第二章 基因工程制药 新版4

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《基因工程制药》PPT课件

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一、反转录法
反转录法就是先分离纯化目的基因的 mRNA,再反转录成 cDNA,然后进行 cDNA 的 克隆表达。
cDNA与模板mRNA序列严格互补,而不含内 含子。
cDNA:真核基因经过转录后,经过剪切、拼 接、修饰形成的成熟的mRNA,mRNA反转录的 结果为cDNA。
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第一个合成蛋白质的国家。
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基因工程药物种类
基因工程技术可生产的药物和制剂包括: (1)免疫性蛋白,如各种抗原和单克隆抗体; (2)细胞因子,如各种干扰素,白细胞介素,集
落刺激生长因子,表皮生长因子,凝血因子; (3)激素,如胰岛素,生长激素,心素纳; (4)酶类,如尿激酶,链激酶,葡激酶,组织型纤
50%!
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8
20世纪70年代基因工程诞生最先应 用在医药科学领域。
1982年第一个基因工程产品--人胰 岛素在美国问世。
优点:大量生产、应用临床、深入研 究、扩大应用。
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结晶牛胰岛素:1965年9月17日,中国首次人 工合成结晶牛胰岛素。这是当时人工合成的具有 生物活力的最大的天然有机化合物,使中国成为
维蛋白溶酶原激活剂,超氧化物歧化酶.
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基因工程药物:采用基因工程技术研制的, 能预防和治疗某种疾病但含量极微而难以 用传统方法制取的特殊药物。
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第二节 基因工程药物生产的基本过程
基因工程技术是将重组对象的目的 基因插入载体,拼接后转入新的宿主细 胞,构建成工程菌(或细胞),实现遗 传物质的重新组合,并使目的基因在工 程菌内进行复制和表达的技术。
除菌过滤

第二章基因工程制药新版4

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第二章基因工程制药新版4
大肠杆菌E . coli培养至对数生长期

取20生质球。

再悬浮于0.1M CaCl2

加入2-3ug重组的DNA,混匀

0℃放置30min

42℃,90s

冰浴5min
[5] 转 化 程 序

离心,收集沉淀的细胞

将细胞涂于选择性培养基上,进行培养
装,形成完整的噬菌体或者病毒颗粒,所进行的 转导作用称为限制性转导。
(2)广义性转导作用----任意DNA片段,或者重 组的DNA,经过体外包装成噬菌体颗粒,所进行 的转导作用称为广义性转导。
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3、脂质体介导的融合作用
(1)定义 (2)脂质体的特性 (3)脂质体介导融合的步骤 (4)脂质体介导的应用
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(3)脂质体介导融合的步骤
分为2步: (A)人工脂质体的制备 (B)脂质体与宿主细胞的融合
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(A)人工脂质体的制备
在含有重组DNA分子的水溶液中 + 磷脂 + 吐温80(乳化剂) ↓ 通过激烈搅拌或者超声波处理,将磷脂分散到水溶液之中 ↓ 再经过静置,磷脂分子群聚形成液晶态脂质双层薄膜 ↓ 将DNA包埋在薄膜之中形成微囊。就是人工脂质体。
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至2004年,FDA共批准了大肠杆菌表达的基 因重组生物技术药物18种: 重组人甲状旁腺激素、胰岛素、生物激素、 白介素、干扰素等主要为细胞因子类药物。
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(2)枯草芽孢杆菌
优点: (1)分泌能力很强,可以将蛋白质产物直接分 泌到培养液中。 (2)不会形成包含体。

基因工程制药-4纯化.质控PPT课件

基因工程制药-4纯化.质控PPT课件

离心技术
利用离心力将不同密度的组分 进行分离,如沉降和离心过滤 等。
沉淀法
利用溶解度差异或化学反应使 目标分子沉淀下来,与其他组 分分离。
其他技术
如超临界流体萃取、逆渗透、 电泳等。
纯化技术的优缺点比较
离心技术
优点是操作简便、成本低;缺点是对 大型分子分离效果有限。
过滤与膜分离
优点是高效、连续操作;缺点是需要 定期更换膜材料,且对某些小分子物 质的截留效果不佳。
随着技术的不断进步和应用领域的拓 展,基因工程制药产业将逐步升级, 形成完整的产业链和产业集群,推动 行业的可持续发展。
加强基础研究
未来将继续加强基因工程制药的基础 研究,深入探索基因功能和疾病发生 发展的机制,为药物研发提供更多理 论支持。
THANKS
感谢观看
基因工程制药的特点包括:能够大规模、高效地生产药物, 提高药物的产量和纯度;能够生产传统方法难以获得的药物 ,如蛋白质、多糖等大分子药物;能够降低生产成本,提高 药物的品质和安全性。
基因工程制药的历史与发展
基因工程制药的历史可以追溯到 20世纪70年代,当时科学家开 始尝试利用重组DNA技术生产
药物。
无副作用。
有效性标准
确保基因工程制药产品 具有明确的治疗效果, 能够达到预期的治疗目
标。
均一性标准
确保基因工程制药产品 的质量和性能稳定,批
次间差异小。
稳定性标准
确保基因工程制药产品 在储存和运输过程中性
能稳定,不易变质。
质量控制的方法与流程
原料控制
对原料进行质量检查,确保符合质量标准。
成品检验
对最终产品进行全面的质量检验,包括理化 指标、生物学指标等。

基因工程制药

基因工程制药
以上每题8分 11.名词解释(每词2分):融合蛋白/启动子/SD序列/pGB-
2/穿梭载体/克隆载体/分泌型表达载体/精确表达载体/基因 工程/PCR/
1. 原核细胞:3种 2. 真核细胞:3种 以上各宿主的特点是什么?
二、大肠杆菌中的外源基因表达
1. 真核基因在大肠杆菌表达载体的6个必备性质 2. 2个表达载体——pBV220 & pET system 3. 影响目的基因表达的5大因素 4. 真核基因在大肠杆菌的3种表达形式
三、外源基因在酿酒酵母中的表达
粒转化大肠杆菌细胞; d.培养大肠杆菌,让重组质粒
及外源目的基因形成大量拷 贝; e.筛选含重组质粒的大肠杆菌 细胞,进行检查或鉴定。
一般克隆基因的检查和鉴定方法
酶切和电泳方法
琼脂糖凝胶电泳 分离鉴定大小不 等的酶解片段:
磷酸基团带负电荷 酶解片段向阳极移动 电场驱动力和凝胶阻
力 ——不同迁移率 分子量标准参照物
限制性酶切位点的序列,即多克隆位点
d.利用lacZ基因的插入失活筛选重组质粒
pUC118 质粒的 多克隆位 点整合在lacZ基因中,该位点 如果没有插入外源目的基因, lacZ基因便可表达出半乳糖 苷酶,如果平板培养基中含有 IPTG 和 X-gal , X-gal 便 会 被 半乳糖苷酶水解成兰色,大肠 杆菌形成蓝色克隆。
质粒是细菌细胞中自然存在于染色体外可以自主复 制的一段环状DNA分子。进入到宿主细胞中的一 个质粒可以大量增加其拷贝数。
细菌质粒pUC18
a.该质粒比较小,可以插入一段较长的DNA片段。 b.进入宿主细菌细胞后,pUC18在每个细胞中可复
制形成大约500个拷贝。 c.在pUC18中有一小段人为设计和插入的具有多种

第二章 基因工程制药.ppt

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2019-10-13
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五、重组蛋白质的分离纯化
1. 离子交换层析:
是以离子交换剂为固定相, 依据流动相中的组分离子与交换 剂上的平衡离子进行可逆交换时 的结合力大小的差别而进行分离 的一种层析方法。
6. 降低成本,提高产品质量。
2019-10-13
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二、基因工程药物生产的基本过程
1. 目的基因的获得 2. 构建DNA重组体 上游技术 3. 构建工程菌 4. 工程菌的发酵 5. 外源基因表达产物的分离纯化 6.产品的检验
2019-10-13
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2019-10-13
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1.小分子量的蛋白或多肽 2.已知核苷酸顺序或氨基酸顺序 3.费用较高
2019-10-13
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V第it三a节m基in因表B达2
基因表达的成败,直接影响药品的质量、成本。基因表达是外 源基因在生物体转录、翻译以及所有加工过程,是外源基因异源转录 翻译利用宿主功能的过程,也是外源DNA、RNA、Pr克服宿主细胞 进攻,保护自身的过程。
2019-10-13
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Vitamin A
2019-10-13
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第二节 目的基因的获得
一、 反转录法 二、化学合成法
2019-10-13
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一、反转录法
1.mRNA的纯化
(1)选择表达目的蛋白质丰度高的 mRNA的生物材料。
(2)分离总RNA。 (3)分离mRNA(多聚T纤维素)
三、国内外基因工程药物研究进展
目前研制的基因工程药物主要包括: 1. 免疫性蛋白,如各种抗原和单克隆抗体; 2. 细胞因子,如各种干扰素、白细胞介素、集落刺激生长因子

第二章 基因工程制药

第二章 基因工程制药

• 探寻具治疗作用的新基因备用基因工程药 物
• 我国基因工程药物研究和开发:起步较晚,基础较差。 α 1b 型基因工程干扰素是由我国自行研制开发的具有 国际先进水平的生物高科技成果,于1997年 通过Ⅲ 期临床,并获得国家一类新药证书,成为“863”计 划生物技术领域第一个实现产业化的基因工程药物。 目前我国已批准12种基因工程药物和疫苗上市,在研 究开发中的也有10余种。
同裂酶(Isoschizomers)
• 识别位点的序列相同的限制性内切酶。 Ⅰ. 完全同裂酶:
– 识别位点和切点完全相同。如Hind Ⅲ和Hsu I
Ⅱ. 不完全同裂酶:
– 识别位点相同,但切点不同。如Xma I 和Sma
同尾酶(Isocaudamers)
8、限制性内切酶对DNA的消化
• 内切酶与识别序列的结合模式
(4)短时间培养转化 细胞,以扩增 DNA重 组分子或使其整合到 受体细胞 的基因组中 (简称“增”);
(5)筛选和鉴定转 化细胞,获得使外 源基因高效表达的 基因工程菌或细胞 (简称“检”);
基因工程关键要素
• • • • 工具酶与载体系统 目的基因的获得 基因的重组与转移 克隆基因导入宿主细胞表达
连接反应的机理
连接反应的温度
• 连接酶反应的最佳温度37 ℃。但在37℃ 下 粘性末端的结合很不稳定。所以一般采用 14 ~16 ℃。
影响连接反应的因素
1. 插入片段与载体的浓度比例: 10~20倍。
– 增加插入片段与载体的接触机会,减少载体自 我连接的现象。
2. 反应温度:一般14~16℃
(三)DNA聚合酶
第二节
基因工程的工具酶与载体
一、工具酶
• 常用的工具酶:

第二章基因工程制药新版4

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转化过程总结示意图
2、转导作用
(1)基本概念 (2)转导条件 (3)转导程序 (4)转导作用分类
(1)基本概念
自然界中,通过噬菌体或者病毒的 感染作用,将一个细胞的遗传信 息传递到另一个细胞的过程,称 为转导(transduction)。
感受态细胞吸收以噬菌体、病毒为 载体的重组DNA的过程称为转染 (transfection)。也属于转导作 用。
是一种全新的基因导入技术,它把DNA包被 在金或钨的微粒中,然后由基因枪将此包被 颗粒转移到原位组织、细胞或细胞器中,是 目前国际上最先进的基因导入技术。
基因枪适用于动植物、细胞培养物、胚胎、细 菌及小型动物的转基因。具有快速、简便、 安全、高效的特点。
基因枪注射技术
6、电穿孔技术
利用脉冲电场提高细胞膜的 通透性,从而使外源DNA转 移至细胞中。此法简单、效 率较高,几乎所有细胞都可 用此技术,此方法转染的 DNA不仅是线性的,还可是 环状的。 条件:电压:300~600V
第三节 基因工程制药生产的基本过程 一、工具酶的分离纯化 二、载体的分离纯化 三、外源DNA和目的基因的分离和获得 四、外源DNA与载体DNA的切割与连接 五、宿主细胞的选择和基因导入操作 六、基因工程菌的稳定性及生长代谢的特点 七、基因工程菌中试 八、基因工程菌的扩增和发酵生产 九、基因工程药物的分离和纯化技术 十、变性蛋白的复性 十一、基因工程药物的质量控制 十二、基因工程药物的制造实例
2、宿主细胞的类型
原核细胞类:大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、链霉菌。 真核细胞类:酵母菌、丝状真菌、动物细胞、昆虫细
胞和植物细胞。
(1)大肠杆菌 (2)枯草芽孢杆菌 (3)链霉菌 (4)酵母菌 (5)丝状真菌 (6)动物细胞

生物制药技术-第二章-基因工程制药(1,2,3,4小节)

生物制药技术-第二章-基因工程制药(1,2,3,4小节)


Richard Young和Ronald Davis设计的λgtl0和 λgtDNA便十 分有效地产生许多克隆,每纳克cDNA可产生 5000个克隆,另方面可容纳较大相对分子质量 的外源DNA片段。由于噬菌斑的筛选和操作较 筛选细菌主中,λgtl0载体对于未携带cDNA的噬菌体的 裂解生长有很强的生物学选择作用。cDNA 插 入到λgtl0可使噬菌体阻遏物基因(c 1)失活。
1. MRNA的纯化

反转录法的前提是必须首先得到该目的基因的mRNA,而要 分离纯化目的基因的mRNA,其难度几乎不亚于分离目的基 因。细胞内含有3种以上RNA,mRNA占细胞内RNA总量的 2%~5%,相对分子质量大小很不一致,由几百到几千个核苷 酸组成。在真核细胞中mRNA的3'末端常含有一多聚腺苷酸 (polyA)组 成的末端,长达20~250个腺苷酸,足以吸附于寡 聚脱氧腺苷酸Oligo(dt)-纤维素上,可以用亲和层析法将mRNA 从细胞总RNA中分离出来。利用mRNA的3'末端含有polyA的 特点,在RNA流经寡聚(dt)纤维素柱时,在高盐缓冲液的 作用下,mRNA被特异地结合在柱上,当逐渐降低盐的浓度 洗脱时或在低盐溶液和蒸馏水的情况下,mRNA被i洗脱下来, 经过两次寡聚(dt)纤维素往后,可得到较高纯度的mRNA。

我国基因工程药物研究和开发起步较晚,基础较差。 20 世纪70年代末以来,开始应用 DNA重组技术、淋 巴细胞杂交瘤技术、细胞培养、克隆表达等技术开 发新产品和改造传统制药工艺。几十年来,在国家 汁划,特别是国家"863"高技术计划的优先支持下, 使这一领域迅速发展,缩短了我国与世界先进国家 的差距。"863"高技术计划在生物技术领域内研究的 三个主题之一是新型药物、疫苗与基因治疗,重点 是利用现代生物技术手段,开发化学合成法难以生 产的医药产品,如肝炎、肿瘤、传染病和心脑血管 疾病预防、诊断和治疗的生物技术医药产品。

第二章-基因工程制药_PPT幻灯片

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传统生物药物由于来源及制备上的困难、价 格等因素的影响,此外在制备过程可能受到 的感染等问题,促使人们寻求安全、实用、 疗效可靠的新方法来制备生物药物。基因工 程正在逐渐显示其在生物技术药物制备上的 优势。
应用基因工程技术可十分方便且有效地解决 上述提到的问题,从量、质上都可以得到改 进,且可以创造的基因:所谓目的基因就是我们想要的基因片段,它在生物体 内能表达产生所要蛋白产物。
生物界的基因有上亿个,多数存在于染色体上,少数存在于 细胞质中。取得目的基因的办法是用“分子剪刀”剪切供体DNA 分子,把它切成一些比基因略长的片段,然后再从中找出包含所 需目的基因的DNA片段。到目前为止,人们用这种方法已分离出 40种大肠杆菌蛋白质基因、鸡的组蛋白基因等。另一种获得目的 基因的方法是人工合成,即基因模版合成。
基因工程药物制备的一般过程
获得目的基因
组建重组质粒
构建基因工程 菌或细胞
产物分离纯化
除菌过滤
半成品检定
培养工程菌
成品检定 包装
基因工程药物生产的上游和下游
上游:主要指的是目的基因分离、工程菌 (或细胞)构建。上游阶段的工作主要在 实验室内完成;
下游:主要指的是从工程菌(或细胞)的 大规模培养一直到产品的分离纯化、质量 控制等。
2、cDNA第一链的合成
一般mRNA都带有3‘-polyA,所以可用寡聚dT作为 引物,在逆转录酶的催化下,开始cDNA链的合成。 在合成反应体系中加入一种放射性标记的dNTP;在 凝胶电泳后,进行放射自显影分析产物的分子大小, 探索最佳反应条件。
3、cDNA第二链的合成
先用碱解或RNaseH酶解的方法除去cDNA-mRNA杂交 链中的mRNA链,然后以cDNA第一链为模板合成第二 链。由于第一链cDNA链3‘末端往往形成一个发夹形 结构,所以,可以从这一点开始合成cDNA第二链。此 反应是在DNA聚合酶I催化下完成的。核酸酶S1专一性 切除单链DNA,因此用它可以切除发夹结构。发夹结 构结构切除后,双链cDNA分子的大小常用变性琼脂糖 凝胶电泳进行测定。
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(1)基本概念
转化 (transformation): 以质粒为载体构建的重组 DNA分子导入原核细胞 的过程.
(2)转化作用的特性
(1)是自然界经常发生的现象之一。
(2)转化作用的前提条件是宿主细胞必须转 变为感受态细胞。
(3)转化作用的先决条件是要获得携带目的 基因的重组DNA分子。
(3)感受态细胞
2、宿主细胞的类型
原核细胞类:大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、链霉菌。 真核细胞类:酵母菌、丝状真菌、动物细胞、昆虫细 胞和植物细胞。
(1)大肠杆菌 (2)枯草芽孢杆菌 (3)链霉菌 (4)酵母菌 (5)丝状真菌 (6)动物细胞
(1)大肠杆菌
优点:
(1)生长迅速、大规模发酵经济。
(2)分子遗传结构清楚、操作简单。 (3)基因工程研究中采用最多的表达体系。
(B)脂质体与宿 主细胞的融合
将脂质体微囊与宿主细 胞混合,在PEG、或者 在其它促融剂的作用下, 经过一定条件就会产生 融合作用,最终将重组 DNA导入到宿主细胞之 中。
(4)脂质体介导的应用
对于一些微生物如放线菌细胞,由于无法形成
感受态,也就不能通过转化作用导入外源性DNA。
但是,通过脂质体介导方法,就能实现脂质体与 放线菌细胞之间的融合,来获得基因工程放线菌。
(3)链霉菌
优点: (1)不致病, (2)使用安全, (3)分泌能力强, (4)可将培养产物直接分泌到培养液中, (5)具有糖基化能力 近年来,作为外源基因表达体系,正日益受到人 们的重视。
(4)酵母菌
酿酒酵母研究最为透彻。干扰素和乙肝表面抗原基因在 酵母菌中进行克隆和表达。
优点: (1)是研究基因表达调控最有效的单细胞真核生物, (2)其基因组小、繁殖迅速、可以利用廉价材料进行 大规模培养, (3)无毒性, (4)基因工程操作简单, (5)表达的蛋白质产物能够直接分泌出细胞外, (6)能够对蛋白质产物进行糖基化, (7)真核基因在酵母中表达良好。
(5)丝状真菌

曲霉被认为一种安全菌株、并且已经对它形成了 成熟的发酵和后处理工艺。 优点: (1)有很强的蛋白质分泌能力, (2)能正确地进行翻译后的加工,如进行糖基化、 肽剪切。
(6)动物细胞
优点: (1)表达产物可以分泌到培养液中, (2)培养液成份完全由人所控制, (3)所分泌的基因产物接近于天然产物, (4)产物容易得到提纯。
[B]、转导程序
用于制备包装蛋白质的宿主细胞------cI857大 肠杆菌E . coli、BHB2690、BHB2688。
↓ D基因突变型宿主BHB2690培养、并且进行溶菌处理,提 取DNA-d ++ 外源性目的基因DNA + + E基因突变型宿主BHB2688培养、并且进行溶菌处理, 提取DNA-e ↓ 温育,包装成完整的外源基因-λ噬菌体重组颗粒。(具 有再感染能力) ↓ 去感染大肠杆菌E . coli ↓ 完成转导
(4)转导作用分类
(1)限制性转导作用----由温和的噬菌体或者病 毒DNA为载体所构成的重组DNA,经过体外包装, 形成完整的噬菌体或者病毒颗粒,所进行的转导 作用称为限制性转导。 (2)广义性转导作用----任意DNA片段,或者重组 的DNA,经过体外包装成噬菌体颗粒,所进行的转 导作用称为广义性转导。
多肽蛋白质 融合蛋白质 多肽蛋白质 糖基化蛋白 完 整 糖基化蛋白
一般


菌体内 外分泌 外分泌
菌体内 稍复杂 简单
不大
哺乳动物
需注意 致癌
(二)具体的转移技术
1、转化作用 2、转导作用
1、转化作用
(1)基本概念 (2)转化作用的特性 (3)感受态细胞 (4)人工感受态细胞 (5)转化程序 (6)影响转化的因素
转化过程总结示意图
2、转导作用
(1)基本概念 (2)转导条件 (3)转导程序 (4)转导作用分类
(1)基本概念
自然界中,通过噬菌体或者病毒 的感染作用,将一个细胞的遗传 信息传递到另一个细胞的过程, 称为转导(transduction)。 感受态细胞吸收以噬菌体、病毒 为载体的重组DNA的过程称为转 染(transfection)。也属于转导 作用。 自然界许多温和噬菌体都具有转 导功能。
大肠杆菌E . coli培养至对数生长期
↓ ↓ ↓
取20ml,悬浮于0.1M CaCl2来自离心,收集沉淀的原生质球。
再悬浮于0.1M CaCl2 加入2-3ug重组的DNA,混匀 0℃放臵30min
↓ ↓

42℃,90s

↓ ↓ ↓
冰浴5min 离心,收集沉淀的细胞
[5] 转 化 程 序
将细胞涂于选择性培养基上,进行培养
缺点: (1)生产慢、 (2)生产率低、 (3)培养条件苛刻、费用高, (4)培养液浓度较稀。
至2004年,FDA共批准了哺乳动物细胞表达 的基因重组生物技术药物53种,其中激素类 5种,酶7种,细胞因子7种,凝血因子5种, 治疗性抗体17种。
主要基因工程表达体系比较
表达体系 大肠杆菌 产 物 产生部位 菌体内 培养方式 容易 部分高产 容易 可高产 较难成本高 可高产 提 纯 产物活性 对原核好 对真核差 真核的接近 天然产物 可达天然 产物 潜在危性 不大
根据菌落特性,筛选出基因工程菌
(6)影响转化的因素
重组DNA转化率很低,在0.1%左右。影响因素: (1)宿主的限制酶对外源性重组DNA的限制作 用,会大大降低转化率, (2)宿主细胞的人工感受态形成率,会影响转化 率, (3)重组DNA的构型与转化率有一定的关系, 环状DNA的转化率要比线性DNA高出10-100倍, (4)外源基因与宿主DNA和同源性越高,其转 化率也越高。 (5)重组DNA的浓度越高、其转化率也越高, DNA的纯度越高、其转化率也越高。
(2)转导条件
体外重组的DNA,要通过转导途径进入宿主 细胞,必须经过蛋白质包装的环节, DNA+噬菌体头部蛋白 + 噬菌体尾部蛋白→ 形成完整的噬菌体颗粒,才具有感染能力。
(3)转导程序
[A]、蛋白质体外包装程序 [B]、转导程序
[A]、蛋白质体外包装程序
蛋白质的体外包装是通过互补作用实现的。 λ噬菌体的D基因、E基因是表达蛋白质的主要基因。 (1)D基因所表达的蛋白质占20%、D基因突变,在 宿主体内产生大量头部蛋白。 (2)E基因所表达的蛋白质占78%、E基因突变,在 宿主体内产生大量头尾蛋白。
(3)脂质体介导融合的步骤
分为2步:
(A)人工脂质体的制备
(B)脂质体与宿主细胞的融合
(A)人工脂质体的制备
在含有重组DNA分子的水溶液中 + 磷脂 + 吐温80(乳化剂) ↓ 通过激烈搅拌或者超声波处理,将磷脂分散到水溶液之中 ↓ 再经过静臵,磷脂分子群聚形成液晶态脂质双层薄膜 ↓ 将DNA包埋在薄膜之中形成微囊。就是人工脂质体。
至2004年,FDA共批准了大肠杆菌表达的基 因重组生物技术药物18种:
重组人甲状旁腺激素、胰岛素、生物激素、
白介素、干扰素等主要为细胞因子类药物。
(2)枯草芽孢杆菌
优点: (1)分泌能力很强,可以将蛋白质产物直接分 泌到培养液中。 (2)不会形成包含体。 缺点: (1)不能使蛋白质产物糖基化。 (2)枯草芽孢杆菌具有很强的胞外蛋白酶分泌 系统,常常对蛋白质产物造成破坏。
3、脂质体介导的融合作用
(1)定义
(2)脂质体的特性 (3)脂质体介导融合的步骤 (4)脂质体介导的应用
(1)定义
将重组的DNA分子包埋于 脂质体微囊之中,通过 脂质体微囊与宿主细胞 的融合作用,而将外源 性目的基因转移到宿主 细胞内的过程称为脂质 体介导的融合作用。
(2)脂质体的特性
脂质体:人工构建的由磷脂双分子层组成的膜状 结构。 原理:受体细胞的细胞膜表面带负电荷,脂质体 颗粒带正电荷,利用引力作用,把DNA、 mRNA及单链RNA等导入细胞内 主要适用于真核细胞,可对基因进行瞬时表达和 稳定表达。
细胞吸收外源DNA的启发而
发展起来的。当核酸以磷酸 钙—DNA共沉淀物的形式在
时,细胞摄取DNA的能力显
著加强。但转移效率较低, 仅有1%~5%的外源DNA可 进入受体细胞核中,约有 1%DNA可在细胞中稳定表 达。
8、病毒介导的生物 学方法
带有外源基因的逆转录 病毒或DNA病毒在包装细 胞内可形成完整的病毒 颗粒,并被释放到培养 基中,感染哺乳动物细 胞,能有效实现基因转 移。
缺点: (1)表达产物多为胞内物质,提取时需破碎细胞。 (2)细胞破碎时,细胞质内的其它蛋白质也会释放出 来,形成杂质。给提取带来困难。 (3)所表达的真核蛋白质在其体内常形成包含体,在 提取后必须经过变性、复性处理才能恢复生物活性。 (4)大肠杆菌中不存在翻译后修饰系统,不能对蛋白 产物进行糖基化及磷酸化等修饰。 (5)大肠杆菌内的蛋白酶会对目的蛋白造成破坏。 (6)大肠杆菌会产生内毒素,难去除。
1、宿主细胞应满足的条件
2、宿主细胞的类型
1、宿主细胞应满足的条件
(1)容易获得较高浓度的细胞。 (2)能够利用廉价原料进行生产。 (3)不致病。 (4)不产生内毒素。 (5)发热量低。 (6)需氧低。 (7)具有一定的细胞形态。 (8)需有适当的发酵浓度。 (9)容易进行代谢调控。 (10)容易进行DNA重组技术操作。 (11)产物的产量稳定、产率高。 (12)产物容易提取和纯化。
感受态(competent) :指细胞在一定的生理状 态可摄取外源性遗传物质经体内重组成为染色 体中的一部分,导致受体细胞某些遗传性状的 改变。
(4)人工感受态细胞
在基因工程中,宿主细胞经过人工处理,最后 成为感受态细胞,称为人工感受态细胞。所有 生物细胞均可处理成人工感受态细胞。 制备人工感受态细胞的方法: (1)将对数生长期细胞于低温、低渗的CaCl2 溶液中处理,就可成为感受态细胞。 (2)用MgCl2、CsCl、LiCl、或者是多价阳 离子DETE-Sephadex处理,改变细胞膜结构, 也能成为感受态细胞。
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