血红蛋白的提取和分离课件
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血红蛋白的提取和分泳法
1、蛋白质特性的差异
(1)分子的形状和大小；
(2)所带电荷的性质和多少；
(3)溶解度；
(4)吸附性质；
(5)对其他分子的亲和力。
2、分离蛋白质的方法 (1)凝胶色谱法 ①概念：也称做分配色谱法，是根据相对分子质量的大 小分离蛋白质的有效方法。 ②凝胶：微小的多孔球体，大多数是由多糖类化合物构 成，内含许多贯穿通道,如葡聚糖或琼脂糖。
③电泳常用方法 a.琼脂糖凝胶电泳：由于琼脂糖本身不带电荷，各种分子 在电场中的迁移速率因各种分子带电性质的差异、分子大 小和形状的不同而不同，从而得以分离。 b.聚丙烯酰胺凝胶电泳 加入SDS作用：掩盖不同种蛋白质间的电荷差别，使电泳 迁移率完全取决于分子的大小。（原理：SDS使蛋白质发 生完全变性，解聚成单条肽链，并与其结合形成蛋白质— SDS复合物，SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质原有的 电荷量。测定的结果只是单条肽链的分子量）
以哺乳动物红细胞为材料，血红蛋白质的提取和分 离一般分为四步：样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。
（一)样品处理及粗分离 1、红细胞的洗涤 (1)目的:去除杂蛋白； (2)过程：
(3)实验注意事项：为防止血液凝固，加入抗凝血剂柠檬 酸钠。生理盐水洗涤防止红细胞吸水涨破。低速短时 离心。如果离心速度过高和时间过高会使白细胞和淋巴细 胞一同沉淀，达不到分离的效果。④洗涤次数过少，无法 去除血浆蛋白,分层不明显⑤上清无黄色，表明细胞已洗净。
3、缓冲溶液 ①概念：在一定范围内，能够抵制外界的酸、碱对PH的 影响，维持pH基本不变的溶液。 ②缓冲溶液的配制 1～2种缓冲剂 调节使用比例控制pH范围
二、血红蛋白的提取和分离 血红蛋白由四条肽链组成，包括两条α-肽链和两条
1、蛋白质特性的差异
(1)分子的形状和大小；
(2)所带电荷的性质和多少；
(3)溶解度；
(4)吸附性质；
(5)对其他分子的亲和力。
2、分离蛋白质的方法 (1)凝胶色谱法 ①概念：也称做分配色谱法，是根据相对分子质量的大 小分离蛋白质的有效方法。 ②凝胶：微小的多孔球体，大多数是由多糖类化合物构 成，内含许多贯穿通道,如葡聚糖或琼脂糖。
③电泳常用方法 a.琼脂糖凝胶电泳：由于琼脂糖本身不带电荷，各种分子 在电场中的迁移速率因各种分子带电性质的差异、分子大 小和形状的不同而不同，从而得以分离。 b.聚丙烯酰胺凝胶电泳 加入SDS作用：掩盖不同种蛋白质间的电荷差别，使电泳 迁移率完全取决于分子的大小。（原理：SDS使蛋白质发 生完全变性，解聚成单条肽链，并与其结合形成蛋白质— SDS复合物，SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质原有的 电荷量。测定的结果只是单条肽链的分子量）
以哺乳动物红细胞为材料，血红蛋白质的提取和分 离一般分为四步：样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。
（一)样品处理及粗分离 1、红细胞的洗涤 (1)目的:去除杂蛋白； (2)过程：
(3)实验注意事项：为防止血液凝固，加入抗凝血剂柠檬 酸钠。生理盐水洗涤防止红细胞吸水涨破。低速短时 离心。如果离心速度过高和时间过高会使白细胞和淋巴细 胞一同沉淀，达不到分离的效果。④洗涤次数过少，无法 去除血浆蛋白,分层不明显⑤上清无黄色，表明细胞已洗净。
3、缓冲溶液 ①概念：在一定范围内，能够抵制外界的酸、碱对PH的 影响，维持pH基本不变的溶液。 ②缓冲溶液的配制 1～2种缓冲剂 调节使用比例控制pH范围
二、血红蛋白的提取和分离 血红蛋白由四条肽链组成，包括两条α-肽链和两条
血红蛋白的提取和分离经典ppt课件.ppt
聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳示意图
（A为正面，B为剖面） 1：样品胶pH6.7 2：浓缩胶pH6.7 3：分离胶pH8.9 4：电极缓冲液pH8.3
10
篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
①琼脂糖凝胶电泳操作简单，电泳速度快，样品不需要事先 处理；电泳后区带易染色，样品极易洗脱，便于定量测定。 ②测定蛋白质的相对分子质量常用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳， 这是因为该方法分离蛋白质完全取决于分子的大小，而非所 带电荷的性质和分子的大小、形状。
实验操作
（一）蛋白质提取和分离步骤 红细胞的洗涤
样品处理 血红蛋白的释放 分离血红蛋白溶液
粗分离：透析—去除样品中分子量较小的杂质
纯化：用凝胶色谱法除去相对分子质量较大的
杂质
纯度鉴定 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
（二）操作过程
篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
原理：
当不同的蛋白质通过凝胶时
相对分子质量较小 容易进入
凝胶内部的通道
相对分子质量较大
无法进入凝胶 内部的通道
只能在凝胶外部移动
路程较长 移动速度较慢
路程较短 移动速度较快
相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离。
4.凝胶色谱法分离蛋白质的原理和具体过程 篮球比赛是根据运动队在规定的比赛时间里得分多少来决定胜负的，因此，篮球比赛的计时计分系统是一种得分类型的系统
电泳槽
迷你双垂直电泳槽
卧式电泳槽
等电聚焦多用电泳槽
9
篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
（A为正面，B为剖面） 1：样品胶pH6.7 2：浓缩胶pH6.7 3：分离胶pH8.9 4：电极缓冲液pH8.3
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篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
①琼脂糖凝胶电泳操作简单，电泳速度快，样品不需要事先 处理；电泳后区带易染色，样品极易洗脱，便于定量测定。 ②测定蛋白质的相对分子质量常用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳， 这是因为该方法分离蛋白质完全取决于分子的大小，而非所 带电荷的性质和分子的大小、形状。
实验操作
（一）蛋白质提取和分离步骤 红细胞的洗涤
样品处理 血红蛋白的释放 分离血红蛋白溶液
粗分离：透析—去除样品中分子量较小的杂质
纯化：用凝胶色谱法除去相对分子质量较大的
杂质
纯度鉴定 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
（二）操作过程
篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
原理：
当不同的蛋白质通过凝胶时
相对分子质量较小 容易进入
凝胶内部的通道
相对分子质量较大
无法进入凝胶 内部的通道
只能在凝胶外部移动
路程较长 移动速度较慢
路程较短 移动速度较快
相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离。
4.凝胶色谱法分离蛋白质的原理和具体过程 篮球比赛是根据运动队在规定的比赛时间里得分多少来决定胜负的，因此，篮球比赛的计时计分系统是一种得分类型的系统
电泳槽
迷你双垂直电泳槽
卧式电泳槽
等电聚焦多用电泳槽
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篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
血红蛋白的提取与分离课件
血红蛋白的提取与分离
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㈢电泳：
电泳：带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程
1）原理：
不同蛋白质的带电性质（正电荷或负电荷）、 电量、形状和大小不同，在电场中受到的作用 力大小、方向、阻力不同，导致不同蛋白质在 电场中的运动方向和运动速度不同。
思考：蛋白质为什么带有电荷？
在一定的PH下，蛋白质可解离的基团会带上电荷 2）影响蛋白质分子运动速度的因素
就可以制得（ 在不同PH范围内 ）使用的 缓冲液。
思考：说出人体血液中缓冲对。
NaH2PO4 / Na2HPO4
H2CO3 / NaHCO3
血红蛋白的提取与分离
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思考：在血红蛋白整个实验室中用的缓冲 液是什么？它的目的是什么？
使用的是磷酸缓冲液，目的是利用缓冲 液模拟细胞内的PH环境，保证血红蛋白 的正常结构和功能，便于观察（红色） 和材料的科学研究（活性）
高的操作压下，用300ml的20mmol/l的磷酸缓冲
液（pH为7.0）充分（ 洗涤平衡 ）12小时。
注意液面不要低于凝胶表面，否则可能有 气泡混入，影响液体在柱内的流动与最终 生物大分子物质的分离效果。不能发生洗 脱液流干，露出凝胶颗粒的现象，否则重 新填装。
血红蛋白的提取与分离
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3）样品加入与洗脱
(1)红细胞的洗涤
①目的：去除（ 杂质蛋白 ） ②方法：（ 低速短时间 ）离心（速度越 高和时间越长会使白细胞和淋巴细胞等一 同沉淀达不到分离的效果），然后用胶头 吸管吸出上层透明的（黄色血浆），将下 层（ 暗红色）的红血红细蛋白的胞提取液与分离体倒入（烧杯）20
再加入用（ 五倍体积）的（ 生理盐水） 质量分数为0.9％的氯化钠溶液洗涤 ⑤低速离心（低速短时间）