VEGF的RNAi对卵巢癌细胞SKOV3生物学活性的影响

赖晓红:广州市番禺区南村医院　广东广州　511442翁光华:中南大学湘雅医学院实验医学中心　湖南长沙　410078VEGF 的RNA i 对卵巢癌细胞SK OV3生物学活性的影响赖晓红　翁光华THE AFFECT O F RNA IO F VEGF ON THE B I O LO G I C AL ACTI V I TY O F SK OV3IN OVARY CARC INOM A CELLSLA I X iaohong,W EN G Guanghua 【摘　要】　目的　检测靶向血管内皮生长因子(VEGF )的短发夹RNA (shRNA )质粒载体对卵巢癌细胞株SK OV3生物学活性的影响作用。

方法　构建携带有GFP 报告基因的VEGF -shRNA 质粒载体,脂质体转染方法转入卵巢癌细胞株SK OV3,通过流式细胞术检测细胞的转染效率,RT -PCR 及W estern bl ot 检测转染细胞内VEGF -mRNA 及蛋白的表达变化,MTT 法检测细胞增殖抑制率,人工基底膜侵袭实验检测细胞侵袭能力。

结果　VEGF -ShRNA 稳定转染后,SK OV3细胞内VEGF -mRNA 及蛋白表达水平显著下降;VEGF -ShRNA 对SK OV3细胞具有明显的增殖抑制作用,其抑增殖效应呈时间依赖性;VEGF -CshRNA 组可有效抑制SK OV3细胞的人工基底膜体外侵袭能力。

结论　VEGF 在卵巢癌增殖、侵袭转移中发挥重要作用,通过RNA 干扰技术实现VEGF 沉默在卵巢癌的生物治疗中具有较好的应用前景。

【关键词】　血管内皮生长因子　卵巢癌　短发夹RNA do i:10.3969/j .issn .1671-332X .2009.01.012 肿瘤血行转移主要通过肿瘤性血管形成和淋巴循环系统两种途径介导。

血管内皮生长因子(Vascular endothelial gr owth fact or,VEGF )家族是调节肿瘤脉管新生形成最主要的一组因子[1],具有调节血管及淋巴管的生理功能。

笔者通过构建靶向VEGF 的短发夹RNA (short hair p in RNA,shR 2NA )质粒载体,观察其对卵巢癌细胞增殖及侵袭转移等生物学活性,探讨靶向VEGF 的RNA 干扰(RNA interference,RNA i )应用于卵巢癌基因治疗的可行性。

1　材料与方法1.1　材料　人卵巢癌细胞株SK OV3购自中科院生物细胞研究所;携带GFP 的真核表达质粒pRNAT -H1.1/Neo;脂质体转染试剂TransFast (t m )Transfecti on reagent 、反转录试剂盒和MTT;Trans well 小室,抗VEGF 多克隆抗体、HRP 标记的二抗、EC L W estern B l ot 试剂盒。

1.2　VEGF -shRNA 表达载体的构建　根据si RNA 设计原则并通过Conix B i oscience 软件分析筛选出有效的RNA i 作用靶点,另设计一条阴性对照的寡核苷酸。

序列如下:VEGF -si RNA:5’-CTT ATT ACCGTC 2C ATCT CT CACAA GG AGT ACTGCTTGTG AG AG AGGCACTG 2T AATTT AT -3,3’-GT AG AAAAATT A C AGTGCCTCCCTC A 2C AAGCTGT ACT CCT TG TG AG AG AGGCACTGT AA -5’;con 2tr ol si RNA:5’-TCCAT AAGTC ACTT AATGGTCGTTTT CAA 2G AG AAACG ACC ATT AACGTG ACTG ATTTTT -3’,3’-AGTC AGTG AATT ACCAGCAAAAGTTCT CT C TGCTGGT ACT 2TGCACTG AGT AAAC AG AT C -5’。

将编码shRNA 的两条寡核苷酸进行退火,用Ba mH I 和H ind III 酶双酶切后插入到载体相应的酶切位点处,T4连接酶连接,再转化至感受态大肠杆菌中,质粒抽提经酶切电泳及测序验证。

1.3　细胞转染　调整指数增殖期的SK OV3细胞浓度为4×106/m l,待细胞达到75%融合时,按照试剂盒说明将VEGF -shRNA 质粒载体转染细胞内,同时设立空白组、空载体组和阴性shRNA 载体组。

转染24h 后进行G418筛选,G418根据预实验结果设为600μg/m l,培养4w 获得稳定转染VEGF -shRNA 的SK OV3阳性细胞。

倒置显微镜观察细胞内GFP 表达,并用流式细胞仪检测转染效率。

1.4　RT -PCR 检测转染SK OV3细胞中VEGF -mRNA 表达取稳定转染的SK OV3细胞106,Trizol 试剂抽提细胞总RNA,RT 反应逆转录成c DNA,以看家基因β-actin 为内参照作PCR 反应,同一体系中同时加入VEGF -C 基因和β-actin 基因引物,反应体系为H 2O 1711μl,d NTP 5μl,gene p ri m er F /R 015/015μl,buffer 110μl,M gCl 21175μl,Taq 酶0115μl,temp late 210μl,t otal 25μl 。

反应条件为94℃1m in,94℃45s +55℃45s +72℃45s 共35cycles,72℃10m in 。

VEGF 基因和β-actin 基因引物由北京亚大公司合成。

1.5　W estern bl ot 检测转染SK OV3细胞中VEGF 蛋白表达收集稳定转染的SK OV3细胞,加入细胞裂解液,经超声、蛋白定量后,取30μg蛋白质于P AGE-S DS电泳分离后,电转印于P VDF膜上,5%m ilk封闭,一抗为1∶1000稀释兔抗人anti-VEGF多克隆抗体,二抗为HRP标记的羊抗兔多克隆抗体,EC L法显影,底片置于V ilber Lour mat图像分析仪中进行处理、摄片记录。

1.6　MTT法检测细胞增殖抑制率以每孔105个SK OV3细胞接种于96孔板,培养24h,换成无血清的DME M继续培养24h,使细胞静止于G0/G1期, shRNA转染终浓度为011μmol/L,培养72h后,再加入浓度为5mg/m l的MTT液10μl,继续培养4h,弃上清,用100μl DMS O溶解结晶,于酶标仪上570n m比色测吸光度值。

细胞增殖抑制率=(1-实验组OD值/阴性对照组OD值)×100%。

1.7　体外侵袭试验在Trans well上下室之间铺直径13mm聚碳酸酯微孔滤膜,膜上均匀铺人工基底膜胶50微克/孔,将小室置于37℃温箱中聚合30m in。

以终浓度为011μmol/L的VEGF-shRNA处理细胞24h,将细胞浓度调整至2×104个,接种于上室中,下室加入900μl含或不含VEGF(20ng/m l)的培养基,作用96h后弃上室液体,擦净膜上未侵袭的细胞及人工基底膜胶,甲醛固定30m in,HE染色,400倍光学显微镜下选择滤膜上下左右中5个不同视野,计数每个视野侵袭细胞数,计算平均值,每组平行设3个滤膜。

抑制率=(阴性对照组侵袭细胞数-实验组侵袭细胞数)/阴性对照组侵袭细胞数×100%。

2　结果2.1　稳定转染VEGF-shRNA的SK OV3阳性细胞　经4周G418筛选,可以看到绿色的单克隆细胞团形成,又经过4周筛选,可以看到大量带有绿色荧光蛋白标记的细胞。

经FC M检测,GFP阳性细胞在VEGF-shRNA组、空载体组、阴性对照shRNA组的百分比分别为96153%、97125%和97115%,转染组间差异无统计学意义(p>0105)。

2.2　VEGF-shRNA对转染SK OV3细胞VEGF的干扰作用转染72h后,RT-PCR及western bl ot结果显示,VEGF 基因的mRNA及蛋白表达量均较阴性shRNA组、空载体组及空白组低。

2.3　瞬时转染VEGF-shRNA对SK OV3细胞增殖的影响VEGF-shRNA质粒转染后24、48、72h,SK OV3细胞生长的抑制率分别为13124%、27133%、45116%,表明VEGF -shRNA可有效抑制SK OV3细胞增殖,并呈作用时间依赖性,与空载体组、阴性对照shRNA组比较,有显著性差异(p<0105);空载体组和阴性对照shRNA组对SK OV3细胞无明显增殖抑制作用。

2.4　VEGF-shRNA对人卵巢癌细胞体外侵袭能力的影响VEGF-shRNA组可显著抑制SK OV3细胞的人工基底膜体外侵袭能力,抑制率为61127%,而其它各组的体外侵袭能力并无影响。

3　讨论与其它大多数恶性实体瘤不同,卵巢癌在瘤体较小时就容易出现血管内侵犯,也可经淋巴道转移或直接侵犯邻近组织器官等,以及恶性腹水形成,这些因素严重影响了现有治疗手段对卵巢癌的疗效及预后。

肿瘤血管/淋巴管生成是肿瘤生长和转移的形态学基础,它不仅为肿瘤提供充足的营养,而且为转移的肿瘤细胞提供通道,增加肿瘤细胞进入血液循环的几率[2]。

VEGF被认为是肿瘤组织中最主要的促血管/淋巴管生长因子,近年的研究表明肿瘤细胞表面也表达VEGFR,肿瘤细胞分泌的VEGF通过自分泌机制调控下游基因的表达而促进肿瘤细胞的生长、侵袭和转移[3-5]。

因此,VEGF在促进肿瘤组织内皮细胞增殖、新生血管的同时,还通过自分泌机制改变肿瘤细胞自身的凋亡、增殖以及侵袭转移能力来促进肿瘤的发展。

利用药物抑制VEGF的产生或封闭其受体已成为治疗肿瘤的新思路[4]。

本实验构建的稳定转染VEGF-shRNA质粒载体,通过倒置荧光显微镜及FC M检测GFP蛋白表达率以评价SK2 OV3细胞中VEGF-shRNA的转染效率,经G418筛选后,获得高阳性率的转染细胞,表明构建的VEGF-CshRNA质粒载体可高效稳定转染至SK OV3细胞中;RT-PCR及W estern bl ot结果显示转染细胞中VEGF-mRNA及蛋白水平下降,表明筛选出的VEGF-shRNA可有效抑制VEGF的表达, MTT法及肿瘤细胞重组基底膜侵袭实验结果表明,VEGF-shRNA能够抑制SK OV3细胞增殖及对体外重组基底膜的侵袭能力,提示VEGF参与了卵巢癌细胞增殖及转移的相关生物学行为的调控,VEGF-shRNA通过转录后基因沉默机制,抑制了VEGF对卵巢癌细胞的刺激增殖及侵袭作用。

RNA i具有特异、高效、持久的特点,对目的基因的阻断过程比基因剔除更为简便,针对VEGF的RNA i技术在卵巢癌基因治疗方面具有潜在的应用前景,进一步研究将为临床抗肿瘤提供新的选择。