淋巴细胞刺激指数

小鼠淋巴细胞刺激转化指数实验

1.小鼠淋巴细胞悬液的制备

1）小鼠脱臼处死，75%酒精浸泡2-3分钟。减少污染。

2）将小鼠移入超净台内，仰卧固定在解剖盘，用眼科剪，镊子取出脾脏和胸腺（各1/2），放入装有2mL IMDM培养液的无菌平皿中。

3）将消毒好的纱布，3-4层覆盖到组织上，直头镊子固定，弯头镊子轻压组织，用移液枪反复吹打。

4）将悬液吸出，放入1.5mLEP管中，2000rpm,15-20min，吸取白色淋巴细胞层于无菌离心管中，用PBS缓冲液洗3遍。

2细胞计数

1）取上述制备好的细胞悬液混匀后，取出20mL，加到有980细mL胞计数液的EP管。

2）取20微升到细胞计数板，计数，数出四个大方格的细胞总数Y.则悬液的浓度为Y/4×104×50

3）用含有20%血清的培养液调细胞浓度至1×107/mL。

3.淋巴细胞培养

1）取含20%血清的IMDM 培养液（分别含有0g/mL,5mg/mL,10mg/mLConA)加入无菌96孔细胞培养板，每孔50mL）

2）青链霉素的浓度最终应为100单位/ml。青霉素是160万单位(0.96g)/瓶，链霉素是100万单位(1g)/瓶，取青霉素0.06g，链霉素0.1g，加10ml灭菌双蒸水，配制成青链霉素1万单位的母液，过滤后分装在小EP管中。使用时，可取1ml 母液放入100ml的培养液中，使青链霉素的浓度最终为100单位/ml。

3）再加入调好浓度的淋巴细胞悬液，50mL/孔

4）将上述培养板放入含有5%CO2的37℃培养箱中培养48-72h

4、MTT

1)结束培养前2h，在显微镜下观察细胞转化情况。

2）每孔加入MTT 5mg/mL，10mL/孔，将MTT和细胞混匀。

3）在培养箱中继续培养2h

4）取出后离心2000rpm，10min,弃去上清。

5）每孔加入100mL二甲基亚砜，将颗粒溶解，过夜。6）用酶标仪测定OD值，波长570nm.