试题库

1. 根据下列资料推出某肽的氨基酸排列顺序。

1）完全酸水解得到Phe、Pro、Glu、（Lys）2、Met和NH32）用FDNB试剂处理得到DNP－Phe3）用溴化氰水解此肽得到一个以高丝氨酸内酯结尾的二肽和一个四肽4）用胰蛋白酶水解可产生两个三肽5）用羧肽酶A或羧肽酶B处理都不能得到阳性结果答：Phe-Met-Lys-Gln-Lys-Pro2. 从下列资料推出一肽的氨基酸排列顺序。

l）含有Phe，Pro，Glu，（Lys）2；2）Edman试剂处理生成PTH－Glu3）用胰蛋白酶、羧肽酶A处理都不能得到任何较小的肽和氨基酸答：Glu-Phe-Lys-Pro-Lys，Glu -Lys-Pro-Phe –Lys3. 简述氨基酸顺序测定的方法，Edman降解法的三个具体步骤。

答：氨基酸顺序测定的方法：在分析氨基酸后下一步就是要测定肽链或蛋白质中氨基酸的结合顺序，通常可由下列几种方法配合使用分析推测出来：（1）N-端氨基酸单元的分析：最常用的有下列两种方法：（a）桑格尔方法：这项方法首先是桑格尔（Sauger，F．）提出的，他利用氨基很容易和2，4-二硝基氟氯苯（DNP）发生芳香亲核取代反应，如用一个肽和2,4-二硝基氟苯反应，显然键的N-端游离氨基和它反应，然后把这个N-端带有2,4-二硝基苯基的肽链彻底水解，在水解物中，只有一个氨基酸的α-氨基的氢被DNP取代，各种氨基酸的DNP标记化合物都是黄色的，并且都各有一个Rf值，因此很容易鉴别；所以通过这个方法，很容易辨认出肽中的N-端是哪一个氨基酸。

（b）艾德满方法：另一种标记N-端的氨基方法叫作文德满（Edman.P.）方法，用异硫氰酸苯酯和N-端的氨基反应，生成苯胺基硫代甲酸衍生物。

该化合物在无水氯化氢作用下，发生一种关环作用，形成一个苯基乙内酰硫脲的衍生物，从肽链上断裂下来，而肽链中的酰氨键不受影响。

一个肽链经上列的反应后，其结果是失去一个N-端的氨基酸，这个氨基酸可以作为取代苯基乙内酸硫脲进行鉴定。

失去一个氨基酸的肽键还可以收回，再重复上面的反应，进行第二个N-端的标记。

这种方法已经可以自动化。

假若肽键不是太长的话，一般讲这个方法是可靠的。

（2）c-端氨基酸单元的分析：c-端的氨基酸单元可以通过羧肽酶催化水解，羧肽酶可以选择性切断游离羧基相邻的肽键，在溶液中切断下来的氨基酸是C-端位置的，已切断了c-端氨基酸的肽键。

再与羧肽酶作用，如此不断进行，可以使整个多肽或蛋白质水解为氨基酸。

根据氨基酸出现的时间，可以推断C-端氨基酸的排列顺序。

实际上此法最多只能鉴定3～4个氨基酸，因此对于长链用处不大，可用于小肽（二肽、三肽等）C-端氨基酸顺序鉴定。

（3）用酶催化使肽键部分水解:测定肽键氨基顺序的一个关键是部分分解，将一个长的肽键分解为许多小肽，然后将这些小肽分离，再进行氨基酸分析，N-端基标记，这样多次地重复下去，最终得到整个肽链氨基酸的顺序。

许多消化道内分泌出来的酶可以使肽键水解。

有些酶的专一性并不很强，但是有些酶的水解是具有高度专一性的，不同的酶只能分解不同氨基酸的肽键。

Edman降解法的三个具体步骤：偶联：蛋白质和多肽的自由α-氨基经与异硫氰酸苯酯(PITC)试剂偶联，与其紧挨的第二个残基的键合力大大减弱，很容易断裂。

裂解：在无水条件下酸裂解，仅仅切下反应的那个残基，得到ATZ-氨基酸。

紧挨的第二个氨基酸残基暴露出自由的α-氨基，又可与PITC进行偶联反应。

转化：ATZ-氨基酸不稳定，三氟乙酸水溶液（25%）条件下可转化成稳定4. 简述两种N-端测定的方法，N-端测定在什么情况下出现阴性结果？答：两种N-端测定的方法:1.二硝基氟苯在弱碱性条件下，与肽链的N端氨基作用，形成二硝基苯基肽链（DNP-肽），经酸水解后，N端残基成为二硝基苯基（DNP）-氨基酸，可用有机溶剂（如乙醚）抽提，再进行纸层析或薄层层析后，根据层析斑点的位置作定性鉴定。

2.荧光剂DNS-Cl可与肽链N端氨基反应生成DNS-肽，经酸水解，N-末端残基形成DNS-氨基酸，用乙酸乙酯抽提，然后用层析法鉴定。

DNS-氨基酸于360nm或280nm处产生强烈荧光，根据荧光点位置确定N端氨基酸。

N-端测定在什么情况下出现阴性结果:Trp破环，环肽，N-端修饰5. 已知丙氨酸是某酶的底物结合部位上的一个氨基酸；一次突变丙氨酸转变为甘氨酸，但酶活性没有受到影响。

在另一次突变时，丙氨酸变成了谷氨酸，使该酶的活性明显丧失，请分析原因。

答：因为丙氨酸、甘氨酸都是中性氨基酸，且侧链较小，而谷氨酸是酸性氨基酸，侧链较大；谷氨酸的酸性侧链可能使酶蛋白构象发生改变，而导致酶活性丧失；或者是谷氨酸的酸性侧链干扰了酶与底物的结合，从而使得酶活性明显改变。

6．一大肠杆菌细胞中含15个蛋白质分子，每个蛋白质分子的平均分子量为40 000，假定所有的分子都处于α螺旋构象。

计算其所含的多肽链长度？答：每一个氨基酸残基绕螺旋轴上升0.15nm，15*40000*0.15/110已知氨基酸的平均分子质量为110d，因此总得氨基酸数目为15*40000/110。

由于α螺旋每个氨基酸长度为0.15nm ，因此肽链总长度为（15*40000/110）*0.15=818.18nm7.β-折叠的特点，简述丝心蛋白的结构特征。

β-折叠的特点：β-折叠是另外一种常见的二级结构，处于β-折叠的多肽链相对于α-螺旋来说是肽链的一种伸展状态。

分为平行（即两条链都为N→C方向）和反平行式（一条链为N→C，另一条链为C→N方向），维持β-折叠稳定性的力主要是相邻肽链（平行或反平行）之间羰基氧与酰胺氫形成的氫健。

在β-折叠结构中，某个氨基酸残基沿着链长方向大约占据0.32nm~0.34nm距离。

丝心蛋白的结构特征：丝心蛋白的主要二级结构是反平行排列的 -折叠。

丝心蛋白的一级结构含有长的重复序列片段，-Gly-Ser-Gly-Ala-Gly-Ala-。

Gly侧链氢位于折叠平面的一侧，而Ala和Ser的甲基侧链和羟甲基侧链位于折叠平面的另一侧，堆积的折叠片靠侧链之间的van der Waals力结合在一起。

8.X-ray解析蛋白质晶体结构的步骤有哪些？其中的关键是哪一步，为什么？X-ray解析蛋白质晶体结构的步骤：1. 得到生物大分子晶体。

2. 收集和处理衍射数据。

3. 确定相位，最后进行结构修订其中最关键的步骤是第一步，制备高质量的晶体。

原因：其中关键的一步是第一步，得到生物大分子结晶。

因为若蛋白质是不可结晶,则铁定不能进行X 光衍射，而且结构测定的精度依赖于晶体所能达到的衍射分辨率，所以获得具有强衍射能力的晶体是蛋白质晶体结构测定分析的关键步骤，是蛋白质晶体结构分析的瓶颈。

9. X射线衍射结构分析法对于蛋白质样品有哪些要求？简述蛋白质结晶制备方法。

x射线衍射结构分析法对于蛋白质样品有二个要求：1)蛋白质制剂必须是均匀的；2)必须是较大的单品(大于0.1mm)、晶体越大，则收集到的衍射数据的质量越好。

蛋白质结晶制备方法：1、整批结晶法的原理是瞬间将沉淀剂加入蛋白质溶液中，使溶液突然达到高度饱和状态。

2、悬滴法是利用气相平衡的原理，使任何挥发性的组分在小液滴和大样品池间达到平衡，使蛋白质液滴中沉淀剂及蛋白质的浓度逐渐增加，达到过饱和状态，最终析出晶体非常适用于只有少量样品，却要筛选大量条件的情况。

3、分批静置法10.SDS-PAGE中浓缩胶与分离胶的区别和作用，简述Western Blot的原理与方法。

区别：浓缩胶和分离胶孔径大小和缓冲液ph的不同。

浓缩胶孔径大而分离胶孔径小。

在SDS－PAGE不连续电泳中，制胶缓冲液使用的是Tris－HCL缓冲系统，浓缩胶是pH6.7，分离胶pH8.9。

在浓缩胶中，其pH环境呈弱酸性，因此甘氨酸解离很少；而Cl离子却很高，形成了较高的电压梯度。

分离胶pH的增加，呈碱性，甘氨酸大量解离。

浓缩胶的作用：不连续缓冲系统样品和浓缩胶中含tris-hcl,上下槽缓冲液含tris-甘氨酸。

样品盒浓缩胶中的氯离子形成移动界面的先导边界，而甘氨酸分子则组成尾随边界，在移动界面的两边界之间是电导较低而电位梯度较陡的区域，它推动样品中的蛋白质前移并在分离胶前沿积聚。

此处分离胶的ph值较高，有利于甘氨酸的解离，形成的甘氨酸离子穿过堆积的多肽并紧随氯离子之后，在分离胶中泳点动，sds多肽复合物从移动界面中解脱出来，在电位和ph值均匀的区段泳动，通过分离胶的筛分作用按照分子大小不同得到分离。

分离胶的作用：一是分子筛作用，分子量大的蛋白质泳动得速度慢分子量小的蛋白质泳动得速度快。

二是电荷作用，大部分的蛋白质在ph8.3电极缓冲液的条件下带有负电荷，表面负电荷多的蛋白质迁移快，反之则慢。

简述Western Blot的原理与方法：原理：蛋白质样品经SDS-PAGE电泳后，凝胶所含的样品蛋白质区带通过电泳方法转移、固定到载体（如尼龙膜、硝酸纤维素膜、PVDF膜）上，以膜上的蛋白或多肽为抗原，与相应的第一抗体和酶标记的第二抗体反应，用适当的溶液漂洗去未结合抗体后，置含底物的溶液中培育，显出谱带，即可检测出样品中的特异组分。

方法：。

第一步是做SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳，使待测样品中的蛋白质按分子量大小在凝胶中分成带。

第二步把凝胶中已分成条带的蛋白质转移到一种固相支持物上，用得最多的材料是硝酸纤维素膜(NC 膜)和PVDF 膜，蛋白转移的方法多用电泳转移（转移电泳），它又有半干法和湿法之分，现在大多用湿法。

第三步是用特异性的抗体检测出已经印迹在膜上的所要研究的相应抗原。

免疫检测的方法可以是直接的和间接的。

现在多用间接免疫酶标的方法，在用特异性的第一抗体杂交结合后，再用酶标的第二抗体（碱性磷酸酶（AP）或辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗第一抗体的抗体）杂交结合，再加酶的底物显色或者通过膜上的颜色或X 光底片上暴光的条带来显示抗原的存在。

11. 二维电泳包括哪两个步骤？中间为什么需要进行胶条平衡？第一向进行等电聚焦(isoelectric focusing, IEF)，由于蛋白质具有两性解离和等电点特性，将蛋白质样品加载至pH梯度介质上进行电泳时，会向与其所带电荷相反的电极方向移动。

移动过程中，蛋白分子可能获得或失去质子，并随着移动的进行，该蛋白所带的电荷数和迁移速度下降。

当蛋白迁移至其等电点pH 位置时，其净电荷数为零，在电场中不再移动。

当蛋白扩散到低于其等电点pH 区域时，带正电荷，在电场的影响下重新向阴极移动。

同样，如果蛋白质扩散到高于其等电点的pH 区域时，则带负电，在电场的作用下会向阳极移动。

根据各自不同的等电点，蛋白质最终被聚焦在一个很窄的pH 梯度介质区域内。

目前常使用预制胶条(IPG, immobilized pH gradient) 用于蛋白质的等电聚焦分离，将聚焦好的IPG 胶条在含有SDS 的缓冲液中平衡。