分子生物学实验流程及相关
分子生物学实验技术全攻略
分子生物学实验技术目录实验一细菌的培养 2实验二质粒DNA的提取 3实验三紫外吸收法测定核酸浓度与纯度 4实验四水平式琼脂糖凝胶电泳法检测DNA 5实验五质粒DNA酶切及琼脂糖电泳分析鉴定 7实验六植物基因组DNA提取、酶切及电泳分析 8实验七聚合酶链反应（PCR）技术体外扩增DNA 9实验八 RNA提取与纯化 11实验九 RT-PCR扩增目的基因cDNA 13实验十质粒载体和外源DNA的连接反应 15实验十一感受态细胞的制备及转化 16实验十二克隆的筛选和快速鉴定 18实验十三 DNA分析——Southern杂交 19一基本操作实验一、细菌培养实验二、质粒DNA提取实验三、紫外吸收法测定核酸浓度与纯度实验四、水平式琼脂糖凝胶电泳法检测DNA实验五、质粒DNA酶切及琼脂糖电泳分析鉴定实验六、植物基因组DNA提取、定量、酶切及电泳分析实验八、植物RNA提取及纯化二、目的基因获取实验七、聚合酶链式反应（PCR）技术体外扩增DNA实验九、RT-PCR扩增目的基因cDNA三、目的基因的克隆和表达实验十、质粒载体和外源DNA的连接反应实验十一、感受态细胞的制备及转化实验十二、克隆的筛选和快速鉴定实验十三、DNA分析——Southern杂交实验一细菌的培养一、目的学习细菌的培养方法及培养基的配置。
二、原理在基因工程实验和分子生物学实验中，细菌是不可缺少的实验材料。
质粒的保存、增殖和转化；基因文库的建立等都离不开细菌。
特别是常用的大肠杆菌。
大肠杆菌是含有长约3000kb的环状染色体的棒状细胞。
它能在仅含碳水化合物和提供氮、磷和微量元素的无机盐的培养基上快速生长。
当大肠杆菌在培养基中培养时，其开始裂殖前，先进入一个滞后期。
然后进入对数生长期，以20~30min复制一代的速度增殖。
最后，当培养基中的营养成分和氧耗尽或当培养基中废物的含量达到抑制细菌的快速生长的浓度时，菌体密度就达到一个比较恒定的值，这一时期叫做细菌生长的饱和期。
分子生物学实验
实验一、菌株复壮与单菌落菌株的获取一、实验目的学习细菌培养的LB培养基及抗生素抗性筛选培养基的配制，掌握高压灭菌和获取细菌单菌落菌株两种基本实验操作技能。
二、实验材料、设备及试剂1、实验材料大肠杆菌（E. coli）DH5α菌株：R-，M-，Amp-2、实验设备恒温摇床，电热恒温培养箱，无菌工作台，高压灭菌锅3、试剂酵母浸膏，蛋白胨，氯化钠，琼脂，卡那霉素三、实验步骤液体LB（Luria-Bertain）培养基配方：蛋白胨(typtone) 1.0% （1 g/100 ml）酵母提取物(Yeast extraction)0.5% （0.5g/100 ml）氯化钠 1.0% （1 g/100 ml）PH 7.0固体LB培养基：每100 ml液体培养基中加入1.5g琼脂粉请按试剂瓶上的编号使用相应编号的药勺取药，防止药品相互污染！(1)每组按上述液体LB培养基配方，以配制100ml的量称取药品放入烧杯。
(2)用量筒量取约80 ml 蒸馏水注入烧杯中，玻棒搅拌使药品完全溶解后用100ml量筒定容至100ml。
(3)pH试纸检测pH值，并用1 N NaOH或1 N HCl调节pH值至7.0。
(4)将100ml溶液分装入两个三角瓶，每瓶为50ml。
(5)按固体培养基配方称取适量琼脂粉分别放入两个三角瓶中，以配制成两瓶50ml固体LB培养基。
(6)两个三角瓶分别用锡纸包扎瓶口。
并用记号笔在三角瓶上标注各组标记。
(7)把装有培养基三角瓶放入灭菌锅中，盖上锅盖，以对称方式拧紧锅盖，打开排气阀通电加热，至有连续的白色水蒸气从排气阀排出时，关闭排气阀。
当高压锅温度（气压）指示器指示锅内温度升高至121℃（0.1Mpa）时，调节电压（或利用手动开关电源的方式）使高压锅稳定在该温度（压力）下20 min，然后断开电源。
待指示器指示压力降为0时，方可打开排气阀，然后再打开锅盖小心取出锅内物品。
(8)取出三角瓶后，在酒精灯火焰旁进行下述操作。
分子生物学实验-实验1 DNA重组和细胞转化2015
1. 平端连接
增加DNA浓度或提高连接酶浓度以提高连接效率
2. 粘端连接
效率较高，加入连接酶后可立即转化，即有转化子 出现
3. 粘-平连接
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连接酶的选择：
T4 DNA连接酶：适用粘端、平端连接 可用于DNA-RNA，RNA-RNA杂交体
大肠杆菌DNA连接酶：适用粘端连接（也可用于平端， 效率低）
4
2. 实验试剂： 常规试剂通常3人一组放在桌上，部分试剂一大桌放一管
需要低温放置的试剂在讲台，需到讲台来加样，特别是酶， 加完及时放回原位
有些常规用试剂（如水，加样buffer），可室温保存，多 次使用
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3. 离心机的正确使用：（注意安全和仪器保护）
➢ 平衡—— 15ml连同托架一起平衡，
➢
1.5ml目测体积，对应位置放置
走廊左侧有饮水机
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实验注意事项
1. 实验用品分组（3人一组）标记，放于实验桌上。实验开 始时清点；实验结束，请各组同学将用品归于原位，整理好 本组桌面后再离开。需要回收的器皿初步冲洗后浸泡在水槽 内的盆中（如玻璃耗材等，有疑问请咨询带教老师）
实验开始前请勿乱翻动！
每组2个盆，1个桶，分别放冰，液体垃圾， 固体垃圾，结束时每组自行清理
如：Amp抗性平板
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四、实验步骤
（详见实验讲义）
1. 目的基因c-myc与pSV质粒载体的连接(粘端)
注意：
1. 加样前短暂离心 2. 加样顺序 3. 保证每个样品加
入其中 4. 加样完成后混匀
后离心
目的基因片段（4.8kb），20ng/μl 4.5 μl
载体DNA（3.5kb）， 12ng/μl
分子生物学操作手册
分子生物学操作手册一、引言分子生物学是研究生物体分子结构、功能和相互作用的一门学科。
操作手册旨在提供分子生物学实验的详细步骤，并帮助读者准确、高效地进行实验操作。
本文将介绍PCR扩增、DNA电泳、亚克隆和蛋白质表达等实验步骤，并提供一些常用操作的技巧和注意事项。
二、PCR扩增PCR扩增是分子生物学实验中常用的技术，用于扩增特定区域的DNA片段。
以下是PCR扩增的基本步骤：1. 准备PCR反应体系：根据实验需要，配置PCR反应液，包括DNA模板、引物、酶、缓冲液和dNTPs等。
2. 设定PCR程序：根据模板序列的长度和引物的特性，设定合适的PCR程序，包括变性、退火和延伸等步骤。
3. PCR反应：将PCR反应体系置于热循环仪中，按照设定的程序进行PCR反应。
4. 结果分析：利用DNA电泳等技术，分析PCR反应产物的大小和纯度。
三、DNA电泳DNA电泳是一种常用的DNA分析技术，用于确定DNA片段的大小和纯度。
以下是DNA电泳的基本步骤：1. 制备琼脂糖凝胶：根据需要，配制适当浓度的琼脂糖凝胶，并倒入凝胶槽中，形成凝胶床。
2. 加载样品：将PCR扩增产物或其他DNA样品与DNA标记物混合，加入琼脂糖凝胶孔中。
3. 进行电泳：将凝胶槽放入电泳仪中，进行电泳操作，根据需要设置适当的电压和时间。
4. 结果分析：利用紫外线透射仪观察凝胶上DNA迁移的情况，测量DNA片段的大小。
四、亚克隆亚克隆是将DNA片段插入到载体DNA中的过程，通常用于构建重组DNA或进行基因克隆。
以下是亚克隆的基本步骤：1. 准备载体和DNA片段：准备含有目标基因的DNA片段和经酶切的载体DNA。
2. 消化与连接：将DNA片段与载体DNA进行连接反应，通常使用DNA连接酶。
3. 转化：将亚克隆反应产物转化到适当的宿主细胞中，如大肠杆菌。
4. 筛选与鉴定：通过筛选培养基和PCR等技术，鉴定含有目标基因的克隆。
五、蛋白质表达蛋白质表达是将目标蛋白质在细胞内大量合成的过程，利用该技术可以生产重组蛋白以供研究和应用。
分子生物学实验
分子生物学实验在分子生物学领域，实验是非常重要的手段，可以帮助科学家们深入研究细胞和遗传信息的奥秘。
本文将介绍分子生物学实验的一般步骤和常见技术，为读者提供一个全面的了解。
实验准备在进行任何分子生物学实验之前，实验室必须准备好所有必需的试剂和器材。
这些试剂包括DNA酶、引物、缓冲液等，而器材则包括PCR仪、电泳仪、热循环仪等。
此外，实验室还需要保持清洁、有序，以确保实验结果的准确性和可重复性。
核酸提取在进行分子生物学实验时，研究人员通常需要提取目标细胞或组织中的核酸，如DNA和RNA。
这个步骤非常关键，因为核酸是遗传信息的载体，对后续实验至关重要。
PCR扩增PCR（聚合酶链反应）是一种常用的技术，可以在体外复制DNA片段。
通过PCR扩增，科学家们可以快速获得大量特定DNA序列，为后续实验提供充足的材料。
凝胶电泳凝胶电泳是一种常用的分离和分析DNA片段的技术。
通过在凝胶电泳仪中施加电场，可以使DNA片段根据大小在凝胶中移动，从而实现分离和检测。
蛋白表达和纯化在分子生物学研究中，研究人员经常需要表达和纯化特定蛋白。
通过基因工程技术，科学家们可以将目标基因插入表达载体中，在宿主细胞中大量表达目标蛋白，并通过纯化步骤获得纯净的蛋白样品。
分子克隆分子克隆是将某一DNA片段插入到另一DNA分子中的过程，常用于构建重组DNA、重组蛋白等。
通过分子克隆技术，科学家们可以研究和改变生物体内的基因组成。
实验结果分析一旦实验完成，科学家们需要对实验结果进行分析和解读。
这通常涉及到数据处理、图表绘制、统计学分析等工作，以确保实验结论的准确性和可靠性。
结论与展望分子生物学实验在揭示生命的奥秘和解决重大疾病方面起着至关重要的作用。
随着技术的不断发展和创新，我们相信分子生物学实验将在未来展现出更广阔的发展前景，为人类健康和生活质量带来更多的希望。
希望本文能够帮助读者更好地了解分子生物学实验的基本原理和方法，激发更多人对分子生物学这一神奇领域的兴趣和热爱。
实验室分子生物学实验基本操作规范及注意事项
实验室分子生物学实验基本操作规范及注意事项实验室分子生物学实验基本操作规范及注意事项一、酶与载体的分装酶类与载体：T载体(50 ng/μl)用灭菌水稀释4倍（12.5 ng/μl）后分装成10 μl 或20 μl；连接酶（solutionΙ）按5 μl分装；dNTP（10 mM）分装成50 μl；无菌水分装成1 ml；注意：（1）所有分装都必须用已灭菌的管。
（2）所有工具酶和载体的使用过程均在冰浴中进行。
（3）工具酶、载体以及试剂盒等实验室共用物品，用完后必须及时放回原处，以免耽误他人使用。
（4）当你发现你使用的是最后一管（盒）公用物品时，请马上告知负责人购买，以免耽误使用。
（5）感受态，氨苄青霉素和IPTG由研究生轮流负责制备。
每人负责六个月。
其他试剂则由第一位使用新包装的同学分装。
由于分子实验工具酶比较容易失活，必须在冰上进行分装。
二、常见抗生素及IPTG的配置以氨苄青霉素为例：1．准备足够量的1.5 ml的EP管、两个100 ml的离心管、0.22 μm水系滤器、注射器、蒸馏水，以上用品均要进行高压灭菌。
2. 洁净工作台紫外灭菌，然后进行以下操作。
3．称取2 g的氨苄青霉素粉末于离心管中，加入灭菌水至总体积为20 ml，轻摇离心管，至氨苄青霉素粉末完全溶解，以免过滤时堵塞滤膜。
4．用注射器吸取配制好的溶液，然后把滤器安在注射器上，缓缓推动注射器活塞，把溶液经滤膜推至100 ml的离心管中。
注意：动作要缓和，使滤出液出口正对着离心管，还要防止染菌。
5．把100 ml离心管中已除菌的氨苄青霉素溶液分装到1.5 ml的EP管中，每管0.5 ml。
在EP管上做好标记，包括名称、浓度、日期等。
6．把做好标记的盛有氨苄青霉素的EP管于-20℃保存。
注意：当你发现你使用的是最后一管抗生素时，请马上告知有关人员及时配制，以免耽误使用。
表1.常见抗生素的储存浓度及工作浓度名称储存浓度工作浓度氨苄青霉素（ampicillin）100 mg/ml 50 μg/ml～100 μg/ml卡那霉素（kanamycin）10 mg/ml 10 μg/ml～50 μg/ml氯霉素（chloramphenicol）25 mg/ml 12.5 μg/ml～25 μg/ml链霉素（streptomycin）50 mg/ml 10 μg/ml～50 μg/ml四环素（tetracyyline）10 mg/ml10 μg/ml～50 μg/mlIPTG 1 M 0.05-0.6 mM五、基因扩增1．引物与合成：设计引物序列，发至生工公司进行合成（jinan@）。
分子生物学相关实验
dNTP
dNTP： 在 PCR 反体系中 dNTP 终浓度高于 50mmol/L 会抑制 Taq酶的活性，使用低浓度dNTP可以减少在非靶位臵 启动和延伸时核苷酸错误掺入，高浓度 dNTPs 易产生 错误掺入，而浓度太低，势必降低反应物的产量。 PCR 常 用 的 浓 度 为 50 ～ 200μmol/L ， 不 能 低 于 10 ～ 15μmol/L。四种dNTP的浓度应相同，其中任何一种浓 度偏高或偏低，都会诱导聚合酶的错误掺入，降低合 成速度，过早终止反应
酶
酶： 典型PCR反应混合物中，所用酶浓度为5U/μl，常用范 围为1～4U/100μl。由于DNA模板的不同和引物不同， 以及其它条件的差异，多聚酶的用量亦有差异，酶量 过多会导致非特异产物的增加。
退火温度的升高也可以增加反应的特异性。
模板
模板： 单、双链 DNA 或 RNA 都可以作为 PCR 的样品。若起始 材料是 RNA ，须先通过逆转录得到第一条 cDNA 。虽然 PCR 可以仅用极微量的样品，甚至是来自单一细胞的 DNA ，但为了保证反应的特异性，还应用 ng 级的克隆 DNA，μg水平的单拷贝染色体DNA或104拷贝的待扩增片 段作为起始材料，模板可以是粗品，但不能混有任何蛋 白酶、核酸酶、Taq DNA聚合酶抑制剂以及能结合 DNA 的蛋白。
PCR原理
PCR技术是在模板DNA、引 物和4种脱氧核糖核酸（A、 G、C、T）存在的条件下 依赖于DNA聚合酶的酶促 合成反应。PCR技术的特 异性取决于引物和模板 DNA结合的特异性。
PCR原理
PCR是一种选择性体 外扩增DNA或RNA 片段的方法。此方 法操作简便，可在 短时间内在试管中 获得数百万个特异 DNA序列的拷贝。
……
分子生物学实验方案
分子生物学实验方案实验目的：本实验旨在通过分子生物学技术，研究基因组中特定基因的表达，以及相关信号转导通路的调控机制。
实验原理：1. RNA提取：从细胞或组织中提取总RNA，利用RNA纯化试剂盒抽提RNA样本。
2. cDNA合成：通过逆转录酶反应，利用mRNA模板合成互补的cDNA，并去除RNA模板。
3. 实时定量PCR：使用合适的引物和荧光探针，通过荧光信号实时监测PCR增殖过程，分析特定基因的表达量。
4. 蛋白质免疫印迹：将细胞提取物或组织样本中的蛋白质，通过SDS-PAGE电泳分离，转移到膜上，用特异抗体与目标蛋白结合，再用二抗识别抗体结合，最后显色检测目标蛋白。
实验步骤：1. RNA提取- 准备待检测细胞或组织的样本。
- 使用RNA纯化试剂盒按照说明书进行RNA提取。
2. cDNA合成- 准备反应体系，包括RNA模板、逆转录酶、引物和dNTPs。
- 在PCR仪中进行cDNA合成反应，设定适当的温度和时间。
3. 实时定量PCR- 准备PCR反应体系，包括cDNA模板、引物、探针和荧光染料。
- 在实时荧光定量PCR仪中设定合适的温度程序和循环次数。
- 分析实时PCR数据，计算目标基因的表达量。
4. 蛋白质免疫印迹- 准备待检测细胞或组织的提取物。
- 使用SDS-PAGE分离细胞提取物中的蛋白质。
- 将蛋白质转移到膜上。
- 进行膜上抗体反应，并用二抗结合以增强信号。
- 检测目标蛋白的表达水平。
实验注意事项：1. 实验操作需在无菌环境下进行，以避免外源性RNA或蛋白的干扰。
2. 实验过程中，需使用质量可靠的试剂和仪器设备，确保实验结果准确可靠。
3. 操作时应注意个人防护，避免接触有害物质和受伤。
4. 实验中的样品处理需严格按照操作规程，以确保样品完整性和纯度。
实验结果与分析：通过以上实验方案，可以获得目标基因的表达水平及相关信号转导通路的调控机制。
实时定量PCR结果可用于定量分析目标基因在不同样本中的表达量的差异。
高中生物教案：分子生物学基础知识与实验实践指导
高中生物教案：分子生物学基础知识与实验实践指导简介
本教案旨在帮助高中生掌握分子生物学的基础知识和实验实践指导，深入理解细胞结构、DNA复制和转录、蛋白质合成等关键概念，并能运用所学知识进行实际的实验操作。
第一章：细胞结构与功能
1.细胞的基本组成
2.细胞膜和细胞壁
3.内质网和高尔基体
4.线粒体和叶绿体
5.溶酶体和核小体
第二章：DNA复制与转录
1.DNA的结构与功能
2.DNA复制的原理与过程
3.DNA修复机制
4.RNA的结构与功能
5.转录的过程和调控机制
第三章：蛋白质合成与调控
1.RNA翻译的基本原理与步骤
2.编码RNA和非编码RNA的作用差异
3.翻译后修饰过程及其功能
4.蛋白质合成调控的机制
实验实践指导：
实验一：观察细胞结构
1.实验目的
2.实验材料与器具
3.实验步骤
4.实验结果分析及讨论
实验二：观察DNA复制过程
1.实验目的
2.实验材料与器具
3.实验步骤
4.实验结果分析及讨论
实验三：转录和翻译实验操作指导
1.实验目的
2.实验材料与器具
3.转录实验步骤及结果分析
4.翻译实验步骤及结果分析
总结与思考题：
1.对以上所学知识进行总结归纳，并了解分子生物学在生物科学研究中的意
义。
2.思考如何将所学应用于解决现实问题或开展新的科学研究。
以上是关于高中生物教案：分子生物学基础知识与实验实践指导的简要概述，包括基础知识内容和相关实验操作指导。
通过本教案，希望能够帮助高中生全面掌握和运用分子生物学方面的知识，培养科学思维和实践能力。
分子生物学实验
分子生物学实验分子生物学实验I. 实验概述分子生物学是生物学的一个重要分支，主要研究生物分子的结构、功能及其在生命过程中的作用。
在现代生命科学研究中，分子生物学技术的应用越来越广泛，包括基因克隆、基因表达、蛋白质结构、信号转导等多个方面。
本实验将介绍几种基本的分子生物学实验操作，包括DNA的提取、PCR扩增、电泳检测和蛋白质的SDS-PAGE分析，旨在提高学生对分子生物学基础知识和实验技能的掌握。
II. 实验材料及设备1. 细菌培养基、磷酸盐缓冲液、EDTA、裂解液等试剂；2. 离心管、洗涤管、PCR管、电泳槽等设备；3. 离心机、PCR仪、电泳仪等设备。
III. 实验步骤1. DNA的提取(1) 收集细胞收集需要提取DNA的细胞，如细菌、白细胞等。
将细胞转移到1.5mL离心管中。
(2) 细胞裂解加入200μl裂解液，轻轻摇晃离心管，使细胞充分裂解。
离心管可置于65°C水浴中处理10分钟，使DNA完全裂解。
(3) DNA提取加入500μl磷酸盐缓冲液和10μl EDTA，混匀后离心5分钟。
取上清液转移至新的离心管中，加入等体积的异丙醇，并轻轻倒置，使DNA在异丙醇界面上结团。
放置室温下10分钟，使用洗涤管将DNA结团转移到另一离心管中。
加入70%乙醇溶液洗涤2-3次，最后去除乙醇，用无菌水溶解DNA。
2. PCR扩增(1) 设计引物、制备PCR反应液按照所需扩增的DNA序列设计引物，制备PCR反应液，包括所需模板DNA、引物、Taq聚合酶、MgCl2等。
(2) PCR条件将PCR反应管放置PCR仪中，经过若干个循环，达到最终PCR产物的扩增。
PCR条件通常应选择对应引物特异性、Tm温度适中，并根据Taq聚合酶的活性和反应体系的最适条件优化所得。
常用的PCR条件为95℃预变性5min，94℃变性30s，Tm温度退火30s，72℃延伸1min，循环30-35次，最后72℃加延伸10min。
分子生物学实验方法与步骤
分子生物学实验方法与步骤表达蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析一、原理细菌体中含有大量蛋白质，具有不同的电荷和分子量。
强阴离子去污剂SDS与某一还原剂并用，通过加热使蛋白质解离，大量的SDS 结合蛋白质，使其带相同密度的负电荷，在聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）上，不同蛋白质的迁移率仅取决于分子量。
采用考马斯亮兰快速染色，可及时观察电泳分离效果。
因而根据预计表达蛋白的分子量，可筛选阳性表达的重组体。
二、试剂准备1、30%储备胶溶液：丙烯酰胺（Acr）29.0g，亚甲双丙烯酰胺（Bis）1.0g，混匀后加ddH2O，37O C溶解,定容至100ml, 棕色瓶存于室温。
2、1.5M Tris-HCl(pH 8.0：Tris 18.17g加ddH2O溶解, 浓盐酸调pH至8.0,定容至100ml。
3、1M Tris-HCl(pH 6.8：Tris 12.11 g加ddH2O溶解, 浓盐酸调pH至6.8,定容至100ml。
4、10% SDS：电泳级SDS 10.0 g加ddH2O 68℃助溶,浓盐酸调至pH 7.2,定容至100ml。
5、10电泳缓冲液(pH 8.3：Tris 3.02 g，甘氨酸18.8 g，10% SDS 10ml加ddH2O溶解, 定容至100ml。
6、10%过硫酸铵（AP）： 1gAP加ddH2O至10ml。
7、2SDS电泳上样缓冲液：1M Tris-HCl (pH 6.82.5ml，-巯基乙醇1.0ml，SDS 0.6 g，甘油2.0ml，0.1%溴酚兰1.0ml，ddH2O 3.5ml。
8、考马斯亮兰染色液：考马斯亮兰0.25 g，甲醇225ml，冰醋酸 46ml，ddH2O 225ml。
9、脱色液:甲醇、冰醋酸、ddH2O以3∶1∶6配制而成。
二、操作步骤采用垂直式电泳槽装置（一）聚丙烯酰胺凝胶的配制1、分离胶(10%的配制:ddH2O 4.0ml30%储备胶 3.3ml1.5M Tris-HCl2.5ml10% SDS 0.1ml10% AP 0.1ml取1ml上述混合液,加TEMED(N,N,N’,N’-四甲基乙二胺10μl 封底,余加TEMED4μl ,混匀后灌入玻璃板间，以水封顶，注意使液面平。
分子生物学实验指导
《分子生物学》实验指导实验1 植物总DNA的提取生物总DNA的提取是分子生物学实验的一个重要内容。
由于不同的生物材料细胞壁的结构和组成不同，而细胞壁结构的破坏是提取总DNA的关键步骤。
同时细胞内的物质也根据生物种类的不同而有差异，因此不同生物采用的提取方法也不同，一般要根据具体的情况来设计实验方法。
本实验介绍采用CTAB法提取植物总DNA的技术。
[实验目的]学习和掌握学习CTAB法提取植物总DNA的基本原理和实验技术。
学习和掌握紫外光吸收法鉴定DNA的纯度和浓度。
[实验原理]植物叶片经液氮研磨，可使细胞壁破裂，加入去污剂（如CTAB），可使核蛋白体解析，然后使蛋白和多糖杂质沉淀，DNA进入水相，再用酚、氯仿抽提纯化。
本实验采用CTAB法，其主要作用是破膜。
CTAB 是一种非离子去污剂，能溶解膜蛋白与脂肪，也可解聚核蛋白。
植物材料在CTAB的处理下，结合65℃水浴使细胞裂解、蛋白质变性、DNA 被释放出来。
CTAB与核酸形成复合物，此复合物在高盐（>0.7mM）浓度下可溶，并稳定存在，但在低盐浓度（-0.5mM NaCl）下CTAB-核酸复合物就因溶解度降低而沉淀，而大部分的蛋白质及多糖等仍溶解于溶液中。
经过氯仿/ 异戊醇(24:1) 抽提去除蛋白质、多糖、色素等来纯化DNA，最后经异丙醇或乙醇等沉淀剂将DNA 沉淀分离出来。
由于核酸、蛋白质、多糖在特定的紫外波长都有特征吸收。
核酸及其衍生物的紫外吸收高峰在260nm。
纯的DNA样品A260/280≈，纯的RNA样品A260/280≈，并且1μg/ml DNA溶液A260=。
[实验器材]1、高压灭菌锅2、冰箱3、恒温水浴锅4、高速冷冻离心机5、紫外分光光度计6、剪刀7、陶瓷研钵和杵子8、磨口锥形瓶（50ml）9、滴管10、细玻棒11、小烧杯（50ml）12、离心管（50ml）13、植物材料[实验试剂]1、3×CTAB buffer（）100mM Tris25mM EDTA1.5M NaCl3% CTAB2% β-巯基乙醇2、TE缓冲液（）10mmol/L Tris·HCl1mmol/L EDTA3、氯仿-异戊醇混合液（24：1，V/V）4、95％乙醇5、液氮[实验步骤]1、称取2g新鲜的植物叶片，用蒸馏水冲洗叶面，滤纸吸干水分。
《分子生物学》实验指导书
《分子生物学》实验指导书实验学时：32学时适用专业：生物科学、生物技术实验目录实验一质粒DNA的提取、酶切与电泳鉴定 (1)实验二聚合酶链式反应扩增DNA片段 (3)实验三大肠杆菌感受态细胞的制备与质粒DNA分子转化 (4)实验四植物基因组DNA提取及电泳 (6)实验五植物基因组RNA提取及电泳 (7)实验一质粒DNA的提取、酶切与电泳鉴定实验项目类型：综合性一、实验目的1. 学习质粒的相关基本知识，掌握碱裂解法提取质粒DNA的原理和方法。
2. 学习和掌握限制性内切酶的特性、掌握对重组质粒进行限制性内切酶酶切的原理和方法，并理解限制性内切酶是DNA重组技术的关键工具。
二、实验原理碱裂解法提取质粒DNA的原理是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA的结构差异来实现分离的。
在pH12-12.5时，线性DNA被彻底变性，但共价闭环质粒DNA虽然氢键也发生断裂，但两条互补链仍会紧密缠绕结合在一起。
当在溶液体系中加入pH4.8的KAC时，溶液恢复中性，质粒DNA迅速复性，染色体DNA则由于变性而相互混乱缠绕，不能复性，从而离心即可以把变性的染色体DNA沉淀和蛋白-SDS复合物沉淀分离出来。
三、实验仪器与材料1. 材料：含pSV的E.coli JM109菌株、1.5ml塑料离心管、离心管架、EB、酚、氯仿、异丙醇、乙醇、琼脂糖、吸头等。
2. 溶液或试剂：LB培养基、溶液Ⅰ、溶液II（0.4mol/L NaOH、2%SDS用前等体积混合）、溶液Ⅲ、分离液：酚/氯仿/异戊醇＝25:24:1、无水乙醇、70%乙醇等。
3. 仪器或其他用具：微量移液器(20μl,200μl,1000μl)、恒温振荡摇床、高压蒸汽灭菌锅、涡旋振荡器、琼脂糖凝胶电泳系统、凝胶成像系统、恒温培养箱、制冰机等。
四、操作步骤质粒DNA的提取步骤：1. 用灭菌的牙签挑取白色单菌落接种于另外已制备好的LB琼脂平板上，保存菌种，并把牙签放入盛3 ml LB液体培养基的试管中，37℃振荡培养过夜。
分子生物学实验指导
分子生物学实验指导1. 实验背景分子生物学是研究生物大分子的结构、功能和相互作用的一门科学。
它包括DNA、RNA、蛋白质等生物大分子的研究，以及研究它们在细胞内的功能和相互作用的方式。
分子生物学的发展对于理解生物现象、治疗疾病和推动基因工程等都起到了重要的作用。
在进行分子生物学实验之前，我们需要了解一些基本的实验原理和步骤，以确保实验的准确性和可重复性。
本文将介绍一系列分子生物学实验的指导，包括DNA提取、PCR、凝胶电泳等。
2. 实验材料•细菌培养基•细菌菌株•试剂盒（DNA提取、PCR、凝胶电泳）•离心管、PCR管、琼脂糖凝胶板等实验器材3. 实验步骤3.1 DNA提取1.取一定数量的细菌菌株，并将其转接到细菌培养基中。
2.在转接后的细菌培养基中培养一夜，使细菌得到充分生长。
3.将培养好的细菌菌液转移到离心管中，进行离心。
4.移除上清液，加入细菌细胞裂解液，并进行充分混合。
5.进行高速离心，将裂解后的细菌细胞碎片与上清液分离。
6.取得上清液，为DNA提取做好准备。
3.2 PCR1.准备PCR反应试剂盒，包括模板DNA、引物、dNTPs等。
2.处理PCR管，加载模板DNA、引物、dNTPs和酶。
3.设置PCR反应器的温度程序，包括变性、退火和延伸等步骤。
4.将PCR反应管放入PCR机中，进行PCR反应。
3.3 凝胶电泳1.准备琼脂糖凝胶板，根据需要调整琼脂糖浓度和凝胶浓度。
2.准备样本，将PCR反应产物与DNA标准样品一同加载到凝胶孔中。
3.加载电泳缓冲液，确保凝胶完全被浸泡。
4.打开电泳仪，进行凝胶电泳，设定一定的电流和时间。
4. 结果分析通过实验，我们可以获得一系列结果。
在DNA提取实验中，我们可以通过测量DNA的浓度和质量来评估提取的效果。
在PCR实验中，可以通过检测PCR产物的大小和数量来评估PCR反应的效果。
在凝胶电泳实验中，可以通过观察凝胶图像来判断PCR产物的大小和纯度。
5. 实验注意事项在进行分子生物学实验时，需要注意以下事项：•实验前要充分准备。
分子生物学实验教学教案
分子生物学实验教学教案一、实验原理及目的1. 实验原理：介绍PCR（聚合酶链反应）的原理及应用。
解释DNA提取、扩增和测序的基本步骤。
说明基因克隆、表达和纯化的过程。
2. 实验目的：让学生掌握PCR技术的操作步骤和技巧。
培养学生对DNA提取、扩增和测序的基本能力。
培养学生进行基因克隆、表达和纯化的实验技能。
二、实验材料及试剂1. 实验材料：学生分组，每组一份实验材料套装，包括DNA模板、引物、酶、dNTPs等。
2. 实验试剂：PCR反应混合物（含PCR缓冲液、酶、引物、dNTPs）DNA提取试剂盒琼脂糖凝胶核酸染料电泳缓冲液转移缓冲液洗涤缓冲液三、实验步骤及注意事项1. 实验步骤：按照实验材料及试剂的准备要求，准备实验所需的材料和试剂。
按照实验原理，进行PCR反应、DNA提取、扩增和测序等实验操作。
观察并记录实验结果，进行数据分析和解释。
2. 注意事项：实验操作过程中要严格遵守实验室安全规定，佩戴好个人防护装备。
在进行PCR反应时，要准确控制温度和时间，避免非特异性扩增。
在操作DNA时，要避免核酸的降解和污染。
四、实验结果与分析1. 实验结果：观察PCR反应后的琼脂糖凝胶电泳结果，记录DNA条带的大小和亮度。
分析DNA提取、扩增和测序的结果，确定目标基因的存在和序列。
2. 结果分析：根据实验结果，分析实验操作的准确性和可行性。
比较不同实验条件下的结果，探讨实验条件的优化方法。
结合理论知识，解释实验结果的生物学意义。
1. 实验报告内容：实验目的、原理和步骤的概述。
实验材料和试剂的使用情况。
实验结果的描述和数据记录。
实验结果分析的结论和讨论。
报告要条理清晰，语言简练，数据准确。
结果图要清晰，图例说明详细。
报告要包括实验操作中的问题和解决方法。
报告要结合实验结果，提出实验现象的解释和相关问题的讨论。
六、实验技能与技巧训练1. 实验技能：培训学生进行PCR反应的技巧，包括DNA模板的制备、引物的设计、反应混合物的配置等。
分子生物学实验
物、小麦胚芽提取物等
表达蛋白的纯化
• SDS聚丙烯酰胺胶回收：利用SDS聚丙烯酰
胺胶分离不同大小的的蛋白。
• 利用6×HIS、GST（谷胱甘肽）等和亲和树
脂纯化：通过表达目标基因的融合蛋白， 利用亲和层析洗脱出目标蛋白
• 自动核酸/蛋白纯化工作站
目标蛋白功能分析
克隆化基因的表达及表达蛋白的纯 化和功能分析
•
克隆化基因的表达
•
表达蛋白的纯化
•
功能分析
克隆化基因的表达
• 基因的克隆：利用高保真的Taq酶和合适的
反应系统，通过PCR获得与目标基因完全一 致的DNA片段（通过测序确证）
• 体内表达：选择合适的表达载体插入目标
片段。利用化学方法或电转化仪等手段转 入细胞表达
• 抗体的制备：多抗、单抗 • DNA-蛋白质相互作用研究：Gel-shift实验、
蛋白质磷酸化分析、酵母单杂交系统等
• 蛋白质-蛋白质相互作用研究：酵母双杂交
系统、噬菌体表面展示技术等
蛋白体内表达研究
• Western blotting：利用抗原-抗体反应，对
蛋白质混合物中的目标蛋白进行鉴别和定 量
• 铺板培养后通过蓝白
斑，原位裂解杂交分 离出含有目标质粒的 单个菌落
对于通过PCR技术获得的目标基因
PCR或RACE
电泳
凝胶成像系统
长波紫外观察箱
切胶
胶回收试剂盒
T载体、平末端载体 转化细菌并铺板培养
筛选目标菌落
提取目标质粒
对于通过PCR技术获得的目标基因
PCR仪
PCR或RACE
Taq酶、薄壁管、矿物油
分子生物学常用实验技术及方法
第二章 常用实验技术及方法一、聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction, PCR)反应总体积为50 µl ，其中含有：模板DNA 0.5 µlPCR 缓冲液(不含MgCl 2) 5 µl10×MgCl 2 溶液 5 µldNTP (2.5 mmol/L) 0.5 µl引物1 (50 umol/L) 0.5 µl引物2 (50 umol/L) 0.5 µlTaq DNA 聚合酶 0.5 µl无菌去离子水加至 50 µl上层用25 µl 液体石蜡油覆盖。
循环参数为： 94 ℃变性10 min94 ℃变性1 min56 ℃退火1 min72 ℃延伸2 min共30个循取环，PCR 结束后，取2 µl PCR 扩增产物，经1 %琼脂糖凝胶电泳，在紫外检测仪上观察并拍照。
二、基于PCR 技术的定点突变1. 根据所要突变位点的特定氨基酸，并按公认的四引物法原理，分别设计上下游引物Primer 3和Primer 4，这两条引物部分交错互补，但分别含有欲突变后的碱基（红点）的互补序列（如下图所示）；2. 用基因5’端的Primer 1和Primer 2 PCR 扩增DNA 片段1，用基因3’端的Primer4和Primer 3一起PCR 扩增DNA 片段2，PCR 反应条件基本如上(七、聚合酶链反应)，可根据具体实验略有调整，反应完毕后，分别电泳回收DNA 片段1和DNA片段2；3. 以片段1和片段2为模板，进行第二次PCR反应，反应体系为50 µl：片段1 1 µl片段2 1 µl10×PCR缓冲液(不含MgCl2) 5 µl10×MgCl2溶液 5 µldNTP (2.5 mmol/L) 5 µlTaq酶 1 µl加ddH2O至50 µl在该反应体系中先不加入引物，按上述反应条件进行10个循环，然后再加入Primer 1和Primer 4各1 ul，按上述反应条件再扩增30个循环；4. PCR产物经电泳检查，然后连接到相应的载体中，进行测序以确定定点突变的正确性。
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目标片段的克隆和自切割或T-Vector、平末端 通过噬菌体载体自切割或T Vector、平末端 载体克隆获得目标质粒 • 利用测序仪和通用引物对克隆的目的基因 测序
PCR或RACE 电泳 凝胶成像系统 长波紫外观察箱 切胶 胶回收试剂盒
T载体、平末端载体 转化细菌并铺板培养 筛选目标菌落 提取目标质粒
对于通过PCR技术获得的目标基因 对于通过PCR技术获得的目标基因
PCR仪 PCR或RACE Taq酶、薄壁管、矿物油
电泳仪器
琼脂水平电泳
琼脂糖
凝胶成像系统、手提紫外灯
分子生物学实验流程及相关 试剂、 试剂、仪器概述
GENE COMPANY LTD 2003年 2003年8月 For 江西日博公司
分子生物学实验概述
生物样品（细胞、组织、细菌） 细胞调节 神经科学 分子诊断 DNA分离 RNA分离
质粒DNA 噬菌体DNA
基因组DNA
总RNA
mRNA
cDNA DNA测序 重组DNA DNA标记 突变 基因表达 PCR 遗传鉴定通过SMART技术构建cDNA 通过SMART技术构建cDNA
恒温水浴锅、制冰机 PCR仪 恒温水浴锅、离心机 电泳仪器、凝胶成像系统 恒温水浴锅 超净工作台、烘箱、PCR仪 超低温冰箱 第一链的合成 第二链的合成和扩增 酶切、纯化和O RTase、RNase抑制剂 高保真Taq酶 限制性内切酶、过滤柱 琼脂糖
材料的速冻
超低温冰箱
长期保存
卵细胞mRNA的提取、纯化 卵细胞mRNA的提取、纯化
200℃ 烘箱 Oligotex系列试剂盒 细胞裂解 旋涡混匀器 离心机 恒温水浴锅 离心机、旋涡混匀器 匀浆 去蛋白和细胞残渣 温浴并结合 洗脱 去盐和回收 DEPC 、 RNase-free DNase I 、 RNase-free 耗材
目标基因的克隆
• 利用特异探针，通过核酸杂交的方法或利
用特异的抗体，通过抗原用特异的抗体，通过抗原-抗体反应进行文 库目标基因的筛选 • 利用GSP（基因特异引物）通过PCR扩增出 利用GSP（基因特异引物）通过PCR扩增出 目标基因 • 通过5‘RACE和3’RACE克隆已知部分序列的 通过5 RACE和 RACE克隆已知部分序列的 目标基因
水稻各器官Total RNA的提取、纯化 水稻各器官Total RNA的提取、纯化 和分析
• 分离所需的水稻各器官组织，并利用
Qiagen的RNeasy系列试剂盒提取总RNA： Qiagen的RNeasy系列试剂盒提取总RNA： 将材料裂解后，通过过滤柱纯化出总RNA 将材料裂解后，通过过滤柱纯化出总RNA • 在RNase-free的情况下，通过甲醛变性胶电 RNase-free的情况下，通过甲醛变性胶电 泳检测总RNA的质量 泳检测总RNA的质量 • 利用特异性的探针，通过Northern blotting 利用特异性的探针，通过Northern 检测目标基因在各器官的表达情况
能分析 • 基因转化实验及转基因结果分析
实验起始材料的选取和准备
常规材料 组织器官
原生质体\细胞
细菌\真菌\酵母
特殊材料 少量起始材料 特殊病变组织 亚细胞结构
实验起始材料的选取和准备
人工气候箱、制冰机 分离准备工作
超净工作台、显微操作系统
水稻卵细胞的分离 RNase 抑制剂
RNase-free 耗材、液氮罐
DNA、RNA的提取、纯化和分析 DNA、RNA的提取、纯化和分析
• 包含有目标基因的质粒的获得 • 水稻基因组DNA的提取、纯化和分析 水稻基因组DNA的提取、纯化和分析 • 水稻各器官Total RNA的提取、纯化和分析 水稻各器官Total RNA的提取、纯化和分析
包含有目标基因的质粒的获得
• 对于通过筛库技术获 •
得的目标基因 通过噬菌体载体的自 切割作用生成目标质 粒
• 对于通过PCR技术获回收纯化后利用T 通过回收纯化后利用T 载体等克隆并转化细 菌 铺板培养后通过蓝白 斑，原位裂解杂交分 离出含有目标质粒的 单个菌落
对于通过PCR技术获得的目标基因 对于通过PCR技术获得的目标基因
X-gal、IPTG、 尼龙膜和探针
离心机、恒温水浴锅
质粒提取、酶切分析、测序
限制性内切酶
质粒提取、分析
• 常规质粒提取方法：通过细菌的适当裂解释放出 • • • •
质粒，利用酚和氯仿抽提掉蛋白，再利用无水乙 醇沉淀质粒DNA 醇沉淀质粒DNA 质粒提取试剂盒：裂解方法一致。裂解完成后利 用过滤柱纯化出质粒DNA 用过滤柱纯化出质粒DNA 质粒提取后，根据以后实验要求利用不同的限制 性内切酶在水浴锅中进行酶切 电泳，用凝胶成像系统分析 测序
分子生物学实验概述（续）
基因表达 报告基因载体
体外转录 真核转录 翻译 报告基因检测 蛋白 蛋白分析 蛋白分离 基因转化
分子生物学主要实验流程
• 实验起始材料的选取和准备 • mRNA的提取、纯化 mRNA的提取、纯化 • 目标片段的克隆和分析 • DNA、RNA的提取、纯化和分析 DNA、RNA的提取、纯化和分析 • 克隆化基因的表达及表达蛋白的纯化和功
表达蛋白的纯化
• SDS聚丙烯酰胺胶回收：利用SDS聚丙烯酰 SDS聚丙烯酰胺胶回收：利用SDS聚丙烯酰
胺胶分离不同大小的的蛋白。 • 利用6×HIS、GST（谷胱甘肽）等和亲和 利用6 HIS、GST（谷胱甘肽）等和亲和 树脂纯化：通过表达目标基因的融合蛋白， 利用亲和层析洗脱出目标蛋白 • 自动核酸/蛋白纯化工作站 自动核酸/
• • • • • •
纯水仪 移液器 pH计 pH计 电子天平 生化培养箱 灭菌锅
谢
谢
反应系统，通过PCR获得与目标基因完全一 反应系统，通过PCR获得与目标基因完全一 致的DNA片段（通过测序确证） 致的DNA片段（通过测序确证） • 体内表达：选择合适的表达载体插入目标 片段。利用化学方法或电转化仪等手段转 入细胞表达 • 体外转录和翻译系统：兔网织红细胞裂解 物、小麦胚芽提取物等
基因转化实验和转基因结果分析
• 转基因载体的构建：载体、农杆菌、特殊
抗生素 • 植株的转化：叶盘转化法、基因枪 • 植株的筛选：荧光检测、GUS染色、PCR法 植株的筛选：荧光检测、GUS染色、PCR法 • 基因功能分析：激光共聚焦显微镜、FISH 基因功能分析：激光共聚焦显微镜、FISH 等
部分分子生物学实验必需仪器
Southern blotting和Northern blotting blotting和
Southern blotting 限制性内切酶、恒温水浴锅 基因组DNA完全消化 探针制备 同位素检测仪
手提紫外灯、电泳仪器
琼脂水平电泳
比活性测定
探针制备试剂盒
真空转膜仪
印迹转膜
尼龙膜
紫外交联仪
DNA交联
Southern blotting和Northern blotting blotting和 （续）
利用PCR技术获得目标基因 利用PCR技引物和GSP，通过5 RACE和 列设计通用引物和GSP，通过5’RACE和 3’RACE扩增出目标基因的5’和3’端序列。并 RACE扩增出目标基因的5 通过电泳、凝胶成像系统检测
目标蛋白功能分析
• 抗体的制备：多抗、单抗 • DNA-蛋白质相互作用研究：Gel-shift实验、 DNA-蛋白质相互作用研究：Gel-shift实验、
蛋白质磷酸化分析、酵母单杂交系统等 • 蛋白质-蛋白质相互作用研究：酵母双杂交 蛋白质系统、噬菌体表面展示技术等
蛋白体内表达研究
• Western blotting：利用抗原-抗体反应，对 blotting：利用抗原蛋白质混合物中的目标蛋白进行鉴别和定 量 • 免疫组织化学研究：通过切片技术和免疫 反应，利用特异抗体检测特定蛋白在组织 细胞内的表达和定位 • 蛋白质芯片系统
水稻基因组DNA的提取、 水稻基因组DNA的提取、 纯化和分析
• 利用SDS法或Qiagen提供的基因组提取试剂 利用SDS法或Qiagen提供的基因组提取试剂
盒提取水稻基因组DNA：利用SDS在高钾离 盒提取水稻基因组DNA：利用SDS在高钾离 子浓度的情况下能沉淀蛋白和多糖等杂质 的原理提取基因组DNA 的原理提取基因组DNA • 利用酚-氯仿抽提或过滤柱纯化基因组DNA 利用酚-氯仿抽提hern blotting检 利用特异的探针，通过Southern blotting检 测目标基因的拷贝数
制备好的尼龙膜 探针（放射性或非放射性）
杂交箱
杂交
同位素检测仪 磷屏成像系统
放射自显影
荧光
荧光扫描 成像系统
克隆化基因的表达及表达蛋白的纯 化和功能分析
• • •
克隆化基因的表达 表达蛋白的纯化 功能分析
克隆化基因的表达
• 基因的克隆：利用高保真的Taq酶和合适的 基因的克隆：利用高保真的Taq酶和合适的
长波紫外观察箱
PCR回收试剂盒 恒温水浴锅、离心机
胶回收试剂盒
对于通过PCR技术获得的目标基因 对于通过PCR技术获得的目标基因 （续）
纯化产物 测序仪 PCR产物测序 T载体、平末端载体连接 低温冰箱
超净工作台、电转化仪
细菌转化、铺板培养
感受态细胞、培养基、 抗生素
杂交箱、恒温摇床、低温冰箱
蓝白斑筛选、菌落原位杂交
通过核酸杂交和免疫反应筛库
• 将培养于平板的噬菌斑通过印迹转于尼龙
膜，并于核酸交联仪中固定。在杂交箱中 利用特定探针杂交。最后在恒温摇床中洗 膜（探针标记：放射性和非放射性） • 将噬菌体培养于平板，于42℃培养几小时 将噬菌体培养于平板，于42℃ 后，于37℃用IPTG诱导融合蛋白的表达并 后，于37℃用IPTG诱导融合蛋白的表达并 印记于尼龙膜上，利用抗原印记于尼龙膜上，利用抗原-抗体反应进行 杂交