，无刺激物
Lympho-Spot™ Primate 无血清培养基
基
种
类
4 SFC 无刺激物；
1244 SFC CEF刺激
负对照，无刺激物 10%进口胎牛血清
400,000 Hu-PBMC Lympho-Spot™ Vs FBS
400,000 Hu-PBMC Lympho-Spot™无血清培养基
Table :
Real Plate
Number of Counts / Table
Table Number :
3
24/11/2003
50
Average Values
Cummulated values
Experiment Well
Spots/Well
Opt. Density * Area
area **
Coat with antibodies
ELISPOT原理
Wash and add enzyme-labeled streptavidin
Add cytokine secreting T cells
Wash and add biotinylated antibodies
biotin
Wash and add substrate to allow spot formation
100
150
200
ELISPOT单孔量化分析
光密度与细胞因子相对量化分析
BioSys GmbH
每孔斑点数目与每孔TOD值的比 较
Karben
JK
File :
tang
分子医学技能：酶联免疫斑点(ELISPOT)技术
特点：
❖斑点可持久保存并进行计数分析
❖易操作、有效、快速、灵敏度高
✓ 细胞因子的检测不易受非分泌细胞的干扰 ✓ 比传统的ELISA和细胞内细胞因子染色法敏感20-200倍
❖样本量大的情况下实验结果可用计算机图象分 析系统进行快速、客观的分析
❖
基
Coating Ab
本
包被培养孔
原
理
根据实验设 计加入淋巴 细胞及含或 不含刺激因 子的培养液
酶联免疫斑点(ELISPOT)技术
❖ELISPOT（Enzyme-linked Immunospot Assay）
▪ 结合了细胞培养技术与酶联免疫吸附技术（即 ELISA技术），能够在单细胞水平检测细胞因子 的分泌情况；
▪ 用抗体原位捕获培养中的细胞分泌的细胞因子， 并以酶联斑点显色的方式将其表现出来。
❖双色ELISPOT结果示意图
蓝色：IFN-γ,红色：IL-2; 蓝色：IFN-γ,红色：IL-17
❖ ELISPOT
▪ B细胞杂交瘤的筛选 ▪ 化合物和药物免疫学反应的检测 ▪ 优化树突细胞和T细胞的抗肿瘤活性 ▪ 靶向疫苗的质控
方 ▪ 自身免疫疾病的诊断和预后分析 法 ▪ 自身免疫疾病免疫治疗的监控 主 ▪ 过敏性疾病的脱敏治疗的监测 要 ▪ 器官移植中排斥反应的预测 用 ▪ 微量组织、肿瘤和免疫细胞分泌谱的分析 途 ▪ 结核病的诊断
▪ 显色剂I和II应避光保存，不使用时切勿混合
❖ ELISPOT 实 验 结 果 示 意 图
细胞因子A
双抗体包被
❖双色ELISPOT原理
培养细胞 细胞因子B
包被抗体
Biotin-检测抗体
HRP-检测抗体 BCIP/NBT底物
AEC底物
免疫斑点法原理
免疫斑点法原理
免疫斑点法（Elispot）是一种用于检测细胞分泌的免疫因子的技术。
其基本原理是利用酶联免疫斑点（ELISPOT）技术，将特异性抗体包被在培养孔底部，然后加入细胞及刺激物培养，阳性细胞开始分泌细胞因子，细胞因子就近被包被抗体捕获。
移出细胞后，板底留下自胞因子的潜在“影像”。
加入酶标记的检测抗体，检测抗体和“影像”上的细胞因子结合，形成“抗体-抗原-抗体”夹心结构。
再加入显色底物，在酶的催化分解下，生成不可溶的色素，就近沉淀在局部的膜上形成斑点。
最后通过斑点计数和数据处理，对结果进行分析。
以上信息仅供参考，如有需要，建议查阅相关文献或咨询专业医生。
简述酶免疫技术的分类
酶免疫技术：分类及应用
酶免疫技术是许多生化分析和医学诊断中重要的一种工具。
它基于抗原与抗体间的特异性反应，将酶标记的抗体或抗原作为探针，通过检测其酶反应产物来检测并定量目标分子。
酶免疫技术种类繁多，主要分为以下几类：
1.酶联免疫吸附测定法(ELISA)
这是一种常用于诊断感染性疾病、肿瘤和免疫相关疾病的方法。
它利用酶标记的抗体或抗原作为探针，检测血清、尿液、唾液等生物样品中的分子。
ELISA可以快速、准确地检测出细菌和病毒感染的抗体和抗原，是一种常见的诊断方法。
2.免疫斑点法
由于其简单和方便的特点，这种技术常用于检测微透镜膜穴、肺结核和疱疹病毒的感染。
免疫斑点法也可用于检测各种细胞因子，如白细胞介素（IL）-2、干扰素（IFN）-γ等。
3.免疫层析技术
免疫层析技术也称为免疫固相卡，利用固相化学材料吸附抗体或抗原，将它们与待测分子结合，从而完成检测。
该技术可以快速完成检测，广泛用于检测激素、蛋白质等分子结构查询。
4.F快速诊断技术
该技术可用于基于解离测试的负压移位检测，可检测多种微生物、各种传染病以及不同种类的癌症。
快速诊断技术可以快速、准确地检测出更多感染疾病的标记分子，是一种非常灵敏的定量技术。
酶免疫技术已经广泛应用于医学诊断、药物开发和基因工程。
通过不同的酶免疫技术，可以检测、分析和探索多种分子的生物学特性，有助于促进科学研究和临床医学的进步和发展。
ELISPOT酶联免疫斑点分析
ELISPOT酶联免疫斑点分析ELISPOT 技术简介随着酶联免疫分析技术在医学及生物学领域的广泛应用, 使体外检测各种细胞因子及抗体研究有了新的突破。
在研究免疫应答机制时以往常用用酶联免疫吸附法（ELISA ）检测体液中游离的细胞因子（CK ）或抗体，但由于游离的循环抗体或CK 的半哀期不同，使之在体液中不断的被代谢或与靶器官结合，而不能确切的反映体内的抗体及CK 的水平。
80 年代，国外的科研工作者根据ELISA 技术的基本原理，建立了体外检测特异性抗体分泌细胞和CK 分泌细胞的固相酶联免疫斑点技术（ELISPOT ）。
因其具有较高的特异性和敏感性，目前正被国内外广泛应用，对探索自身免疫系统疾病发病机制具有重要意义。
ELISPOT 法源自ELISA ，又突破传统ELISA 法，是定量ELISA 技术的延伸和新的发展。
两者都是检测细胞产生的细胞因子或其他可溶性蛋白，它们最大的不同在于：•ELISA 通过显色反应，在酶标仪上测定吸光度，与标准曲线比较得出可溶性蛋白总量。
•ELISPOT 也是通过显色反应，在细胞分泌这种可溶性蛋白的相应位置上显现清晰可辨的斑点，可直接在显微镜下人工计数斑点或通过德国AID的ELISPOT 分析系统对斑点进行计数，1 个斑点代表1 个细胞，从而计算出分泌该蛋白的细胞的频率。
（某些研究不仅要测细胞因子生成量，还需检测分泌此细胞因子的细胞频率）•由于是单细胞水平检测，ELISPOT 比ELISA 和有限稀释法等更灵敏，能从20 万-30 万细胞中检出1 个分泌该蛋白的细胞。
•捕获抗体为BD 、R&D 、Mabtech 、Diaclone 生产的高亲和力、高特异性、低内毒素单抗，在研究者以刺激剂激活细胞时，不会影响活化细胞分泌细胞因子。
ELISPOT 检测原理细胞受到刺激后局部产生细胞因子，此细胞因子被特异单克隆抗体捕获。
细胞分解后，被捕获的细胞因子与生物素标记的二抗结合，其后再与碱性磷酸酶标记的亲和素结合。
分子医学技能-免疫：酶联免疫斑点(ELISPOT)技术
非无菌
PBST洗板10次
加入生物素标记 的detector Ab
370C孵育1小时后，PBST洗板5次
加入酶标抗生物素抗体(GABA)
370C孵育1小时后，PBST洗板5次
40C暗处混合显色剂I和II, 加入显色剂I/II,
暗处室温孵育20-30分钟
显微镜下观察至斑点形成， 去离子水清洗培养板 室温干燥后
酶联免疫斑点(ELISPOT)技术
一、ELISPOT检测细胞因子实验技术
❖Байду номын сангаас
基
Coating Ab
本
包被培养孔
并经BSA阻断
原
理
根据实验设 计加入淋巴 细胞及含或 不含刺激因 子的培养液
孵育
活化的淋巴细胞可分泌细胞 因子与Coating Ab结合
洗除细胞，依次加入生物素 标记的抗细胞因子抗体及酶 标抗生物素抗体进行反应
106抗原呈递细胞（APC）中混入特定数 量的IFN-γ+的T淋巴细胞 ，经下列方 法检测： ▪ ELISPOT ▪ 细胞内细胞因子染色（FACS） ▪ ELISA
X坐标： 106 APC中实际IFN-γ+T细胞数量 Y坐标： 各检测方法的检测结果
▪ B细胞杂交瘤的筛选
ELISPOT
▪ 化合物和药物免疫学反应的检测
预先将所检测细胞 孵育24-42小时
40C过夜 0.05%PBS-Tween20(PBST)
洗板5次
每孔加入1%BSA阻断
370C孵育1小时
按实验设计 加入含或不含刺激剂的培养液 及一定数目细胞孵育5-24小时
或者
脾 淋 巴 细 胞
单 核 细 胞 或
直 接 取 外 周 血
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酶联免疫斑点法
酶联免疫斑点法（Enzyme-linked immunospot assay, ELISPOT）是一种用于检测单个细胞分泌物（包括细胞因子、抗体和其他蛋白质）的方法。
该技术将单个细胞和特异性抗体共同培养于多孔的固体基质上，当特异性抗体捕获了细胞分泌物时，就会形成一个“免疫斑点”，而该斑点会通过化学反应显示出来，从而可进行定量分析。
该技术的优点一是提高了灵敏度和特异性，促进了单个细胞分泌物的检测能力。
二是实验条件较容易控制，能够极大地减少误差。
另外，与其他技术相比，ELISPOT技术具有较高的自动化水平和适应性。
同时，该技术可用于评估和比较不同治疗方案或疫苗的效果、评估细胞免疫反应、疾病诊断和监测、评估药物毒性和进行基础研究。
在实验中，ELISPOT可分为两个阶段。
第一阶段是细胞培养，即将感兴趣的细胞和特定的刺激物共同培养。
第二阶段是免疫斑点检测，即将细胞移到多孔的固体基质上，添加特异性抗体进行反应，以发现并定量斑点。
常用的免疫斑点计数仪可以通过电子显微镜对固定、染色的免疫斑点进行准确计数，从而获得准确的结果。
通过该技术，研究人员可以研究细胞免疫和疫苗的作用机制，及早发现传染病或肿瘤的预警信号，以促进更好的预防和治疗。
此外，酶联免疫斑点法也适用于儿童疫苗接种后对疫情的监测和跟踪，以及老年人免疫力的评估。
需要指出的是，这种技术并不能够直接用于临床检测，仅在研究领域发挥作用。
一些商业实验室已经开始使用该技术进行疫苗测试和特定蛋白质的检测，在检测和诊断方面具有很大的潜力。
总之，酶联免疫斑点法是一种基于细胞分泌物检测的技术手段，在生物医学研究、药物开发以及疾病预防和治疗等方面具有较为重要的应用价值。