L_谷氨酰胺高产菌的选育和发酵条件

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谷氨酸发酵的工艺流程

谷氨酸发酵的工艺流程
《谷氨酸发酵的工艺流程》
谷氨酸是一种重要的氨基酸，广泛应用于食品、医药和化工等领域。

发酵工艺是生产谷氨酸的主要方法之一，下面将介绍谷氨酸发酵的工艺流程。

1. 选择菌株：选择适合发酵生产的菌株是谷氨酸发酵工艺的第一步。

通常采用属于放线菌属或棒状杆菌属的菌株进行发酵。

这些菌株具有较高的谷氨酸产量和较好的耐受性。

2. 发酵培养基的配制：发酵培养基是支撑谷氨酸发酵的重要基础。

一般包括碳源、氮源、无机盐、生长因子等组成成分。

常用的碳源包括葡萄糖、麦芽糖等，氮源包括氨基酸、尿素等。

3. 发酵条件控制：发酵过程中的温度、pH值、氧气供应等条件都会影响谷氨酸的产量。

通常采用恒温发酵，温度一般控制在28-32摄氏度。

同时控制好培养基的pH值，通常在6.5-7.5之间。

氧气供应也是非常重要的，通过控制搅拌速度和通气量来保证充足的氧气供应。

4. 发酵过程监测：在发酵过程中需要对微生物生长、培养基中各种成分的消耗和产物的生成进行持续监测。

通过检测微生物生长曲线和培养基中各成分的浓度变化来掌握发酵情况，及时调整发酵条件以提高产量。

5. 发酵产物的提取与精制：发酵结束后，需要对发酵产物进行
提取和精制。

通常采用离心、过滤等方法将微生物分离，然后通过酸碱调节、浓缩、结晶等工艺步骤来得到纯净的谷氨酸产物。

通过以上工艺流程，谷氨酸发酵生产可以实现高效、稳定的产量，并且能够得到高纯度的产物，满足市场需求。

L-谷氨酰胺高产菌株选育及发酵过程优化的开题报告

L-谷氨酰胺高产菌株选育及发酵过程优化的开题报告
一、选题背景
谷氨酰胺（L-Glutamine，L-Gln）是一种广泛应用于医药、保健品、食品和饲料等领域的重要氨基酸，在生物体内具有多种功能，如维持肠
道黏膜屏障、免疫调节、脑神经传递等。

由于其生理功能的多样性和重
要性，谷氨酰胺市场需求量逐年增加，成为一种具有广阔市场前景的生
物活性物质。

谷氨酰胺的生产主要依靠微生物发酵工艺，然而，传统发酵方法生
产谷氨酰胺效率较低，产量有限。

因此，选育高产菌株和优化发酵过程
是解决该问题的有效途径。

二、研究目的和内容
本研究旨在选育高产谷氨酰胺的菌株，并通过发酵过程的优化，提
高谷氨酰胺的生产效率。

具体内容包括：
1. 从具有谷氨酰胺生产潜力的微生物中筛选出高产谷氨酰胺的菌株，并进行鉴定和优化。

2. 采用响应面分析等方法优化谷氨酰胺发酵过程的参数，包括菌种
培养条件、发酵基质成分和发酵条件等。

3. 根据最佳发酵条件进行大规模发酵试验，考察谷氨酰胺的产量和
品质等指标，并与传统发酵工艺进行比较分析。

三、研究意义
本研究的成果可以为谷氨酰胺的生产提供新的思路和方法，解决传
统发酵工艺产量低、生产效率低等问题，提高谷氨酰胺的产量和质量，
为生物活性物质的生产和应用提供强有力的支持。

此外，研究过程中所涉及到的微生物分离、鉴定和优化方法，对于探索和利用其他有潜力的微生物，并提高其代谢产物的产量和质量也具有一定的参考意义。

L-色氨酸高产菌的选育及其发酵条件的优化的开题报告

L-色氨酸高产菌的选育及其发酵条件的优化的开题报告一、选题背景及意义色氨酸是一种重要的氨基酸，在医学、食品工业、化学工业等领域中有着广泛的应用。

目前，大多数色氨酸的生产是通过化学合成实现的，由于其分子结构的复杂性，合成成本较高，而且合成的产物容易受到污染和环境污染问题。

因此，寻求一种高效、环保的生物合成方法，就显得尤为重要。

色氨酸合成的最终目的是要获得高纯度的L-色氨酸，因此需要使用高产菌株。

此外，发酵条件的优化也对提高色氨酸产量至关重要。

因此，本文旨在选育L-色氨酸高产菌株，并通过优化发酵条件，提高L-色氨酸的产量，为生产高纯度的L-色氨酸提供一种可行的方法。

二、选题内容及方法1. 选育L-色氨酸高产菌株通过筛选不同的菌株，选育出一种L-色氨酸高产的菌株。

初始阶段将使用不同的培养基，包括Luria-Bertani（LB）培养基、M9培养基、中等选择性培养基等，并使用不同浓度和比率的糖类和氮源来寻求最适合L-色氨酸合成的培养条件和培养细节，从而达到高产菌株的选育目的。

2. 产酸菌对色氨酸产酸的影响在L-色氨酸生产过程中，一些产酸菌可能会对色氨酸的合成产生负面影响。

因此，将研究产酸菌对L-色氨酸合成的影响，也会探索针对这些产酸菌的处理策略。

3. 优化发酵条件通过改变发酵条件，例如气体供应、温度和pH，进一步提高L-色氨酸的产量。

将对不同的发酵条件进行研究，以了解每个变量对产量的影响，并将最优条件应用于大规模的产酸过程。

4. 产品分离和提纯通过膜分离、离子交换、逆渗透等技术，对发酵液进行处理并获得高纯度的L-色氨酸。

三、预期成果及意义通过本研究，有望选育出L-色氨酸高产菌株并优化发酵条件，从而实现高效低成本的生物制造L-色氨酸过程。

同时，研究发现的产酸菌和其他负面影响，可以指导未来合成L-色氨酸的研究和生产。

最终，高纯度的L-色氨酸将应用于医药、食品工业、化学工业等领域，推动相关领域的发展。

高产谷胱甘肽酵母菌选育及发酵条件的研究的开题报告

高产谷胱甘肽酵母菌选育及发酵条件的研究的开题
报告
一、选题背景
谷胱甘肽是一种重要的生物活性多肽，在人体免疫、氧化还原等多种生理过程中发挥着关键作用。

谷胱甘肽合成的关键酶是谷胱甘肽合成酶（GSH-S）和谷氨酰基转移酶（GS-T）。

目前，谷胱甘肽的生产主要依靠微生物发酵方式，而酵母菌是谷胱甘肽生产的最重要菌种之一。

高产谷胱甘肽酵母菌的选育和优化其发酵条件对谷胱甘肽生产和应用具有重要意义。

二、研究目的
本研究旨在筛选出产谷胱甘肽能力更强的酵母菌株，同时优化其发酵条件，实现大规模生产高纯度谷胱甘肽的目的。

三、研究内容
1.筛选谷胱甘肽高产酵母菌株
通过微生物菌种筛选、突变体筛选、遗传工程等手段，筛选出能够生产大量谷胱甘肽的高产酵母菌株。

2.优化谷胱甘肽酵母菌的培养条件
通过单因素和响应面实验的方法，研究影响酵母菌高产谷胱甘肽的主要因素，并优化其培养条件，使其生产效率和产量最大化。

3.谷胱甘肽生产工艺的研究
结合筛选出的高产酵母菌株和优化后的培养条件，研究谷胱甘肽的生产工艺，并探究相关的工艺参数对生产效率的影响。

四、研究方法
本研究采用细胞生物学、微生物学、分子生物学等方法，结合单因素和响应面实验的方法，系统研究谷胱甘肽高产酵母菌株的筛选和培养条件的优化。

五、结论意义
本研究将通过筛选和优化，获得高产谷胱甘肽的酵母菌株，实现对谷胱甘肽生产的快速高效，并优化其工艺，提高其纯度。

这将为谷胱甘肽在医药、护肤品等领域的应用提供高质量的原料保障。

谷氨酸生产菌的选育

•
生化121
•
22号
谷氨酸生产菌的选育方法，主要是
采用常规的诱变育种及遗传工程技术构建工程菌株。
诱变育种
利用各种诱变剂处理微生物细胞，提高基因的随即突变频率，扩大变异幅度，通过一定的筛选方法，获取所需要优良菌株的过程，称为诱变育种。
诱变育种包括诱变和筛选两个部分：首先，以合适的诱变剂处理大量而均匀分
（5）摇瓶筛选将突变株接入摇瓶发酵培养集中，进行摇瓶发酵，比较菌株的谷氨酸产量，选出谷氨酸高产菌株。
(6)原生质体制备将DES突变株的斜面菌接入一级种子培养集中，32摄氏度振荡培养5h，加入青霉素G，使青霉素G的浓度为0.6U/ml，继续培养3h，离心弃去上清液，用高渗稳定液洗涤2次，将菌体与高渗稳定液混合，于装有玻璃珠的无菌三角瓶充分振荡，制成菌体的高渗悬液，调节菌体浓度为（1-3）× 个/ml。然后，加入溶菌酶，使其浓度为200-800U/ml，恒温32摄氏度振荡处理，镜检观察原生质体的形成情况，当95%以上的细胞变为原生质体时，离心弃去上清液，用高渗稳定液洗涤2次，最后制成原生质体的高渗悬液。取1ml原生质体悬液，用无菌水稀释后涂布于完全培养基上恒温28摄氏度培养72h，以霉检前的菌悬液为对照，根据在平板上形成的菌落数计算原生质体形成率，计算公式如下：原生质体形成率=
体再生→香豆素和氯化锂平板筛选
→谷氨酸为唯一碳源平板筛选→摇瓶筛选→UV突变株→稳定性试验 →生产条件试验
谷氨酸菌诱变选育操作步骤
（1）菌悬液的制备将出发菌株AS1.299斜面菌接入一级种子培养集中，32摄氏度振荡培养8h，离心去清夜，加入7.0缓冲液稀释菌体泥制菌悬液。
（2）硫酸二乙酯诱变在菌悬液中加入硫酸二乙酯，使硫酸二乙酯浓度为1%（体积分数），在电磁搅拌下处理20—30分钟，处理后加入硫代硫酸钠终止反应。

谷氨酸发酵的工艺流程

谷氨酸发酵的工艺流程谷氨酸是一种重要的生物体中的氨基酸，广泛应用于食品添加剂、保健品和生化制药等领域。

谷氨酸的工业生产主要采用微生物发酵的方法，下面将介绍一种常见的谷氨酸发酵工艺流程。

1. 菌种培养：选用高产谷氨酸的菌株，如乳杆菌属、大肠杆菌等。

先将菌株接种到培养基中培养，再将培养好的菌液接种到发酵罐中进行扩大培养。

菌种培养的条件包括适宜的温度、pH值、培养基组成等。

2. 发酵罐的准备：通常采用不锈钢发酵罐，选择适宜的体积和搅拌速度。

发酵罐内要保持无菌状态，并可以自动控制温度、pH值、溶氧量等参数。

3. 发酵工艺参数设定：设定适宜的温度和pH值，一般发酵温度为30-37摄氏度，pH值为6-7。

通过自动控制系统实时监测和调控这些参数，保证发酵过程的正常进行。

4. 发酵过程：首先将适量的底物加入发酵罐中，底物包括主碳源、氮源、矿物元素等。

然后将菌种接种进入发酵罐，并继续搅拌保持良好的氧气传递。

发酵过程中，微生物利用底物产生代谢产物，包括谷氨酸。

5. 收获和提取：发酵过程一般持续3-5天，当菌体处于最佳生长阶段时，收获发酵液。

发酵液需要经过后处理，包括澄清、浓缩、精制等步骤。

澄清可以通过离心或滤过等方式进行。

浓缩可以利用蒸发、真空浓缩等方法进行。

精制包括溶剂提取、结晶、脱色等步骤，以提高谷氨酸的纯度。

6. 产品包装和贮存：将精制后的谷氨酸产品进行包装，通常采用铝箔袋或塑料瓶。

包装完成后，产品需要进行质量检验，并储存于低温、干燥、密封的环境中，以延长产品的保质期。

以上就是谷氨酸发酵的工艺流程。

随着生物技术的不断发展，谷氨酸发酵工艺也在不断改进，以提高谷氨酸的产量和纯度。

同时，工艺的经济性、环保性也是发酵工艺改进的重要方面，以实现可持续发展。

L-谷氨酰胺高产菌的选育和发酵条件

ＡｂｓｒｃＴｈｒｇｎｌｓｒｉｔａｔ：ｅｏｉａｔａｎＬＧ一ｓｍｕａｅｙｕｔａｉｌｔｒｄａｉｎａｄｄｅｈｌｓｌａｅ，ａｃｅｎｄｉ３ｗａｔｔｄｂｌｒｖｏｅａｉｔｏｎｉｔｙｕｆｔｎｄｓｒｅｅ
件进行优化，７瓶发酵产量可达４４Ｌ７Ｌ发酵罐补料分批发酵４经２ｈ摇７～８，０ｈ可达５Ｌ５。
关键词：种；酵；一氨酰胺；变育发Ｌ谷诱
中图分类号：８５Ｑ１
文献标志码：Ａ
品，有着巨大的市场。目前，全球的Ｌ—Ｇｎ年产量已达１０右，ｌ０００ｔ左
到２／。汪世华等以谷氨酸棒杆菌￥１４为出５ｇＬ９１发菌株，经线和硫酸二乙酯（Ｅ）变处理，向ＤＳ诱定选育出１株生产菌Ｓ４Ｌ—Ｇｎ产量可积累达Ｈ４，ｌ４．／。李爽等。黄色短杆菌ＳＤＮ抗１４ｇＬ。以Ｇ和Ｏ性菌株作为生产菌株，６Ｌ罐中发酵４１４ｈ后可产
ＣＨＡＩｉｋｉＨＡＮＧＷｅｇｏｎａ，ＺＪｉｕ
（ｅａｏａｒｏＩｄｓｉｉｅｈｏｇｆｈｎｓｆｄｃｔｎＪｎｎｎＵｉｒｉ，ｘ２４２，ＣｉａＫｙＬｂｒｔｙｆｎｕｔａＢｏｃｎｌｙｏｔｅＭｉｉｒｏｕａｏ，ｉｇａｎｅｓｙＷｕｉ１１２ｈｎ）ｏｒｌｔｏｔｙＥｉａｖｔ

谷氨酸的菌株选育及发酵生产

谷氨酸的菌种选育及发酵生产谷氨酸是构成蛋白质的20种常见α氨基酸之一，是一种酸性氨基酸。

它是谷氨酰胺、脯氨酸以及精氨酸的前体物质。

L-谷氨酸是蛋白质合成中的编码氨基酸，哺乳动物非必需氨基酸，在体内可以由葡萄糖转变而来。

D-谷氨酸则参与多种细菌细胞壁和某些细菌杆菌肽的组成。

谷氨酸的生物合成途径大致是这样的：葡萄糖经糖酵解(EMP途径)和己糖磷酸支路(HMP途径)生成磷酸烯醇式丙酮酸，其进一步转换为丙酮酸，丙酮酸经氧化生成乙酰辅酶A(乙酰CoA)，然后进入三羧酸循环（同时，丙酮酸也固定二氧化碳产生草酰乙酸进入三羧酸循环），生成三羧酸循环中间产物α-酮戊二酸。

α-酮戊二酸在谷氨酸脱氢酶的催化及有NH4+存在的条件下，生成谷氨酸。

当生物素缺乏时，菌种生长十分缓慢；当生物素过量时，则转为乳酸发酵。

因此，一般将生物素控制在亚适量条件下，才能得到高产量的谷氨酸。

菌种的选育：在谷氨酸发酵中，如果能够改变细胞膜的通透性，使谷氨酸不断地排到细胞外面，就会大量生成谷氨酸。

研究表明，影响细胞膜通透性的主要因素是细胞膜中的磷脂含量。

因此，对谷氨酸产生菌的选育，往往从控制磷脂的合成或使细胞膜受损伤入手，如生物素缺陷型菌种的选育。

生物素是不饱和脂肪酸合成过程中所需的乙酰CoA的辅酶。

生物素缺陷型菌种因不能合成生物素，从而抑制了不饱和脂肪酸的合成。

而不饱和脂肪酸是磷脂的组成成分之一。

因此，磷脂的合成量也相应减少，这就会导致细胞膜结构不完整，提高细胞膜对谷氨酸的通透性。

由于谷氨酸的分泌受细胞膜控制，而影响细胞膜的谷氨酸通透性主要是细胞膜的磷脂含量。

因此，提高细胞膜谷氨酸通透性，必须从控制磷脂含量着手或者使细胞膜受损伤。

磷脂由不饱和脂肪酸、甘油、磷酸和侧链组成，因此，可通过选育这几种物质的缺陷型。

1．选育耐高渗透压菌株耐高糖（20-30%）、耐高谷氨酸（15-20%）、耐高糖、高谷氨酸（20%+15%）2．选育不分解利用谷氨酸菌株以谷氨酸为唯一碳源菌体不能生长或生长微弱3.选育细胞膜渗透性好的菌株（1）生物素缺陷型生物素是脂肪酸生物合成中乙酰CoA羧化酶的辅酶，该酶催化乙酰CoA合成丙二酰CoA。

L_谷氨酰胺高产菌株的选育和发酵条件优化

第23卷第2期2004年3月无锡轻工大学学报Journal of Wuxi University of Light IndustryVol.23 No.2M ar. 2004文章编号:1009-038X(2004)02-0082-04 收稿日期:2003-06-05; 修回日期:2003-08-15.作者简介:杨梅(1979-),女,安徽铜陵人,发酵工程硕士研究生.L -谷氨酰胺高产菌株的选育和发酵条件优化杨梅, 张伟国(江南大学工业生物技术教育部重点实验室,生物工程学院,江苏无锡214036)摘要:采用嗜乙酰乙酸棒杆菌(Cory nebacter ium acetoacidop hilum )ATCC13870为出发菌株,经亚硝基胍、硫酸二乙脂和60Co 诱变处理,定向选育出一株L -谷氨酰胺产生菌G21-8.在适宜的条件下积累L -谷氨酰胺,平均质量浓度为32.5g /L,最大时可达36.7g/L,谷氨酸产量较少.关键词:谷氨酰胺;诱变;育种;发酵中图分类号:Q 933文献标识码:ABreeding of L -Glutamine Hyper -Producer andOptimization of Its FermentationYANG Mei, ZHANG We-i g uo(T he Key L aboratory of Industrial Biotechnolog y,M inistr y of Educatio n,School o f Biotechnolog y,Sout hern Y angtze U-niversity,Wux i 214036,China)Abstract:Orig inal strain Cory nebacterium acetoacidop hilum ATCC13870was mutated by NET,DES and 60Co.As a result of a strain named G21-8,producing Glutamine w as obtained.Under optim um condition ,G21-8w as able to accumulate an average of 32.5g /L,and the highest of 36.7g /L of L -Glutamine.Key words:L -glutamine;mutation;breeding;fermentationL -谷氨酰胺(L -Glutamine,L -Gln )是L -谷氨酸的C -羧基酰胺化的一种氨基酸,其结构式为NH 2OC -CH 2-CH 2-CH (NH 2)COOH,相对分子质量146.15,分解温度185e ,等电点5.65,属中性氨基酸.作为20种构成蛋白质的基本氨基酸之一,L -谷氨酰胺占人体全身游离氨基酸一半以上,是机体含量最丰富的氨基酸,在生物体代谢中起着举足轻重的作用,是一种/条件性必需0氨基酸.自1952年用X 光衍射确定了其分子结构后,对它的应用日益引起人们的关注,被认为是目前所知道的最重要的氨基酸之一,也是一种极有发展前途的新药[1].谷氨酰胺的广泛用途促使其生产得以迅速发展.目前主要的生产方法有化学酰化法和直接发酵法,我国多采用发酵法制得的L -谷氨酸来酰化制取,此法成本较高,从而限制了L -谷氨酰胺的使用,因此直接发酵法是L -谷氨酰胺生产的发展趋势[2,3].直接发酵法最关键的问题是要有优良的生产菌株,选育高产的L -谷氨酰胺生产菌非常重要,本实验就此问题作了初步的探讨.1 材料与方法1.1 菌种嗜乙酰乙酸棒杆菌(Corynebacterium acetoaci -dop hilum )AT CC13870,本实验室保藏.1.2 培养基1.2.1 基本培养基组分(g /L):葡萄糖20,(NH 4)2SO 41.5,KH 2PO 41,K 2HPO 43,M gSO 4#7H 2O 0.1,M nSO 4#4H 2O 0.01,FeSO 4#7H 2O 0.01,尿素1.5,琼脂粉20,生物素30L g/L,硫胺素#H Cl 100L g /L,pH 7.0.1.2.2 完全培养基组分(g/L):葡萄糖5,蛋白胨10,牛肉膏10,NaCl 5,琼脂25,pH 7.0.1.2.3 摇瓶种子培养基组分(g/L):葡萄糖25,(NH 4)2SO 45,玉米浆40,KH 2PO 41,MgSO 4#7H 2O 0.5,CaCO 310,pH 7.0.1.2.4 摇瓶发酵培养基组分(g/L):葡萄糖120,(NH 4)2SO 450,玉米浆4,KH 2PO 41,MgSO 4#7H 2O 0.5,M nSO 4#4H 2O 0.01,FeSO 4#7H 2O 0.02,ZnSO 4#7H 2O 0.01,碳酸钙30,pH 7.5.1.3 培养方法1.3.1 种子培养接一环斜面种子于装有40mL 种子培养基的250mL 三角瓶中,于往复式摇床上30e 振荡培养10h,频率85次/min,振幅90mm.1.3.2 发酵培养接0.5mL 种子液于装有15mL 发酵培养基的250mL 三角瓶中,于往复式摇床上30e 振荡培养72h,频率100次/min,振幅90mm.1.4 诱变筛选方法采用常规化学诱变[4].亚硝基胍(NTG)诱变质量浓度为500L g/mL,用琥珀酸平板筛选;硫酸二乙酯(DES)的诱变体积分数为0.02%,用磺胺胍(SG)平板筛选;两者诱变处理时间均为20min.C -射线的照射源为60Co,诱变剂量为1000Gy ,处理时间为30min,用磺胺胍(SG)平板筛选.30e 恒温培养3~6d,挑选出单菌落于完全培养基上,待用.1.5 分析方法1.5.1 pH 值测定国产精密pH 试纸.1.5.2 菌体生长测定取0.2m L 待测液,加入5mL 0.25mol/L 盐酸溶液中,摇匀,用721型分光光度计,1cm 光程562nm 测OD 值.1.5.3 发酵液中还原糖的测定菲林试剂滴定法[5].1.5.4 谷氨酰胺测定采用新华3号滤纸在室温下用不饱和法展开,展开剂用V (正丙醇)B V (浓氨水)=5B 2上行法展开.称取一定量的谷氨酰胺标准样品,配成1%,1.5%,2%,2.5%,3%等几种不同质量浓度的溶液,每种溶液点样1L L.发酵液经离心后,取其上清液点样1L L.展析完毕用热风吹干滤纸,用0.5g /dL 茚三酮丙酮溶液显色,105e 烘干5min,滤纸上立即出现紫红色的氨基酸斑点.剪下氨基酸斑点,用洗脱液为V (0.1g /dL CuSO 4#5H 2O)B V (体积分数75%乙醇)=2B 38),洗脱30min,然后在520nm 处测定光密度,从标准曲线上可求得发酵液中L -谷氨酰胺的含量.1.6 主要试剂亚硝基胍(NTG):瑞士Fluka 公司产品;磺胺胍(SG):美国Sigma 公司产品;硫酸二乙酯(DES)和琥珀酸(Succinic acid,Suc):上海试剂厂产品.2 结果与讨论2.1 L -谷氨酰胺诱变过程从一株嗜乙酰乙酸棒杆菌(Corynebacter ium acetoacidop hilum )ATCC13870为出发菌株,采用NT G 、DES 和C -射线诱变处理,使之获得Suc gSG r等遗传特性,得到一株L -Gln 产生菌G21-8,在适宜工艺条件下发酵液中可积累Gln 32.5g /L,最大时可达36.7g/L.选育过程见图1.图1 L -谷氨酰胺产生菌诱变过程Fig.1 Process of L -Gln producing m utants2.2 G21-8摇瓶发酵2.2.1 硫酸铵和氯化铵对产酸的影响实验中选用不同质量浓度(NH 4)2SO 4和NH 4Cl 做氮源,结果表明,用(NH 4)2SO 4发酵周期为72h,NH 4Cl 发酵周期为84h,当(NH 4)2SO 4质量浓度在50g/L 时产酸最高(见图2).2.2.2 玉米浆对产酸的影响玉米浆是影响谷氨酰胺发酵的一个重要因素[6],考虑玉米浆质量浓度对产酸的影响,结果为玉米浆质量浓度在3g/L 时产酸最高,多于或少于此量时产酸均下降(见图3).2.2.3 不同起始pH 值对产酸的影响 pH 值对菌体生长和产物形成具有特殊意义.本实验研究了83第2期杨梅等:L -谷氨酰胺高产菌株的选育和发酵条件优化不同的起始pH 值对产酸的影响,结果见图4.当pH 值在酸性时,谷氨酰胺和谷氨酸的比例相对小,随着pH 值的增大,谷氨酰胺的产量下降.实验结果表明,谷氨酰胺适合在中性偏碱性的环境中积累,最适起始pH 值为7.5.图2 (NH 4)2SO 4和NH 4Cl 对L -Gln 发酵的影响Fig.2 Effect of (NH 4)2SO 4and NH 4Cl on the f ermen -tation of L-Gln图3 玉米浆对发酵的影响Fig.3 Eff ect of corn steep liquor on the fermentation ofL-Gln图4 不同起始pH 值对产酸的影响Fig.4 Eff ect of Initial pH on L -Gln production2.2.4 正交试验玉米浆对产酸影响很大,所以考虑到接种时带入的玉米浆,同时选取葡萄糖和硫酸铵作为4个影响因素,取3个水平,采用L 9(34)正交表进行试验,结果见表1.表1 谷氨酰胺发酵培养基L 9(34)正交试验Tab.1 The result of orthogonal test实验号A 葡萄糖质量浓度/(g/L )B (NH 4)2SO 4质量浓度/(g /L )C 玉米浆质量浓度/(g /L )D接种量体积分数/%L -Gln 产量质量浓度/(g/L )1100402221.62100503334.131********.64110403430.65110504223.56110602325.17120404328.28120502427.39120603230.8K 178.380.47475.9K 279.284.995.587.4K 386.378.574.380.5R8.06.421.511.5注:其他成分同摇瓶发酵培养基.根据正交实验结果,各因素对产物的影响顺序依次为玉米浆(C )、接种量(D )、葡萄糖(A )、(NH 4)2SO 4(B ),最佳配方为A 3B 2C 2D 2.2.2.5 发酵过程曲线应用正交试验和单因素试验综合考察了培养基成分,采用最适条件,得到发酵过程曲线(见图5).发酵72h,L -Gln 的产量达到了36.7g/L,Glu 不超过5g/L.图5 发酵过程曲线Fig.5 The fermentation time course84无锡轻工大学学报第23卷2.3 遗传稳定性为检验G21-8菌种产L -Gln 的稳定性,将变异株进行连续10次传代实验,摇瓶产L -Gln(见表2).结果表明,变异株具有良好的产酸稳定性.表2 变异株传代结果Tab.2 Stability study on L -Gln reproduction 菌株代数P 2P 4P 6P 8P 10L -Gln 质量浓度/(g/L)G21-836.235.836.136.236G21-453433.43334.233.8G21-1133332.433.132.232.53 结论通过NT G 、DES 和60Co 诱变选育出的G21-8菌株最高产酸达36.7g/L,产量稳定,且Glu 产量较少,是一株优良的Gln 产生菌.应用正交实验和单因子实验综合考察了培养基成分中葡萄糖、玉米浆、(NH 4)2SO 4等成分对G21-8菌株产胺的影响,初步得到的最佳培养基(g/L)为:葡萄糖120,(NH 4)2SO 450,玉米浆3,KH 2PO 41,M gSO 4#7H 2O 0.5,M nSO 4#4H 2O 0.01,FeSO 4#7H 2O 0.02,ZnSO 4#7H 2O 0.01,碳酸钙30,pH 7.5.参考文献:[1]汪世华,康旭,吴思方,等.NH 4+和Cl -)))对谷氨酰胺发酵影响的研究[J].发酵科技通讯,2001,30(3):11-14.[2]蒋立锐.谷氨酰胺在代谢中的作用[J].氨基酸杂志,1988,(4):17-22.[3]Isao K usumo to.Industrial pr oduction of L -glutamine[J].American Society for Nutritional Sciences,2001,131:2552s-2555s.[4]章名春.工业微生物诱变育种[M ].北京:科学出版社,1984.[5]无锡轻工业学院,天津轻工业学院,大连轻工业学院,等.工业发酵分析[M ].北京:中国轻工业出版社,1992.[6]梁新梅,孙吉臻,张跃庆,等.d -生物素代替玉米浆发酵生产Glu 的研究[J].生物技术,1996,(2):30-34.(责任编辑:杨勇)85第2期杨梅等:L -谷氨酰胺高产菌株的选育和发酵条件优化。

l-谷氨酸的高效生产关键技术及产业化

l-谷氨酸的高效生产关键技术及产业化l-谷氨酸是一种重要的氨基酸，广泛应用于食品、医药、化妆品等领域。

随着人们对健康食品的需求增加，l-谷氨酸的市场需求也在不断扩大。

因此，如何高效生产l-谷氨酸成为了相关产业关注的焦点。

高效生产l-谷氨酸的关键技术之一是菌种选育。

菌种的选育直接影响到生产效率和产品质量。

目前，常用的生产l-谷氨酸的菌株主要有大肠杆菌、枯草杆菌和突变菌株等。

通过对这些菌株进行基因工程改造和筛选，可以提高菌株的l-谷氨酸合成能力和抗逆性，从而实现高效生产。

发酵工艺是高效生产l-谷氨酸的另一个关键技术。

发酵工艺包括发酵条件的优化、培养基配方的优化、发酵过程的控制等。

在发酵条件优化方面，温度、pH值、氧气供应等要素都会对l-谷氨酸的合成产生影响。

因此，通过调整这些条件，可以提高l-谷氨酸的产量和纯度。

同时，合理配置培养基组分，如碳源、氮源、无机盐等，也可以提高l-谷氨酸的产量和质量。

此外，发酵过程的控制也是关键，包括发酵时间、酵母菌的生长阶段等都需要进行精确控制。

高效生产l-谷氨酸还需要配套的下游处理技术。

下游处理技术包括分离纯化、结晶、干燥等环节。

其中，分离纯化是关键环节之一，可以通过离心、渗透膜过滤、离子交换层析等方法，将l-谷氨酸与其他杂质分离开来。

结晶和干燥则可以进一步提高产品的纯度和稳定性。

在高效生产l-谷氨酸的基础上，其产业化也是一个重要的环节。

产业化需要考虑到生产规模化、设备优化、工艺改进等方面的问题。

生产规模化是指将实验室的研究成果转化为工业化生产的能力。

这需要建立大规模的生产设备和相应的生产线，确保稳定的生产能力和产品质量。

同时，设备优化和工艺改进可以进一步提高生产效率和经济效益。

高效生产l-谷氨酸的关键技术还需要与相关的政策支持相结合。

政府可以通过制定相关政策，鼓励企业加大研发投入，提供技术支持和财务支持，加快高效生产l-谷氨酸的进程。

同时，政府还可以加强与产业界的合作，促进技术创新和产业升级。

L-Gln高产突变菌株发酵条件的初步优化

酵过程的比较：突变株ＣｌｔｍｃｍＮ —Ｕ一６对．ｇｕｉａｕ
的（验次数多，能反映因子间交叉作用）实不方法Ｈ，在选择培养基各组分的类别时，仍不失ｊ但它
为一种很有效的方法。
２２０ｍｍ的试管，照试管中加２ｍＬ蒸馏水和５× ５对
１２１高产突变株谷氨酰胺合成条件的初步优化：．．将诱变筛选得到的遗传稳定高产突变株Ｃｌｔｍｉ．ｇｕａ — ｃｍＮ—Ｕ一ｕ６作为研究对象，采用单次单因子法，以原始发酵培养条件作为初始条件进行优化，步确初
Ｎ１最佳有机氮源及其浓度：Ｌ尿素；ＨＣ；１ｇ・４玉米浆浓度：０ｇ・～，１Ｌ初始ｐＨ为７２装液量为３Ｌ种龄为１，．，０ｍ，２ｈ接种量为１０％。谷氨酰胺产量达到３．１ｇ・７２Ｌ～，比优化前的突变株（３５Ｌ）３．４ｇ・提高１．％。０９
１１１菌种高产突变株Ｃｌｔｍｉｍ．．．ｇｕａｃＮ—Ｕ一，ｕ６本
１２３１葡萄糖标准曲线的制作配制浓度为１ｇ・．．．Ｌ的葡萄糖标准溶液，９支２取５×２０ｍ的试５ｍ管，别按表１加人试剂：分将各管摇匀，水中加热沸５ｍｉ，出后立即冷却至室温，ｎ取于每管中加入２．１５ｍＬ蒸馏水，匀于５０ｎ摇２ｍ波长处测其光密度值，以葡萄糖毫克数为纵坐标，密度为横坐标，制标准光绘

谷氨酰胺转氨酶菌株的筛选及其产酶条件研究

ｐｅｉｍｅｒｎｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｏｐｔｉｍａｌｃａｒｂｏｎａｎｄｎｉｔｒｏｇｅｎｓｏｕｒｃｅｓｗｅｒｅｇｌｕｃｏｓｅａｎｄｐｅｐｔｏｎｅ．Ｔｈｅｏｐｔｉｍｕｍｍｅｄｉｕｍｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｗａｓｇｌｕｃｏｓｅ２５．０ｇ／Ｌ，Ｐｅｐｔｏｎｅ２０．０ｇ／Ｌ，Ｙｅａｓｔｅｘｔｒａｃｔ５．０ｇ／Ｌ，ＭｇＳＯ４・７Ｈ２０２．０ｇ／Ｌ，ＫＥＨＰ０４ ‘ ３Ｈ２０２．０ｇ／Ｌ，ＮａＨ２ＰＯ４２．０ｇ／Ｌ，ＣａＣＯ３３．０ｇ／ＬｒｅｃｅｉｖｅｄｂｙＯｒｔｈｏｇｏｎａｌＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＤｅｓｉｇｎ．Ｕｎｄｅｒｔｈｉｓ
摘要：利用蛋白质交联一絮凝沉淀性能测定方法，从土壤中分离得到１株高产谷氨酰胺转氨酶（ｍｉｃｒｏｂｉＭ
ｔｒａｎｓｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ，ＭＴＧ）的茵株，命名为ＨＦ－８２，初步确定为链霉菌属。单因素试验确定最适产酶氮源和碳源分别是蛋白胨和葡萄糖，正交试验确定最适发酵培养基为（ｇ／Ｌ）：葡萄糖２５．０，蛋白胨２０．０，酵母提取物５．０，ＭｇＳ０４－７Ｈ０２．０，

谷氨酰胺发酵调控

谷氨酰胺的发酵控制 /JDPP T
1
发酵条件控制代谢途径调控
2
4
右图是谷氨酰胺发酵工艺图 L-谷氨酰胺是在谷氨酸发酵工艺基础上，在谷氨酰胺合成酶作用下生产L谷氨酰胺。
谷氨酰胺
采用谷氨酸生产菌,可以实现谷氨酸发酵转向谷氨酰胺发酵。发酵转换的条件是: 一、发酵培养基中有高浓度的铵盐存在,其含氮量比谷氮酸发酵时所用的氮量多得多,在谷氨酰胺合成酶的催化下,由谷氨酸进一步合成为谷氨酸胺；二、菌体增殖进入平衡期后,发酵pH值必须调整到 6.0左右,以抑制谷氨酰胺酶的活力,避免谷氨酰胺被分解成谷氨酸。
• 中村纯等人通过敲除细菌染色体上的谷氨酸合酶基因的方法降低细胞内谷氨酸合酶活性,来减少谷氨酰胺的分解; • 通过增加编码谷氨酰胺合成酶基因的拷贝数和修饰编码谷氨酰胺合成酶基因的翻译控制区,来增强谷氨酰胺合成酶基因的表达, 促使菌体内积累更多的谷氨酰胺。
• 郑强等进行glnA基因的克隆与过量表达，利用谷氨酸棒杆菌发酵过程产生的谷氨酸为底物，在 glnA基因表达的GS酶的催化下，诱导后的重组茵发酵液中的L-谷氨酰胺产量提高了1.8倍，培养基质中的铵盐反应生成L-谷氨酰胺，理论上可以节约添加谷氨酸的成本。
• GS的表达易受到高浓度铵盐的阻遏，氮源的一次性补加也容易导致谷氨酰胺合成酶活性急剧下降；在铵盐不足时，GS表达量就会增加，所以氮饥饿处理可以提高中GS 的表达量，梯度补加氮源也可以尽量减少 GS活力的快速丧失。
1.1 氮源
• 氮饥饿处理
• 李春等为了解决高浓度铵盐阻遏谷氨酰胺合成酶表达与谷氨酰胺合成需要过量铵之间的矛盾，提出了原位氮饥饿与铵盐梯度补加协同调控策略，提高了谷氨酰胺的产量，最高可达2.19%，比原位氮饥饿工艺提高了近72%，比未经过氮饥饿处理的旧工艺提高了近200% 。

发酵法生产_L_谷氨酰胺的研究进展

发酵法生产L 谷氨酰胺研究进展L-谷氨酰胺(L-glutamine, L-Gln)是L-谷氨酸的γ - 羧基酰胺化的一种条件性必需氨基酸(图1),相对分子质量146.15,熔点185℃(分解),晶体呈白色斜方或粉末状,结晶状态下稳定,无臭,稍有甜味,溶于水( 水溶液呈酸性) ,等电点 5 . 6 5 ,几乎不溶于乙醇和乙醚. L-Gln 属中性氨基酸,在偏酸,偏碱及较高温度下易分解成谷氨酸或环化为吡咯烷酮二羧酸.O H 2N C CH2 CH2 N H 3+ CH COO-L-Gln是人体血液中浓度最高(500～900 mol/L)的游μ 离氨基酸,所占比例高达61%.L-Gln 在肾脏是肾小管泌氨作用的主要氮源,在肝脏是糖异生和尿素合成的原料,在神经组织又是神经递质的前体物质,在血液中有暂时解除氨毒的作用,现已普遍认为L - G l n 是一种"条件性必需"氨基酸. L-Gln 主要生理功能如下: 治疗胃肠溃疡[1].因外源L-Gln 能促使胆汁分泌和正常排粪,故L-Gln 已用于临床治疗腹部溃疡,节段性回肠炎和过敏性肠炎.如日本寿制药株式会社生产的"麦滋林" ,为L - G l n / 萸磺酸钠颗粒剂,该胃药制剂现已进入我国市场.缓解运动综合症或运动疲劳[2].L-Gln可以调节蛋白质合成,抑制蛋白质降解,糖原合成,细胞生长,激活免疫,提高生长激素水平.让成年人喝下一瓶含有2g L-Gln 的饮料,90min 内,其血液样品中生长激素最高可增长4 3 0 % .目前已大量用于治疗运动员的运动综合症和高强度劳动或运动后的疲劳恢复. 调节机体免疫力[3-4].外源L-Gln 会刺激免疫球蛋白分泌,促进免疫系统重建,如: 烧伤,艾滋病,关节炎等免疫系统的恢复. 增强脑神经机能[5] .L-Gln 可被用作中枢神经抑制剂,在大脑中被转化成谷氨酸,与葡萄糖一起参与脑代谢,以平衡脑内电流脉冲,有利于人脑的清醒和情绪稳定,是少数几种能克服血脑屏障和参与大脑化学反应的物质之一,被称为"大脑燃料" . L-Gln 在癌症治疗上的潜在价值[6], 减少癌症治疗中化疗和放疗的副作用. 1 L- 谷氨酰胺的生产方法由于L-Gln 重要的生理功能和临床治疗作用,如何实现L-Gln 的工业化生产越来越受到关注.L-Gln 的生产方法主要有化学合成法,酶促合成法和发酵法. 1.1 化学合成法经L-Gln 合成酶(GS)催化而成,如图 3 所示. 与化学合成法相比,酶促合成法反应步骤相对简单,其中三磷酸腺苷( A T P ) 是必需的.A T P 价格昂贵, 同时酶促反应底物NH 4 + ,副产品二磷酸腺苷(ADP)都明显抑制L-Gln 的生成,因此该生产方法不能满足大规模工业化生产的需要. 1.3 发酵法发酵法是目前最常用的L-Gln 生产方法,具有原料来源广泛,生产成本低,产品质量可控,产物单一等优点,适宜于大规模工业化生产.1 9 6 1 年,T s u n o d a 等[ 7 ] 首先发现除了谷氨酸以外,在谷氨酸发酵液中还有L-Gln;1963 年,Oshima 等[8] 通过改变谷氨酸微球菌的发酵条件使谷氨酸发酵转向L-Gln 发酵;七十年代, Nakanishi 等[9-11]进一步证实了,改变发酵条件可以使谷氨酸产生菌从谷氨酸发酵转向L - G l n 发酵.八十年代后,我国在实验室小试或中试规模中进行了L-Gln 发酵法生产,但是L-Gln 产量低[12-13] ,至今未能进行大规模工业化生产. 本文对发酵法生产L-Gln 的关键技术环节(如菌种选育,发酵工艺和分离纯化) 的研究进展进行综述,并详细阐述L-Gln生物合成代谢调控和新型过滤及其藕联技术在下游分离纯化过程中的应用. 2 2.1 发酵法生产L- 谷氨酰胺菌种选育L-Gln 生产菌种主要来自谷氨酸生产菌,如棒杆菌C H 3O H CS2 NH3 C 5 H 9 NO 4 (Glu)—————→ C 6 H 11 NO 4 —————→ C 7 H 20 N 4 O 4 S2 —————→ H 2S O 4 NH3 HOAC C 7 H 18 N 4O 3 S 2 ————→ C 5 H 10 N 2 O 3 (L-Gln) C H 3O H N H 2N H 2 Raney 镍C 5 H 9 NO4 (Glu)—————→ C 6 H 11 NO 4 —————→ C 6 H 13 N 3 O 3 —————→ H 2S O 4 C6H 10 N2O 3(L-Gln) 图2 化学法合成L-Gln 流程图Fig.2 Chemical synthetic pathway for production of L -Gln(Corynebacterium sp.)[9-11], 短杆菌(Brevibacterium sp.) [7,14] ,微球菌(Micrococcus sp.)[8].此外,还有非谷氨酸生产菌, 如产黄菌(Flavobacterium rigense)的一些变[15-18] 异菌种. 目前,L-Gln 生产菌种的选育主要采用传统的随机诱变结合定向筛选的方法,随机诱变包括化学诱变,物理诱变和物理化学复合诱变等,常用的诱变剂和诱变因素有硫酸二乙酯,亚硝基胍,γ- 射线,紫外线等; 定向筛选包括对氨基苯甲酸的结构类似物磺胺胍的抗性突变筛选,L-Gln 结构类似物抗性突变筛选,高NH 4 + 浓度抗性突变筛选等.此外,随着人们对L-Gln 生产菌株遗传特性的研究,通过基因工程的手段改造生产菌种提高L-Gln 的生产能力,有可能从根本上解决L-Gln 生产能力低的难题. Y a m a d a 等[ 1 6 , 1 8 ] 以非谷氨酸生产菌产黄菌属(Flavobacterium rigense)FERM-P no. 3556为起始菌种, 通过紫外诱变获得了一株青霉素抗性突变株FERM-P no. 3628,L-Gln 生产能力由10g/L 提高到25g/L. 湖北工业大学吴思方等[19,24]采用γ- 射线- 硫酸二乙酯-γ- 射线进行复合诱变,磺胺胍抗性筛选得到一株高产主要有如图 2 所示两种化学合成法生产L-Gln: 由化学合成法流程图可见,两种方法均采用浓硫酸作为必需的催化剂,反应条件苛刻,反应步骤多,收率低.第二种方法虽有所改进,但仍很复杂,且要求使用催化剂Raney 镍,对工艺条件提出了新的要求.化学合成法使用的化学试剂在产品中会有不同程度的残留,L-Gln 作为一种药或功能食品,对纯度有较高的要求,而且大量化学试剂的使用会造成环境污染,从而限制了产品质量及使用范围. 1.2 酶促合成法酶促合成法生产L-Gln 是以NH 4 + 及谷氨酸作原料,Glu + NH4+ + ATP GS L-Gln + ADP + Pi +H2O图3 酶法合成L-Gln 流程图Fig.3 L -Gln produced by enzyme catalysis※专题论述食科品学2008, Vol. 29, No. 03501菌株SH77,L-Gln 平均生产能力由8.2g/L 提高到55.3g/L. 孙智杰等在谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum) ATCC 1 4 0 6 7 中表达增强摄氧的透明颤菌血红蛋白基因[20]Gln 合成需要过量铵之间的矛盾,在谷氨酸棒杆菌突变株NS61 中利用GS 酶的表达特性,设计了在线氮饥饿处理的发酵过程;在限制初始氮源浓度的条件下,菌体在生长后期自然进入氮饥饿状态,G S 酶表达量增加,此后再提供充足的铵盐,提高L-Gln 的合成能力,结果使L-Gln 的产量提高了69%,达到11.5g/L,菌体内谷氨酰胺合成酶活性提高了2 倍以上.李春等[26]提出了原位氮饥饿与铵盐梯度补加协同调控策略,提高了谷氨酰胺的产量,最高产量可达 2.19%,比原位氮饥饿工艺提高了近72%,比未经过氮饥饿处理的旧工艺提高了近200%, 达到19.7g/L. 2.3 生物合成代谢调控GDH Glu + H2O + NADP +(Vitreoscilla hemoglobin gene,vgb),以此提高细胞的摄氧能力及能量的供给水平,结果在溶氧浓度只有5% 的条件下,重组菌比野生菌细胞干重提高了 1.2 倍, 达到了54.1g/L,谷氨酸的生产能力提高了6.5 倍,达到了9.56g/L, L-Gln的生产能力提高了1.4倍, 达到了5.51g/L. U s d i n 等[ 2 1 ] 从丙酮丁醇梭杆菌( C l o s t r i d i u m acetobutylicum)P262中克隆L-Gln合成酶的编码基因, 构建pHZ200 重组质粒,导入E.coli ET8051 中进行克隆表达,并研究了L-Gln 合成酶的表达调控,结果发现L-Gln 合成酶不受腺嘌呤共价修饰调控,重组菌的生长速度是野生菌的1 . 7 倍;Y a m a m o t o 等[ 2 2 ] 从腐臭假单胞菌(Pseudomonas taetrolens)中克隆谷氨酰胺合成酶基因Y- 3 0 ,导入大肠杆菌中进行克隆表达,其表达量是Pseudomonas taetrolens 中的30 倍.上述基础工作,为构建工程菌大规模工业化生产L-Gln 奠定了一定基础. 2.2 2.2.1 发酵工艺培养基Nabe 等[16] 研究了NH 4 + 浓度和延胡索酸对产黄菌属(Flavobacterium rigense)生产L-Gln的影响, 结果发现延胡索酸是L - G l n 生产的关键影响因子;高浓度N H 4+ +2-oxoglutarate + NH4+ + NADPH + H+ Glu + NH4+ + ATP GSL-Gln + ADP + P i + H2O GDH 2Glu + NADP +L-Gln + 2-oxoglutarate + NADPH + H +图4 L-Gln 发酵生产相关的生物反应及其关键酶Fig.4 Related reaction and key enzyme for production of L-GlnL-Gln 生物合成是以谷氨酸(glutamate)和NH4 + 为底物, 在谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase, GS)的催化下合成的.L-Gln 生物合成在细胞内是一个动态平衡的过程,除了受到谷氨酰胺合成酶(GS)调控外,还受到谷氨酸脱氢酶(glutamate dehydrogenase,GDH),谷氨酸合酶(glutamate synthase, GOGAT)的调控(图4)[27]. 因此,代谢调控生物合成L-Gln,须建立一套协同调控策略,促进谷氨酰胺合成酶( G S ) 活性,抑制谷氨酸合酶(GOGAT) 活性,抑制L - G l n 的降解,从而过量合成L - Gln. 2.3.1 生物合成途径中关键酶的调控Tesch 等[ 2 8 ] 在谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)中研究了N H 4 + 浓度对G D H,GS,G O G A T 活性的影响,结果发现N H 4 + 浓度从 1 m m o l / L 增加至90mmol/L 时,GDH 活性维持在1.3U/mg 蛋白,没有发生变化,但当NH4+ 浓度大于10mmol/L 时,GS,GOGAT 活性小于1mmol/L 的10%,即分别低于110U/mg 蛋白, 4 2 U / m g 蛋白;并且发现谷氨酸脱氢酶酶促反应是谷氨酸棒杆菌摄取N H 4 + 的第一步反应.此研究结果为梯度补氮生产L-Gln 提供了理论基础. S c h u l z 等[ 2 9 ] 考察了碳源和氮源对谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC 13032 中GS 和G O G A T 活性的影响,结果发现在碳源充足,氮源缺乏的条件下,G S 和G O G A T 活性分别提高了5 倍和7 倍; 在碳源和氮源都缺乏的情况下G S 活性下降了3 倍,(0.9%～1.6%)有利于L-Gln 的生产,但是当NH4+ 浓度大于1.8% 时又会抑制L-Gln 的生产;最终得出当NH 4 浓度为0.9%～1.6%,延胡索酸浓度为 5.5% 时,L-Gln 生物合成达到最大值25g/L. A n d e r s o n 等[ 2 3 ] 考察了N a C l 对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)生产L-Gln 的影响,结果发现添加5.8% 的NaCl ,L - G l n 的含量提高了2 8 0 0 %,达到161.82nmol/mg 干细胞;添加10% NaCl,L-Gln 的含量提高了3400%,达到195.71nmol/mg 干细胞. 湖北工业大学吴思方等[24] 研究了氮源种类和浓度, 金属离子,CaCO 3 等对L-Gln 生产的影响,得出最佳发酵培养基为:葡萄糖1 6 % ,氯化铵4 % ,玉米浆0 . 5 % , 磷酸氢二钾0.05%,磷酸二氢钾0.05%,硫酸镁0.05%, 尿素 1.4%,硫酸亚铁0.5mg/100ml,硫酸锰 2.5mg/100ml, 硫酸锌0.5mg/100ml, 1 0.1mg/100ml, VB 结果使菌株SH77 的L-Gln 生产能力平均达53.0g/L,最高达56.2g/L,这是目前文献报道的最高产量.2.2.2 发酵控制方式因为L-Gln生物合成是在谷氨酰胺合成酶(glutaminesynthetase,GS)催化下进行的,所以发酵法生产L-Gln 的关键在于调控G S 酶活性微生物发酵法是L-Gln 的主要生产方法,生产国主要是日本,韩国也有少量生产.1 9 7 7 年日本用发酵法生产L-Gln 的年产量达100t,1979 年上升到500t,1990 年则上升到1200t,并有逐年递增的趋势.全世界L-Gln 生产量逐年递增,在1986 年为900t,1990 年为1800t, 目前年产量约为10000t. 我国已有不少企业研究L-Gln发酵生产工艺,但只是在实验室小试或中试规模中生产L- Gln.由于发酵法生产L-Gln 国外仅日本等几个国家生产,所以国际市场对我国L-Gln 出口需求迫切,预计年出口量将迅速达到1000t. 对于我们这样一个13 亿人口的大国,L-Gln 等药用氨基酸需求量很大,有巨大的潜在市场,目前我国药用L-Gln 依靠进口且价格昂贵.预计国内L-Gln 需求可达5000 吨/ 年,现在国际市场上L-Gln 价格大约100 万元左右/ 吨,L-Gln 的生产成本大约为谷氨酸的3～4 倍,产值达到50 亿人民币,利税可达到 1 亿元人民币.因此, 发酵法大规模生产L-Gln 将满足国内的市场需求,推动我国氨基酸发酵工业的发展,同时,产品还可出口创汇进入国际市场分离纯化L-Gln 发酵过程中的主要副产物是谷氨酸,而L-Gln和谷氨酸两者分子结构和化学性质相近,分离困难,并且L-Gln 不稳定,分离过程中在酸性条件下容易转化成谷氨酸.国外80 年代报道L-Gln 提取收率为 3 0 %,近来有专利报道实验室提取收率达70% 以上[ 3 1 ] . 2.4.1 L-Gln经典提取方法L-Gln 经典提取方法有浓缩结晶法,冰析法和双柱法(阴阳离子交换树脂组合法).用离子交换法分离提取L- Gln,可将发酵液调至酸性,在酸性条件下使L-Gln 成为阳离子,用强酸性阳离子交换树脂吸附;也可将发酵液调至中性附近,使其成为阴离子,用强碱性阴离子交换树脂进行交换吸附;还可以将阳离子和阴离子交替使用. 2.4.2 L-Gln 分离纯化的最新进展新型过滤技术,过滤与离子交换耦联技术及相关设为提高发酵法生产L-Gln 产量,国内外学者进行了大量研究工作:吴思方等[28] 采用随机诱变定向筛选的育种技术,并对发酵工艺进行了优化,使L-Gln 产量达到5 6 . 2 g / L ,这是目前文献报道L - G l n 产量的最高值; Wakisaka[26]对L-Gln生物合成特性及其调控机制进行了深入研究,建立了相关的耦联发酵策略,使L-Gln 生物合备的开发应用,使L-Gln 分离提取收率,纯度得到了大幅度提高,并最终分离纯化出了符合药用标准的L-Gln.。

怎样选育一株谷氨酸高产苗

• 4.培养 • 将涂布好的平板用黑纸包好，倒置，于32。 C培养48h。
• 5.菌落计数、计算致死率以及绘制致死率曲线 • 将培养好的平板取出进行菌落计数。根据葡萄糖浓度为140g/L 的平板上的菌落数，计算出紫外线处理的致死率，计算公式如下： • 致死率= 对照每毫升菌液中活菌数 - 处理后每毫升菌液中活菌数 x100% 对照每毫升菌液中活菌数
• 7摇瓶产酸筛选包括初筛和复筛 • 1）初筛：对照斜面及上述挑取菌株的斜面培养后，分别用接种环取1环接于装有 50mL摇瓶发酵培养基德500mL三角瓶中，一个菌株接1瓶。置于振荡培养床，32。C、 96r/min培养36h。培养过程中，在无菌操作条件下，定时检测pH，当pH降低至 6.8~7.0时，加入适量无菌尿素溶液。应参照谷氨酸生产工艺，以筛少量多次为原则
• 将种子培养液接于装有47.5mL摇瓶发酵培养基的500mL三角瓶中，1个菌株接33瓶。培养过程中参照谷氨酸生产工艺，采用变速调温进行控制培养条件，并定时检查pH，当pH降至6.8~7.0时，加入适量无菌尿素溶液。发酵结束，检查发酵液中谷氨酸含量，筛选出产酸最高的1株菌株，作为生产的菌株。
• 进行添加尿素溶液。发酵结束，检测发酵液中谷氨酸含量（参照谷氨酸测定方法），确定产酸较高的5株菌株，做为复筛使用。 • 2）.复筛：取培养好的对照斜面及上述5株菌株的斜面，分别用接种环取1环接于装有 20mL摇瓶种子培养基的250mL三角瓶中，一个菌株接1瓶，置于振荡培养床，32。C、 96r/min培养10h。然后，以5%的接种量，
• (2)诱变处理 • 预热紫外灯、加菌悬液、紫外灯照射。 • 1）预热紫外灯：诱变箱的紫外灯为15W，照射距离为30cm,照射前紫外灯预热20min,使紫外线强度稳定。 • 2）加菌悬液：取5套装有磁力搅拌棒的无菌培养皿（ ɸ90mm),分别标记40s、60s、80s、100s、120s，并在每个培养皿中加入上述菌悬液 10mL。 • 3）.紫外线照射：将上述培养皿置于磁力搅拌器上，开启开关使菌悬液旋转，打开皿盖，分别照射40s、60s、80s、100s、120s。照射后，盖上皿盖，取出放在红灯下。