基因工程2

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2基因工程的酶学基础

2基因工程的酶学基础

GCGC NarI BsaHI
GGCC
BbeI HaeII XbaI Bcl I
FspI
ApaI BanII
Bsp1286
T****A T****A NruI T****A T****A
EaeI MscI
GTAC **** **** **** **** A****T A****T A****T A****T A****T
② 不完全同裂酶: 识别位点相同,但切点不同。 如Xma I 和 Sma I。
Xma I
Sma I
5’-CCCGGG -3’ 3’-GGGCCC-5’ 5’-CCCGGG-3’ 3’-GGGCCC-5’
(6)同尾酶(Isocaudamers)
识别的序列不同,但能切出相同的粘性末 端。如BamH I、Bgl Ⅱ、Bcl I、Xho Ⅱ等
核酸限制性内切酶的类型及主要特性
特性 I类内切酶 II类内切酶 III类内切酶
限制和修饰 单一多功能的酶 活性 内切酶和甲基 共同亚基的双 化酶分开 功能酶
内切酶的蛋 3种不同的亚基 白结构 限制作用所 ATP、 Mg2+和SAM 需要的辅助 因子 寄主特异性 EcoB: 位点识别序 TGA(N)8TGCT 列 EcoK: AAC(N)6GTGC
BamH I Bgl Ⅱ
Bcl I Xho Ⅱ
5’-GGATCC-3’ 3’-CCTAGG-5’
5’-AGATCT-3’ 3’-TCTAGA-5’ 5’-TGATCA-3’ 3’-ACTAGT-5’ 5’-UGATCY-3’ 3’-YCTAGU-5’
U代表嘌呤;Y代表嘧啶。
Sau 3A
BfaI
DpnI
HinpI
HaeIII HhaI

基因2-基因工程制药

基因2-基因工程制药

需要40单位胰岛素,因此远远不能满足需要。
我的胰腺拿走
可是, 还不够 啊
怎么办呢?
基因工程技术问世 科学家的设想
找到合适的大肠杆菌
找到人胰岛素基因
把胰岛素基因转入到大肠杆菌的细胞中
现代科学家们进一步设想,将胰岛素基因移植到糖尿病患者体内 的有关细胞中,让新移入的基因来指挥细胞生产机体所需要的胰 岛素,若成功,糖尿病人就不用象现在这样天天注射胰岛素了。
日本基因工程药物的年销售额也高达几千亿日元。
我国基因工程药物数量少、市场规模仍然十分有限。
用基因工程技术生产的人类蛋白质药物
蛋白质名称 用 途
促肾上腺皮质激素(adrenocorticotrophic hormone) 治疗风湿(rheumatic disease) B细胞生长因子(B-cell growth factor) 治疗免疫系统功能失调 降钙素(calcitonin) 治疗软骨病(osteomalacia) 集落刺激因子(colony stimulating factor) 治疗血液病、肿瘤辅助治疗 绒毛膜促性腺激素(chorionic gonadotropin) 治疗不排卵症 内啡肽和脑啡肽(endorphine and enkephalin) 镇痛剂(analgesic agent) 上皮生长因子(epidermal growth factor) 促进伤口愈合 红细胞生成素(erythropoietin) 治疗贫血(anemia) 凝血因子Ⅷ(factor Ⅷ) 治疗血友病(hemophilia) 凝血因子Ⅸ(factor Ⅸ) 治疗血友病 生长激素(growth hormone) 促进生长 生长激素释放因子(growth hormone releasing factor) 促进生长 胰岛素(insulin) 治疗糖尿病(diabetes) 干扰素(interferon) 抗病毒抗肿瘤 白细胞介素(interleukin) 治疗癌症

高中生物4章基因工程2节基因工程的操作程序2课时目的基因的导入和检测

高中生物4章基因工程2节基因工程的操作程序2课时目的基因的导入和检测

第2课时目的基因的导入和检测[目标导读] 1.结合教材P77~81图文,阐明目的基因的导入的四种方法。

2.分析教材P81~83内容,掌握目的基因的检测与表达产物的测定。

[重难点击] 1.目的基因的导入方法。

2.目的基因的检测与表达产物测定的原理方法。

方式一通过前面的学习,我们了解了基因工程中目的基因的获取和基因表达载体的构建。

在目的基因与载体连接成重组DNA分子以后,下面的重要工作主要是将其导入受体细胞进行扩增和筛选,获得大量的重组DNA分子,这就是外源基因的无性繁殖,即克隆(cloning)。

方式二目的基因导入受体细胞后,是否可以稳定维持和表达其遗传特性,只有通过检测与鉴定才能知道。

这是基因工程的第四步工作。

以上步骤完成后,在全部的受体细胞中,真正能够摄入重组DNA分子的受体细胞是很少的。

因此,必须通过一定的手段对受体细胞中是否导入了目的基因进行检测。

检测的方法有很多种,例如,大肠杆菌的某种质粒具有青霉素抗性基因,当这种质粒与外源DNA组合在一起形成重组质粒,并被转入受体细胞后,就可以根据受体细胞是否具有青霉素抗性来判断受体细胞是否获得了目的基因。

重组DNA分子进入受体细胞后,受体细胞必须表现出特定的性状,才能说明目的基因完成了表达过程。

一、目的基因的导入1.花粉管通道法(如图)(1)概念:是指外源基因利用植物受精后花粉萌发形成的花粉管通道进入受体细胞,借助天然的种胚系统形成含有目的基因的种胚。

常用的两种方法有柱头滴加法和花粉粒携带法。

(2)实验:利用花粉管通道法将目的基因导入棉花的实验操作程序①原理:授粉后使外源DNA能沿着花粉管通道渗入,经过珠心通道进入胚囊,转化尚不具备正常细胞壁的卵细胞、合子或早期胚胎细胞。

②操作过程a.提取含有目的基因的总DNA或者质粒DNA,配成质量分数为0.01%的溶液。

b.用棉线捆住将要在第二天开花的花朵,不让花朵自动开放。

c.第二天清晨给花朵进行人工授粉,授粉后套袋,作好标记。

基因工程2

基因工程2

方法 DNA分子杂交法
分子 水平
目的基因是否转录 DNA-RNA分子杂交法 目的基因是否翻译
抗原-抗体杂交法 接种实验
个体 ห้องสมุดไป่ตู้平
受体是否具有 转基因特征
步骤五:实现功能表达
DNA分子杂交
步骤五:实现功能表达
基因探针,是一段带有检测标记,且序
列已知的,与目的基因互补的核酸序列。 基因探针通过分子杂交与目的基因结合, 产生杂交信号,能从浩翰的基因组中把目的 基因显示出来。
步骤一:获取目的基因
基因工程的目的基因-- 从供体转移到受体的基因。
与生物抗逆性相关的基因 与优良品质相关的基因 与生物药物和保健品相关的基因 与毒物降解相关的基因
与工业所需酶相关的基因
具有调控作用的因子 ……
步骤一:获取目的基因 • 目的基因的提取方法
直接分离基因 :鸟枪法(散弹射击法)
步骤三:转化受体细胞 • 常用的受体细胞: 有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、 酵母菌和动植物细胞等。 • 将目的基因导入受体细胞的原理 借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。
步骤三:转化受体细胞
植物细胞
受体 细胞
动物细胞 原核细胞
农杆菌转化法 基因枪法 花粉管通道法
显微注射技术
感受态法
步骤三:转化受体细胞
步骤一:获取目的基因 • 哪些新技术能大大简化基因工程的操作技术? 1)DNA合成仪: 对比较小,核苷酸序 列已知的基因用化学方 法直接人工合成。 2)PCR技术: 使目的基因的片段 在短时间内成百万倍 地扩增。
PCR扩增仪
DNA合成仪
步骤一:获取目的基因基因 • 上述三种目的基因提取的方法有何优缺点?
优点 缺点 工作量大,盲目,分 离出来的有时并非一 个基因 操作过程麻烦,mRNA 很不稳定,要求的技 术条件较高 操作简便 广泛使用 专一性强

基因工程(第二章答案)

基因工程(第二章答案)

第二章基因工程工具酶一、解释下列名词1.Restriction and modification(限制与修饰)宿主特异性地降解外源遗传物质(DNA)的现象称为限制。

外源遗传物质通过甲基化等作用避免宿主的限制作用称为修饰。

2. Matched ends(or cohesive end)(匹配末端或粘性末端)识别位点为回文对称结构的序列,经限制酶切割后,产生的相同的,互补的末端称为匹配粘端,亦即粘性末端3. Blunt ends平末端。

在回文对称轴上同时切割DNA 的两条链,产生的没有碱基突出的末端称为平末端。

4. Star activity星星活性。

在极端非标准条件下,限制酶能切割与识别序列相似的序列,这个改变的特殊性称星星活性。

5. Klenow fragment Klenow 片段。

Klenow DNA 聚合酶是E.coli DNA polymerase 经蛋白酶(枯草杆菌蛋白酶)裂解而从全酶中除去5'--3' 外切活性的多肽大片段,而聚合活性和3'--5' 外切活性不受影响。

6.Reverse transcriptase反转录酶。

即依赖于RNA 的DNA 聚合酶,它有5'--3' 合成DNA 活性,但是无3'--5' 外切活性。

7.Terminal transferase(末端转移酶)8.Ligase连接酶。

催化DNA 5' 磷酸基与3' 羟基之间形成磷酸二酯键,将两段核酸连接起来的酶。

9.T4 polynucleotide kinase(T4多聚核苷酸激酶)催化ATP 的γ-磷酸基转移至DNA 或RNA 的5' 末端。

10.Alkaline phosphatase(碱性磷酸酶)催化除去DNA 或RNA 5' 磷酸11.S1 nuclease Sl 核酸酶。

可降解单链DNA 或RNA ,产生带5' 磷酸的单核苷酸或寡核苷酸双链;对dsDNA ,dsRNA ,DNA:RNA 杂交体不敏感。

第二节基因工程及其应用ppt课件

第二节基因工程及其应用ppt课件
2)用同一种限制酶切断目的基因,使 其产生相同的黏性末端。
3)将切下的目的基因片段插入质粒的 切口处,再加入适量DNA连接酶,形成了 一个重组DNA分子(重组质粒)
目的基因与运载体的结合过程,实 际上是不同来源的基因重组的过程。
(三)基因操作的基本步骤 • 步骤三:目的基因导入受体细胞
• 常用的受体细胞: 有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、
酵母菌和动植物细胞等。 • 将目的基因导入受体细胞的原理
借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。
(三)基因操作的基本步骤 • 步骤四:目的基因的检测和表达
氨苄青霉 素抗性基因
四环素 抗性基因
(三)基因操作的基本步骤
• 受体细胞摄入DNA分子后就说明目3)有关基因工程的叙述中,错误的是( A)
A、DNA连接酶将黏性末端的碱基对连接起来 B、 限制性内切酶用于目的基因的获得 C、目的基因须由运载体导入受体细胞 D、 人工合成目的基因不用限制性内切酶
参考资源:
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思维拓展
有人认为,转基因新产品也是一把双刃 剑,犹如水能载舟,亦能覆舟,甚至带来 灾难性的后果,你是否同意这一观点?举 例说明。
转黄瓜抗青枯病基因的甜椒 转黄瓜抗青枯病基因的马铃薯
转鱼抗寒基 因的番茄
不会引起过敏的转基因大豆
转基因龙胆花色奇异
转基因蓝猪耳改变花色
转基因牵牛花改变了花色
A:紫外光照射下的转 绿色荧光蛋白的 Eustoma (Lisianthus) 花。
B:转没有绿色荧光 蛋白的空质粒的花,
会发光的转基因鱼
最常用的质粒是大肠杆 菌的质粒,其中常含有抗药 基因,如四环素的标记基因。
质粒的存在与否对宿主细 胞生存没有决定性作用,但 复制只能在宿主细胞内成。

高中生物高考考点81 基因工程(二)-备战2022年高考生物考点一遍过

高中生物高考考点81 基因工程(二)-备战2022年高考生物考点一遍过

1.基因工程的操作过程与应用(1)基因工程的操作步骤(2)基因工程的应用:培育转基因植物和转基因动物,生产基因工程药物,进行基因治疗。

(3)目的基因导入不同受体细胞的过程生物种类植物动物微生物常用方法农杆菌转化法显微注射技术感受态细胞法受体细胞体细胞或受精卵受精卵原核细胞转化过程将目的基因插入到Ti质粒的T-DNA上→农杆菌→导入植物细胞→整合将含有目的基因的表达载体提纯→取卵(受精卵)→显微注射→受Ca2+处理细胞→感受态细胞→重组表达载体DNA分子与感受态细胞到受体细胞染色体的DNA上→表达精卵发育→获得具有新性状的动物混合→感受态细胞吸收DNA分子(4)基因治疗与基因诊断的不同点原理操作过程进展基因治疗基因表达利用正常基因导入有基因缺陷的细胞中,以表达出正常性状来治疗(疾病)临床实验基因诊断碱基互补配对制作特定DNA探针与病人样品DNA混合,分析杂交带情况临床应用2.蛋白质工程(1)流程图写出流程图中字母代表的含义:A.转录,B.翻译,C.分子设计,D.多肽链,E.预期功能。

(2)结果:改造了现有蛋白质或制造出新的蛋白质。

(3)应用:主要集中应用于对现有蛋白质进行改造,改良生物性状。

学科&网考向一目的基因的获取及基因表达载体的构建1.利用基因工程技术可使大肠杆菌生产人的胰岛素,下列相关叙述正确的是A.人和大肠杆菌在合成胰岛素时,转录和翻译的场所都是相同的B.所有的限制酶都只能识别同一种特定的核苷酸序列C.通过检测,大肠杆菌中没有胰岛素产生则可判断重组质粒未导入受体菌D.选用大肠杆菌作为受体细胞主要原因是繁殖快、易培养、产量高【参考答案】D【试题解析】人是真核生物,大肠杆菌是原核生物,真核细胞转录在细胞核内,原核细胞在拟核中,A 错误;不同的限制酶识别不同的核苷酸序列,B错误;通过检测,大肠杆菌中没有胰岛素产生则可判断重组质粒未导入受体菌或虽已导入受体,但没有表达,C错误;D.利用基因工程技术可使大肠杆菌生产人的胰岛素时,选用大肠杆菌作为受体细胞主要原因是繁殖快、易培养、产量高,D正确。

基因工程2 基因工程的基础知识

基因工程2 基因工程的基础知识

来的实验所证明。
2.2.1 DNA复制的起始点和方向
• DNA的两条链在复制起始点(origin)分开形成复制 叉(replication fork),随着复制叉的移动完成 DNA的复制过程。细胞内存在着能识别起始点的特 种蛋白质。
• DNA复制可以朝一个方向,也可以朝两个相反的方
向进行行复制。
• 真核生物染色体DNA的不同位置上有多个复制起
始点,同时开始的双向复制形成多个复制泡或
复制眼。DNA的这种能独立复制的单位称为复制 子。 • 原核DNA 构成一个复制子,而真核DNA有多个复 制子。
2.2.2 DNA复制的要点:
1)复制是半保留的; 2)复制起始于细菌或病毒DNA的特定位置,真核生物有多 个复制起始点; 3)复制可以朝一个方向,也可以双向进行,后者更为常见; 4)复制时,DNA的两条链都从5’端向3’端延伸; 5)复制是半不连续的,前导链连续合成,滞后链不连续合成, 即先合成冈崎片 段,再连接成滞后链; 6)冈崎片段的合成始于一小段RNA引物,该引物以后被 DNA聚合酶I切除,缺口由脱氧核甘酸填补后再与新生的DNA 链相连; 7)复制有多种机制。
碱基的配对规律:A-T, T-A, G-C, C-G。
A和T间构成二个氢键,G和C间构成三个氢键。如果
一条链的碱基顺序已确定,则另一条链必有相对应的碱
基顺序。 DNA是遗传信息的载体,它的核苷酸序列不仅编码 各种蛋白质,并且也与基因表达的调控有关,即它们能 为一些蛋白质因子所识别和结合。现在认为这一过程主
DNA的一级结构: 由A、T、G、C四种脱氧核苷酸通过3’-5’-磷 酸二酯键连接成的线形结构(排列顺序)。
DNA一级结构的意义: • 蕴藏遗传信息 • 决定DNA的二级结构和空间结构

基因工程-2

基因工程-2
31
lacZ(lacZα)中含有多克隆位点,当无外源DNA片段插入 时,质粒表达β—半乳糖苷酶的α-肽,与缺失突变体宿主菌 (不能编码α-肽)表达的lacZ基因产物( β链)互补,产生 有活性的β—半乳糖苷酶,在含有指示剂X-gal和诱导剂 IPTG的存在下,菌落呈现兰色;外源基因的插入后,破坏 了lacZ α-肽基因的结构,细菌内不能产生β—半乳糖苷酶活 性,菌落呈白色。 32
22
23
4、质粒复制特性
• 双向复制 从oriV ,如大肠杆菌 的F-质粒
24
滚环式复制: 单向复制,从 ori开始,结 束于ori
25
4、质粒改造构建
天然质粒往往存在不同程度的缺陷,因而不适合用作 基因工程的载体必须对之进行改造构建: (1)具有复制起始点
具有复制子的功能,且起始区域没有所需的酶切位点。 (2)加入合适的选择标记基因 如两个以上,易于用作选择。
51
野生型λ-DNA上约有40-50%的片段是 复制和裂解所非必需的。被切除后,不影响 生命功能。 根据切除的多少,可将λ-DNA分成两大 类载体: • 插入型载体 • 取代型载体
52
插入型载体
λDNA中缺失部分非必要基因,只含有一个供外源基因插
入的酶切位点的λDNA载体。
由于该类载体重组与否均可包装,因而为区分重 组子与非重组子必须携带标记基因。 53
17
质粒的不相容性:分子机制
两种含有相似复制子结构的不同质粒,在
复制时受到同一种拷贝数控制系统的干扰,在
复制和分配到子细胞时存在竞争,致使两种质 粒的最终拷贝数不同。
18
19
两种含有不同复制子结构的不同质粒,在 复制时各受自己的拷贝数控制系统的调节,致

人教版高中生物选择性必修第3册 (基因工程) 基因工程(2)教案

人教版高中生物选择性必修第3册 (基因工程) 基因工程(2)教案
小结:总结整个课时的流程图。
联系实际案例,思考PCR在多方面的应用。
教案
教学基本信息
课题
PCR技术及其应用
学科
生物学
学段:高中
年级
二年级
教材
书名:《选修3现代生物科技专题》出版社:人民教育出版社
出版日期:2月
教学目标及教学重点、难点
教学目标:
1.通过分析实验室中进行PCR操作加入的各种成分,总结说出PCR所需要的引物、模板、酶、能量、原料和产物,能分析说明PCR成功的关键在于设计特异性引物,渗透科学思维。
教学过程(表格描述)
教学环节
主要教学活动
设置意图
导入:催生PCR技术的科研背景
简单介绍PCR的发明者,卡尔·穆利斯(Kary Mullis,1944-)生平。
很多生化学家都认为,PCR技术的获奖,大大地提高了诺奖本身的含金量。生物学可以分为两个时代,一个是没有PCR,一个是有PCR。
通过发明者的故事引入,简单明了,引发兴趣。
2.能根据视频直观体会并能概述出PCR的操作过程,并自主画出三个循环的示意图,进一步培养科学素养和科学思维。
3.分析具体的案例或例题,能够举例说明PCR的应用,并体会PCR发明者及应用中人类的智慧,体会PCR技术在现代分子生物学中的重要地位,体现社会责任感和生命观念的教育。
教学重点:PCR的过程。
教学难点:1.特异性引物的设计。2.PCR的过程。
一个循环:变性-退火-延伸。
请同学们观看视频,尝试画出PCR的三个循环过程。同时思考并回答下列问题:
1.几个循环后会出现一个目的基因的短片段?2.理论上讲,n个循环后,会出现多少个DNA分子?
例题2:引物的选择。
例题3:PCR的基本操作。

基因工程实验2:质粒DNA的酶切及电泳鉴定

基因工程实验2:质粒DNA的酶切及电泳鉴定

• 星号活力*
二、实验原理——琼脂糖凝胶电泳
• 1、琼脂糖凝胶
• 琼脂糖加热溶解后冷却,形成孔径结构,成为良好的电泳 介质。其孔径大小由琼脂糖的浓度决定。
• 浓度越高,孔隙越小,其分辨能力也就越强; • 琼脂糖凝胶分辨DNA片段的范围为0.2 kb~50 kb之间,常 用0.3%~2%浓度的琼脂糖凝胶,可分辨300 bp~5000 bp 的DNA片段。 • 低熔点(LMP)琼脂糖,熔点为62℃~65℃的琼脂衍生物, 一旦熔解,可在37℃下持续保持液体状态达数小时之久, 在25℃下也可持续保持液体状态约10分钟。LMP琼脂糖 可用来回收DNA分子,用于DNA片段的制备电泳。
四、实验步骤
• 1、质粒DNA的酶解(单酶切)
EcoR I 酶切位点:G’ AATTC
2、琼脂糖凝胶电泳
1、 0.8%琼脂糖凝胶的制备:称取0.16 g琼脂糖,置于锥形 瓶中,加入20 mL 0.5*TBE稀释液。(一个制胶板的量) 加热直至琼脂糖溶解。摇匀,冷却至60℃(不烫手),加 入溴化乙锭1μL (终浓度0.5 μg/mL)充分摇匀。 2、胶板的制备: 取有机玻璃内槽,洗净(注意保护电极丝)、晾干。 将有机玻璃内槽置于一水平位置,插好梳子。 将冷却至60℃左右的琼脂糖凝胶液,小心地倒在有机玻璃 内槽上,注意排气泡,使整个有机玻璃板表面形成均匀的胶 层。室温下静置,待凝固完全后,轻轻垂直拔出梳子。 用滴管将样品槽内注满TBE稀释液以防止干裂。制备好胶 板后将铺胶的有机玻璃内槽放在电泳槽中使用。 3、加样(见下表)
•(5)电泳缓冲液 •目前有3种缓冲液适用于天然双链DNA的电泳:TAE、TBE和 TPE •(6)EB
三、实验材料
• 1、仪器和材料 • 电泳仪,电泳槽,制胶板,锥形瓶(100 mL或 50 mL),紫外检测仪/凝胶成像系统,一次性 手套,Ep管,取液器及无菌吸头,水浴锅 • 2、试剂 • (1) 质粒pMD18-T DNA • (2) DL2000 Plus • (3) EcoRI酶 (EcoRI酶解反应缓冲液10×) • (4) 琼脂糖 • (5) 溴乙锭(10 mg/mL贮藏液) • (6) TBE缓冲液(0.5×) • (7) 酶反应终止液(10×)

基因工程-2(3)分子的杂交

基因工程-2(3)分子的杂交

1.1杂种核酸分子
彼此退火的核酸来自不同的生物有机体,而形成 的双链分子。 DNA/DNA的杂交作用:检测特定生物有机体之间 的亲源关系 DNA/DNA或RNA/DNA的能力,揭示核酸片断中某种 特定基因的位置。
1.2核酸杂交的类型
按其分子种类划分
1) DNA杂交—探针为DNA或RNA 2) RNA杂交—探针为DNA或cDNA
第一章 基因工程的主要技术原理 第三节 核酸的分子杂交
1 核酸分子杂交技术
1968年由华盛顿卡内基学院(Cavnegie Institute of Washington)的Roy Britten及其 同事发明的。 原理:带有互补的特定核苷酸序列的单链DNA或 RNA,当它们混合在一起时,其相应的同源区段将 会退火形成双链的结构。
3MM滤纸
iv. 真空转移法 (Vaccum bllotting )
转移速度与凝胶的速度和厚度成反比,在相同转移率 (50%)时,真空法比毛细管法快13倍,其损失仅6%,而毛 细管法损失率20%。
v. 各种转移方法的比较
i) 扩散法和毛细管法:操作简便,不需要特殊转移仪器, 但转移效率低,(扩散法为70%,毛细管法80%)耗时多。 ii) 电转移法:效率高,耗时少,需特殊转移仪,对转移条 件要求较严。 iii) 真空转移法:效率高,耗时最少,需特殊真空转移仪。

2)斑点杂交(dot hybridization) 先分离DNA,RNA或蛋白质,然后将样品液直接 点在固体基质上进行杂交,不能测定分子量大小。
3)转移杂交或印迹杂交(blotting
hybridization)
先纯化样品,然后使不同大小的分子在凝胶上分离,转移 到固体基质上,与探针杂交。该法可检测出感兴趣分子的 分子量。用于转移的方法有: i. 扩散法 ii. 毛细管法 iii. 电泳转移法 iv. 真空转移法

2基因工程的基本操作程序

2基因工程的基本操作程序
基因的功能 基因在染色体上的位置 基因的转录产物mRNA 基因翻译产物NA B、线粒体DNA
C、总mRNA
D、tRN的许多DNA片段,导入某个
c、延伸(70℃-75℃):在Taq酶的作用下, 合成与模板互补的__D_N__A_链__。
3、人工合成法:
基因较小,核苷酸序列已知,可以 利用DNA合成仪人工合成
1、原核细胞的基因结构
非编码区 编码区上游
启动子
编码区
非编码区
编码区下游 终止子
与RNA聚合酶结合位点
启动子:位于基因的首端的一段特殊的DNA片断, 它是RNA聚合酶识别和结合的部位,有了它才能 驱动基因转录出mRNA,最终获得蛋白质库叫做基因组文

D、含有一种生物的一部分基因的基因叫cDNA2、利用PCR技术扩增目的基因
(2)利用PCR技术扩增目的基因
PCR——聚合酶链式反应 是一项生物体外复制特定DNA片
段的核酸合成技术。 通过此技术,可获取大量的目的基因。
A、限制酶只在获得目的基因时才用
B、重组质粒的形成在细胞内完成
C、质粒都可作为运载体
D、蛋白质的结构可为合成目的基因提供 资料
5)基因工程是在DNA分子水平上进行设计
施工的。在基因操作的基本步骤中,不进行
碱基互补配对的步骤是
( C)
A、人工合成目的基因
B、目的基因与运载体结合
C、将目的基因导入受体细胞
PCR技术
原理: DNA复制
前提:
一段已知目的基因的核苷酸序列
原料
模板DNA; DNA引物; 四种脱氧核苷酸;
热稳定DNA聚合酶(Taq酶)
PCR扩增仪
方式
:以__指数___方式扩增,

基因工程2

基因工程2
四、PC R 的基本反应过程包括哪些?反应体系需要什么条件?(10 分)
PC R 的基本反应过程包括:变性、退火、延伸三个阶段。(5分)
需要具备的反应条件包括:a、被分离的目的基因两条链各一端序列相互补的
D NA 引物(约20 个碱基左右)。b、具有热稳定性的酶如:T a g DN A 聚合酶。c、
6、RT -PC R :先用逆转录酶作用于m RN A ,以寡聚dT 为引物合成c D NA 第一链,然后用已知一对引物,扩增嵌合分子,这种方法称为逆转录PC R
7、I n s e r t i na c t i on :即插入失活,基因工程载体上的某些选择标记基因常常含某种或某几种限制性内切酶的单一酶切位点,在该位点用相应的限制性内切酶处理,并将外源D NA 片段插入该位点,则插入的外源D NA 片段将破坏原有基因的读码框,往往导致原有的选择标记基因无法翻译表达,或即使翻译表达,形成的也是丧失了原有生物活性的蛋白质,这一现象称为插入失活。
27 .基因敲除:基因敲除是向正常生物个体内引入某个突变的基因位点而选择性地使某特定基因功能失活的技术.
28 .载体:v e c to r ,能在连接酶的作用下和外源D NA 片段连接并运送D NA 分子进入受体细胞的D NA 分子。
29 .不相容性:i nc om pa t i bi l it y ,是指在没有选择压力的情况下,两种亲缘关系密切的不同质粒不能共存于同一宿主细胞内。
⑶D NA 的甲基化程度。
⑷酶切反应的温度与时间。
⑸D NA 分子的构型。
⑹限制性核酸内切酶的反应缓冲液。
四、问答题
1试述5′R AC E 技术原理和方法
PC R 用于扩增代表mR NA 转录物某一单位点与其3′或5′末端之间区域的部

2基因工程-工具酶

2基因工程-工具酶
酶 HindIII Sma I 最适温度oC 37 25 酶 Apy I BstE II 最适温度oC 30 60 酶 Ban I BsmBI 最适温度oC 50 55



4.DNA的分子结构: DNA分子的不同构型对限制性内切酶的活性也有很大的影 响。某些限制性核酸内切酶切割超螺旋的质粒DNA所需要的酶量要比消化线性 的DNA量高出很多倍。 5.缓冲液:影响限制酶活性的重要因素。商品化的限制酶一般都带有专用缓 冲液。化学组成中MgCl2、NaCl/KCl提供Mg2+和离子强度;Tris-HCl维持pH; 二硫苏糖醇(DTT)保持酶稳定性;牛血清白蛋白BSA等有助于酶的稳定。

限制性核酸内切酶(restriction endonuclease):识别并切割特异的双链
DNA序列的一种内切核酸酶。[单位定义]在指明pH与37℃,在0.05mL反应混合 物中,1小时消化1μg的λDNA的酶量为1单位。
命名:限制酶由三部分构成,即菌种名、菌系编号、分离顺序。
第1个字母取自产生该酶的细菌属名,大写 第2,3二个字母取自它来源细菌的种名的头2个字 母,小写 第4个字母代表株,小写 最后用大写罗马数字,代表同一菌株中不同限制 酶的编号

8 个碱基识别位点:NotⅠ GC↓GGCCGC
以上序列中部分字母代表的碱基如下:

R=A或G;Y=C或T;M=A或C;K=G或T;S=C或G;W=A或T H=A或C或T;B=C或G或T;V=A或C或G;D=A或G或T;N=A或C或G或T
特性
限制和修饰活性 内切酶的蛋白结构 限制作用所需要的 辅助因子 宿主特异性识别 切割位点 酶催转换 DNA易位作用 甲基化作用的位点 识别未甲基化的序 列进行切割 序列特异的切割 基因工程中的用途

基因工程2简答题

基因工程2简答题

一、名词解释:载体:在基因工程操作中,把能携带外源DNA进入受体细胞的DNA分子。

多克隆位点(MCS):指载体上人工合成的含有紧密排列的多种限制性核酸内切酶酶切位点的DNA片段。

COS位点:当λDNA进入细菌细胞后,便迅速通过黏性末端配对形成双链环状的DNA分子,这种由黏性末端结合形成的双链区段称为cos位点。

PCR技术:是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法。

是利用两种寡核苷酸引物,分别与双链DNA片段的两端互补,形成DNA聚合酶反应中的模板和引物的关系,这是PCR技术的核心。

PCR聚合酶反应体系的一些重要条件包括:模板、一对寡核苷酸引物、4种底物dNTP和Tap DNA 聚合酶。

反应分为3步:双链模板DNA变性、退火和链的延伸。

1 U 核酸内切酶的酶活性:在最佳反应条件下反应1 小时,完全水解1 mg 标准DNA所需的酶量。

同S-D序列:含有一个启始密码子和一段同核糖体16SRNA3’末端碱基互补的序列。

原噬菌体:整合到细菌染色体的噬菌体DNA称为原噬菌体,随细菌的染色体复制而复制。

粘性末端:当一种限制性内切酶在一个特异性的碱基序列处切断DNA时,就可在切口处留下几个未配对的核苷酸片断,即5’突出。

这些片断可以通过重叠的5‘末端形成的氢键相连,或者通过分子内反应环化。

因此称这些片断具有粘性,叫做粘性末端。

平头末端:当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时,切开的DNA两条单链的切口是平整的,这样的切口叫平末端。

同位酶:指来源于不同微生物的酶,能识别相同的序列,切割方式不同或相同,这些酶称为~。

同裂酶:指能识别位点与切割位点均相同的不同来源的酶称为~。

同尾酶:指来源和识别序列均各不相同,但切割后产生相同的粘性末端的酶,称为~。

启动子:指一段可以被RNA聚合酶识别,并使基因进行转录的DNA序列。

终止子:指给予RNA聚合酶转录终止信号的DNA序列。

信号肽:质粒(plasmid):指独立于染色体以外的能自主复制的双链闭合环状DNA分子。

2 基因工程的酶学基础

2 基因工程的酶学基础

14
2. Ⅲ型限制性内切酶
识别序列与切割位点不相一致
切割位点相对固定 反应需要ATP、 Mg2+和SAM(S-腺苷蛋氨酸)。
EcoP1: AGACC EcoP限制性内切酶的基本特性
识别双链DNA分子中4 - 8对碱基的特定序列
大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧识别切割(一致) 序列呈典型的旋转对称型回文结构
酶催转换 DNA易位作用
甲基化作用的位点 寄主特异性位点 寄主特异性 寄主特异性 位点 位点 识别未甲基化的序 能 列进行切割 序列特异的切割 不是

是 十分有用

是 用处不大
37
基因工程中的用途 无用
四、限制性内切酶酶解反应条件 1. 标准酶解体系的建立
识别位点处
切开双链DNA,形成粘性末端(sticky end)或 平齐末端(blunt end)。如:
EcoR I 5’-GAATTC-3’
3’-CTTAAG-5’
EcoR V
5’-GATATC-3’ 3’-CTATAG-5’ 产生平齐末端
Pst I
5’-CTGCAG-3’ 3’-GACGTC-5’
Bgl Ⅱ
29
Sau 3A
[7] 限制酶的酶活性
限制性内切酶的识别和酶切活性一般在一定的
温度、离子强度、pH等条件下才表现最佳切割
能力和位点的专一性。
所以一般使用专一的反应缓冲液。 ① 星号(*)活性
如果改变反应条件就会影响酶的专一性和切割 效率,称为星号(*)活性。
30
使用的时候要特别注意!
EcoR I和BamH I等都有*活性。
7
4. 如果酶存在于一种特殊的菌株中,则将该菌株

基因工程-2-载体ppt课件

基因工程-2-载体ppt课件
③易操作,id)
1.柯斯载体的组成
由质粒和λ粘性末端“尾巴”两部分组成。
2.柯斯载体的特点
① 带有抗药性标记 ② 带有质粒的复制起始点 ③ 带有多个限制酶的单一切点 ④ 带有λ噬菌体粘性末端片段
3.cosmid载体的优点
insert) form URA3 auxotrophy selectable marker (yeast) yeast centromeric sequence ARS1 yeast origin of replication
第二节 噬菌体载体
一、 λ噬菌体载体
1. λ噬菌体结构特点: ①线性双链DNA分子 ②可在E.coli中大量繁殖 ③具非必需区(约1/3长度) ④两端具12个核苷酸单链互补粘性末端
⑷ 建立λDNA的体外包装。
噬菌体的包装过程
主要外壳蛋白质 是基因E的产物
连环DNA
头部前体
基因A的产物在cos 位点切割噬菌体 DNA
基因W和FII 的产物组装 蛋白质加完 包含在外壳中的 整的尾部 基因D的产物
λDNA的体外包装
头部基因 (琥珀突变型)
转录复制 蛋白质合成
体外包装的重组DNA比裸 露的DNA导入受体细胞的 效率高100-10000倍
2.酵母菌质粒载体的特点
①含有E.coli质粒的复制起始序列。
②含有酵母的筛选标记(如LEU2) ③具有合适的供外源基因插入的限制酶切割位点。
④酵母菌稳定型质粒载体
着丝粒
Type bacterial origin promoter selectable marker
selectable marker
一 基因工程的基本元件 ------载体
质粒载体
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A T O P O
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A T G O O P O P O T O P
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A
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U A O O P O P O
Teamwork 1 scores / 团队竞赛1 得分表
One letter words Team 1 7 Team 2 8 Team 3 8 Team 4 6 Team 5 5 Team 6 8 Team 7 7 Team 8 10 ?
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Two letter words
Three letter words
3’
O A
G O P O P O O P O T O P
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U A O O P P O O
5’
C G
U A O O P P O O
A T O P O P
G C O P O P
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OH
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P P P O A
C
5’
3’
O O O O O P O P O P O P O P OH
U A O O P O P O
A5 → Transcription can be terminated in two ways 转录能以两种方式终止
Intrinsic termination / 内在型终止
ρ-dependent termination / ρ依赖型终止
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Questions for Lecture 6
α σ
β’ β α
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A4 → Transcription errors can be corrected in two ways 有两种方式可以用来纠正转录错误
Pyrophosphorolytic editing 焦磷酸化编辑
3’
O
Hydrolytic editing 1 水解编辑(1)
Score 95 100 100 90 85 100 95 100
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Team members / 团队成员
Team 1 朱琳颖、潘薇、王芳、侯莎莎、张歌奕 Team 2 张琴、吴又琼、张静华、马红、郭春燕 Team 3 陈亚志、汪晓云、沈晓丹、曹婷婷、丁娣
Team 4 张若花、杨芳、赵宝林、李博中、张欣
Condition A
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Regulation of gene expression 基因表达调控
Condition B
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3.3.1 Coordinate Regulation 协同调控
Coordinate regulation: Transcriptional regulation in which a set of genes are regulated together.
Q1 → How can E. coli survive when there is only lactose ?
只有乳糖时大肠杆菌如何生存呢?
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Vocabulary of Lecture 6 (1/2)
gene expression coordinate regulation polycistronic mRNA cistron operon operator lactose galactose permease galactosidase
22 / 45 Glucose – Lactose –
E. coli: ―I will use lactose only when there is no glucose and there is lactose.‖
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Regulated Expression of Lactose Metabolizing Genes 乳糖代谢基因表达调控
Team 5 汪宇言、彭展鸿、单宝、任新龙、曹洋 Team 6 王泽、傅建军、朱楚楠、夏昌选、赵寒松 Team 7 王斌、唐懿骏、邢兵、陈杰、钱晨明
Team 8 蒋琛、孔培中、王鹏飞
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Lecture 6
Chapter 3 第3章 3.1 为什么使用RNA
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A2 → The player is RNA polymerase ! RNA聚合酶是玩家 !
α σ β’ β α
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A3 → Transcription is initiated at the promoter region. σ subunit of the RNA polymerase is responsible for recognizing the promoter. 转录是从启动子区域起始的,RNA聚合酶的 σ亚基负责识别启动子。
1. Negative Regulation – the lac Repressor 负调控──lac阻遏蛋白 2. Positive Regulation – CAP 正调控──CAP 代谢物激活蛋白
A T O P O
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A T O P O
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A T O P O
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O
Gre
3.1 Why Use an RNA Intermediate?
3.2 Mechanism of Transcription 3.3 Regulation of Gene Expression in Prokaryotes 3.3.1 Coordinate Regulation 3.3.2 The Lac Operon 3.3.3 The Trp Operon 3.3.4 Ara & Gal Operons
5’
P OH A O
P
O A T
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P
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A T O P O G O P O
T
Hydrolytic editing 2 水解编辑(2)
O P
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3’
O P O P O OH P
5’
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P
A
G O P O T O P
5’
5’
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乳糖渗透酶 转乙酰基酶
Β-半乳糖苷酶
E. coli: ―I need lactose permease, β-galactosidase, and transacetylase .‖ 21 / 45
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When to use lactose / 何时利用乳糖
Glucose + Lactose + Glucose – Lactose +
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3.3.2 The lac Operon / 乳糖操纵子
Lac operon: An operon containing genes involved in lactose metabolism. lac操纵子:含有乳糖 (lactose)代谢基因的 操纵子。
Promoter Operator
3.3.1 Coordinate Regulation
3.3.2 The Lac Operon 3.3.3 The Trp Operon 3.3.4 Ara & Gal Operons
3.3.4 阿拉伯糖与
半乳糖操纵子
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Regulation of gene expression 基因表达调控
Lactose 乳糖
CH2OH OH O O OH OH CH2OH O OH
OH OH OH
Glucose 葡萄糖
CH2OH O OH
OH
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E. coli: ―I do not usually eat lactose, but in case when there is no glucose . lacA
The lac operon
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