热休克蛋白70和糖调节蛋白94在人胃癌细胞BGC2823中的表

热休克蛋白70和糖调节蛋白94在人胃癌细胞BGC2823中的表达△首都医科大学基础医学院病理学教研室(北京100054)　王巧侠3　王小平　刘国贞 摘　要　目的:探讨热休克蛋白70(H SP70)和糖调节蛋白94(grp94)在人胃癌细胞B GC2823中的表达及其意义。

方法:利用EnV isi on免疫细胞化学、双抗体标记免疫荧光和流式细胞仪方法检测和分析人胃癌细胞B GC2823中H SP70和grp94的表达及其与细胞周期的关系。

结果:胃癌细胞存在H SP70和grp94的高表达,免疫细胞化学显示H SP70和grp94主要定位于胞浆;免疫荧光法和流式细胞仪检测显示H SP70的表达阳性率为84.9%,grp94为79.7%,与阴性对照组存在明显的差异;在整个细胞周期均存在H SP70和grp94的持续表达。

结论:胃癌细胞存在H SP70和grp94的高表达,在整个细胞周期H SP70和grp94均持续表达,其表达与细胞周期无明显关系。

H SP70和grp94在人胃癌细胞中的表达特点为瘤苗的研究奠定了基础。

主题词　热休克蛋白质70 免疫学　@糖调节蛋白94　胃肿瘤 免疫学Expression and sign if icance of hea t shock prote i n70and glucose-regula ted prote i n94i n hu man ga str ic carc i noma BGC-823cell l i neD ep artm en t of Patho logy,Cap ital U n iversity of M edical Sciences(B eijing100054)　W ang Q iaox ia　W ang X iaop ing　L iu Guozhen ABSTRACT　O b jective:To study exp ressi on and sign ificance of H SP70and grp94in hum an gastric carcinom a BGC2823.M ethods:Gastric carcinom a BGC2823cell slides w ere co llected.H SP70and grp94exp ressi on w as detected by i m m unochem istry,doub le2labelled an tibodies i m m uno influ resen t.T he relati on sh i p betw een H SP70,grp94 and cell grow th cycle w as analized by FA CS.R esu lts:Compared w ith con tro ll group,gastric cancer BGC2823cells exp ressed h igh level of H SP70and grp94,w h ich w ere localized in cellu lar cytop las m.DNA con ten t analysis revealed that H SP70and grp94w ere exp ressed con tinuou sly th roughou t the w ho le cell cycle.Conclu si on:H um an gastric carcinom a BGC2823cells had h igh level exp ressi on of H SP70and grp94th rough the w ho le cell cycle.FA CS analysis show ed that there w as no relati on sh i p betw een exp ressi on of H SP70,grp94and cell cycle.T he study on exp ressi on of H SP70and grp94in hum an gastric carcinom a BGC2823w ill lay a basis fo r fu rther research on an ti2tumo r i m m uno therapy. KEY WORD S　H eat shock p ro tein70 i m m uno logy　@Gluco se2regu lated p ro tein94　Stom ach　neop lasin s i m m uno logy 增强和提高肿瘤的免疫原性是诱发肿瘤特异性主动免疫的关键。

许多研究表明,多种肿瘤细胞表达热休克蛋白家族,来源于某种肿瘤的H SP70和grp94多肽复合物可以激发特异的抗瘤免疫反应1。

用H SP70或grp94高表达的肿瘤细胞或肿瘤细胞中H SP70或grp942抗原肽提取物免疫小△北京市青年科技骨干基金资助(02120031)3兰州大学医学院2003级硕士研究生鼠可在体内激活大量具有杀伤活性的淋巴细胞,诱发小鼠特异性抗肿瘤能力2,3。

本次实验应用免疫细胞化学,免疫荧光和流式细胞仪方法,研究H SP70和grp94在胃癌细胞B GC2823中的表达及其与细胞周期的关系,为今后瘤苗的研究奠定基础。

材料和方法1　细胞和试剂　人胃癌细胞株B GC2823由本室保存。

兔抗人H SP70多克隆抗体,小鼠抗人grp94单克隆抗体,购自D ako生物公司。

TR I CT 标记的羊抗兔IgG抗体,F ITC标记的羊抗小鼠IgG抗体购自San ta公司。

EnV isi onTM试剂盒购自迈新生物公司。

2　细胞爬片的制备　胰酶消化对数生长期人胃癌细胞B GC2823,制备单细胞悬液,接种2×104B GC2823细胞于铺有盖玻片的24孔培养板中,37℃培养过夜;次日收集细胞爬片,以甲醇:丙酮(V V=1 1)4℃固定15m in,PB S(pH7.4)洗涤后,室温干燥备用。

3　免疫细胞化学检测H SP70和grp94在胃癌细胞中的表达　采用EnV isi on染色法。

细胞爬片经0.3%H2O22甲醇溶液室温条件下封闭内源性过氧化物酶30m in。

将切片浸浴于柠檬酸盐缓冲液中采用微波修复抗原10m in。

然后分别加入兔抗人H SP70多抗或小鼠抗人grp94单抗(1∶100)后置于湿盒中37℃孵育60m in。

PB S彻底漂洗后,切片加入HR P标记的羊抗兔和羊抗小鼠抗体(1∶100)室温孵育30m in。

彻底漂洗后,再加入新鲜配置的二连苯胺溶液(DAB,Sigm a公司)显色8m in,漂洗后苏木素套染胞核,脱水,风干,粘片。

小鼠抗人甲胎蛋白替代一抗作为阴性对照。

4　免疫荧光双抗体标记法和碘化亚啶(P I)双重染色检测H SP70和grp94的表达与细胞周期的关系　B GC2823对数生长期细胞经胰酶消化,离心后收集细胞沉淀;一组细胞经85%冷丙酮4℃固定15m in;离心,PB S(pH7.4)漂洗3次;先加入兔抗人H SP70多抗(1∶50),37℃孵育30m in;充分洗涤后,再加入小鼠抗人grp94单抗(1∶50), 37℃孵育30m in;充分洗涤后,加入混合后的TR I CT标记的羊抗兔IgG抗体和F ITC标记的羊抗小鼠IgG抗体(1∶20),37℃孵育30m in,充分洗涤;离心,细胞沉淀复悬于0.5m l PB S缓冲液中,流式细胞仪(FA CS)检测荧光表达率。

同法准备另一组经免疫荧光双染色的细胞悬液0.5m l,加入等量P I染液(50Λg m l)混合,4℃放置20m in;FA CS 分析H SP70和grp94表达与细胞周期的关系。

H SP70、grp94在胃癌细胞中的表达率采用ς2检验进行统计学分析。

结　果1　H SP70和grp94在胃癌细胞中的表达　H SP70和grp94的阳性表达表现为胞核或胞浆的棕黄色着染。

每张切片的不同视野计数500个细胞,然后计算阳性细胞的百分率。

免疫细胞化学显示约92.0%的胃癌细胞中表达H SP70,而grp94在84.0%的胃癌细胞中存在表达,与阴性对照组存在明显的差异(P<0.01)。

H SP70和grp94主要定位于胞浆。

2　H SP70和grp94的表达在胃癌细胞中的表达与细胞周期的关系　FA CS检测结果显示H SP70在胃癌细胞中的表达率为84.9±4.94%,而grp94的表达率为79.6±5.16%,与阴性组(1.9±0.94%)存在明显差异。

FA CS分析细胞周期显示,G1期细胞59.2%,G2期细胞14.9%,G1 G2=1.879;分析显示,胃癌细胞整个细胞周期均有H SP70和grp94表达,G1期与G2期的表达基本一致。

讨　论本次研究采用免疫细胞化学方法检测了胃癌细胞B GC2283中H SP70和grp94的表达,结果显示胃癌细胞存在H SP70和grp94的高表达,以胞浆表达为主。

免疫荧光双抗体和流式细胞仪检测H SP70的表达阳性率约为84.9%,grp94为79. 6%,在整个细胞周期均有H SP70和grp94的表达,G1期和G2期的表达量基本一致,它们的表达与细胞周期并无明显关系,其他肿瘤的研究也有相似的结果4,5。

H SP s是一组热诱导后合成的高度保守的蛋白分子。

在哺乳类细胞中,根据其结构和功能的关系可分为两大类:热休克蛋白类(H SP s)和糖调节蛋白类(grp s)。

在正常细胞的生长和发育过程中, H SP70和grp94受细胞周期调控,呈持续低水平表达,在应激条件下表达显著增加,发挥分子伴侣作用。

但是肿瘤细胞可在没有任何刺激条件下独立于细胞周期持续高水平表达1～5。

研究表明H SP70和grp94的表达和肿瘤细胞的生长和发展可能存在相关性,H SP70和grp94的高水平表达参与了一些肿瘤的形成,但是它在肿瘤发生中的作用还不明确6。

合理的推论就是H SP70和grp94在一些肿瘤细胞中的过表达与肿瘤的生存和增殖密切关联7,8。

因而可以推断在不同的刺激和应激条件下,胃粘膜细胞为躲避有害因素引起的损伤不得不转录和翻译高水平的H SP s以维持细胞正常的代谢和功能。

在这种情况下,粘膜细胞迅速合成H SP s来发挥保护细胞的作用。

胃癌的发生是在各种刺激长期作用下逐渐进展的过程。

在这个过程中,H SP s的合成逐渐增加。

近来的研究表明H SP s通过与一些原癌基因产物的结合的途径如信号转导和细胞周期调控参与细胞的生长和增殖9,10。