分子标记技术及其应用 9Chapter9 SSR
分子标记技术的原理和应用
分子标记技术的原理和应用1. 简介分子标记技术是一种用于标记和检测生物分子的方法。
通过在目标分子上引入特定标记物，可以实现对这些分子进行定量、定位及特异性检测。
本文将介绍分子标记技术的原理和应用。
2. 原理分子标记技术主要通过以下步骤来实现对目标分子的标记和检测：•选择标记物：标记物通常是具有特异性的分子或结构，如荧光染料、酶、金纳米颗粒等。
根据标记物的特性和应用需求，选择合适的标记物。
•引入标记物：将选定的标记物与目标分子进行结合。
这可以通过化学反应、酶促反应或物理吸附等方法实现。
•检测标记物：使用适当的检测方法，如光谱分析、电化学方法等，对标记物进行定量或定性检测。
这些方法可以根据标记物的特性和需求选择。
3. 应用分子标记技术在许多领域都有广泛的应用。
以下是一些主要的应用领域：3.1 生物医学研究•免疫组织化学：通过标记特定抗体来检测组织中的蛋白质，用于研究疾病诊断、治疗反应和组织学研究。
•分子诊断：使用分子标记技术检测体液中的特定生物分子，如DNA、RNA和蛋白质，用于早期疾病诊断和个体化治疗。
•药物研发：利用分子标记技术对药物与靶标的相互作用进行研究，加速药物研发过程。
3.2 食品安全检测•农药残留检测：使用分子标记技术检测食品中的农药残留物，保证食品安全。
•食品成分分析：通过标记特定分子，检测食品中的成分和添加物。
3.3 环境监测•水质检测：使用分子标记技术检测水中的有害物质和污染物，保护环境和人类健康。
•大气污染监测：通过标记特定分子，检测大气中的污染物，评估空气质量。
3.4 基因组学研究•基因定位：使用分子标记技术对基因组中特定序列进行定位和研究。
•基因表达分析：通过标记RNA或蛋白质，研究基因在各个组织中的表达情况。
4. 总结分子标记技术以其高灵敏度、高特异性和高可视性等优势，在生物医学研究、食品安全检测、环境监测和基因组学研究等领域具有广泛的应用前景。
随着技术的不断发展和创新，相信分子标记技术将在未来发挥更大的作用，并为各个领域的研究和应用带来更多的突破。
ssr分子标记原理
ssr分子标记原理SSR分子标记原理引言：SSR分子标记（SSR molecular tagging）是一种用于分析和鉴定生物体内特定分子的技术。
它基于分子生物学和生物化学的原理，通过特定的标记物，可以在细胞、组织或体液中准确地检测和定位目标分子。
本文将介绍SSR分子标记的原理及其在科研和医学领域的应用。
一、SSR分子标记的原理SSR分子标记是一种基于DNA序列多态性的分子标记技术。
它利用了DNA序列中的简单重复序列（simple sequence repeat, SSR），即由1-6个碱基重复组成的核酸序列。
SSR序列在基因组中广泛存在，具有高度变异性和遗传稳定性，因此可以作为DNA分子标记的候选序列。
SSR分子标记的原理可以简单概括为以下几个步骤：1. DNA提取：从样品（如细胞、组织或体液）中提取总DNA。
2. SSR标记物设计：根据目标分子的序列信息，设计特异性引物，引物的两端分别包含互补的SSR序列。
3. PCR扩增：利用PCR技术，使用设计好的引物对DNA进行扩增，扩增产物中包含了目标分子的序列和SSR序列。
4. 电泳分析：将PCR扩增产物进行电泳分析，根据SSR序列的长度变异性，可以将不同样品中的目标分子进行定性和定量分析。
二、SSR分子标记的应用SSR分子标记技术在科研和医学领域具有广泛的应用价值，以下是几个典型的应用案例：1. 遗传多样性研究：SSR分子标记可以用于研究不同物种或不同个体间的遗传多样性。
通过对多个基因座进行SSR分子标记，可以获得物种或个体的遗传背景信息，进而推断种群结构、基因流动和进化关系等。
2. 基因定位和图谱构建：SSR分子标记可以用于构建遗传图谱，帮助研究人员定位和克隆感兴趣的基因。
通过SSR标记物在遗传图谱上的位置，可以确定目标基因的大致区域，为后续的克隆工作提供有力的指导。
3. 疾病诊断和预后评估：SSR分子标记在医学诊断中的应用也日益广泛。
通过对特定基因的SSR序列进行分子标记，可以检测和鉴定与疾病相关的突变或多态性。
分子标记技术原理方法及应用
分子标记技术原理方法及应用分子标记技术是一种用于检测和定位特定分子的方法。
其原理是通过将一种特殊的化学物质（标记物）与目标分子结合，然后利用标记物的性质来对目标分子进行分析和检测。
分子标记技术被广泛应用于生物医学研究、生物学检测和药物研发等领域。
常用的分子标记技术有荧光标记、酶标记和放射性标记等。
荧光标记是一种将目标分子与荧光染料结合的技术。
荧光标记的原理是通过荧光染料的特性，使得目标分子在荧光显微镜下显示出特定的荧光信号，从而对其进行定位和分析。
荧光标记可以在细胞、组织和体内进行，具有灵敏度高、分辨率高和实时监测的优点。
常见的荧光标记方法有间接免疫荧光标记、原位杂交荧光标记和荧光蛋白标记等。
荧光标记技术广泛应用于细胞定位、蛋白质相互作用研究、细胞分析和分子诊断等领域。
酶标记是一种利用酶与底物反应的方法进行分子标记。
通常，酶标记将目标分子与特定的酶（如辣根过氧化酶、碱性磷酸酶等）结合，然后通过对底物的催化作用产生显色或荧光信号。
酶标记在生物学检测中得到广泛应用，特别是在酶联免疫吸附试验（ELISA）中。
酶标记具有灵敏度高、稳定性好的特点，可以用于检测蛋白质、核酸和小分子等生物分子。
放射性标记是利用放射性同位素与目标分子结合的技术。
放射性同位素具有高灵敏度和长时间半衰期的特点，可以用于追踪和测定目标分子的存在和分布。
放射性标记技术广泛应用于细胞和分子影像学、放射性定位和药物代谢等领域。
分子标记技术在生物医学研究、生物学检测和药物研发等领域有着广泛的应用。
在生物医学研究中，分子标记技术可以用于研究细胞和分子的结构和功能，探索疾病的发生机制和药物的作用机理。
在生物学检测中，分子标记技术可以用于检测和定位特定的生物分子，如蛋白质、核酸和小分子等，从而实现对生物过程的观察和分析。
在药物研发中，分子标记技术可以用于筛选和评价药物的活性和毒性，以及研究药物的代谢和药理学特性。
总之，分子标记技术的发展和应用为生物医学研究和生物学检测提供了强大的工具，有助于我们深入理解生命的奥秘和开发有效的治疗手段。
分子标记技术及其应用ISSR
Dissolve by stirring at 37℃, adjust volume to final with ddH2O.
பைடு நூலகம்
Running Acrylamide Gels
Installation of plates
✓ Mount the gel with the short glass plate inwards in the electrophoresis apparatus. Make sure that the buffer valve is closed.
✓ Pour 500 ml 1x TBE into the upper chamber and rinse between the plates with a syringe containing some buffer.
✓ If no buffer leaks from the upper chamber can be found, 500 ml 1x TBE can be poured into the lower chamber.
5′锚定引物 NNNN(CA)n
3′锚定引物 NN(CA)n
锚定ISSR-PCR示意图
CACACACACACACACA GTGTGT GTGTGTGTGT
3′锚定引物的PCR产物
GTGTGT GTGTGT GTGTGTGT GTGTGTGT CACACACACACACACACACACACACACA
Detect of PCR product and statistical analysis
0.5～2.0% Agarose gel electrophoresis
EB staining
6％ PAGE
分子标记技术的类型原理及应用
分子标记技术的类型原理及应用分子标记技术是一种基于分子生物学的技术，在研究、诊断和治疗等领域具有广泛的应用价值。
这种技术利用染料、荧光物质、辐射标记物等来标记目标分子，从而实现对分子的检测、追踪和研究。
下面将介绍分子标记技术的几种类型、原理及应用。
一、荧光标记技术荧光标记技术是一种常见的分子标记技术，基于物质的荧光特性，通过在目标分子上标记荧光染料或荧光蛋白等物质，实现对目标分子的可见或可荧光检测。
该技术的原理是标记物被激发后会发出荧光，通过检测荧光信号的强度、波长或寿命等特征来获得关于目标分子的信息。
荧光标记技术在生物学研究、生命体内药物输送系统的研究和临床诊断等方面得到了广泛的应用。
在生物学研究中，荧光标记技术可以用于研究细胞结构和功能、蛋白质相互作用、细胞内信号传导等。
在药物输送系统的研究中，荧光标记技术可以用于研究药物在体内的分布和代谢情况等。
在临床诊断中，荧光标记技术可以用于检测血液中的病原体、肿瘤标志物以及其他疾病相关分子等。
二、辐射标记技术辐射标记技术是一种通过辐射标记物对目标分子进行标记的技术。
常用的辐射标记物包括放射性同位素和放射性荧光染料等。
该技术的原理是通过辐射标记物自身所放出的辐射（如α、β射线等）或荧光来检测目标分子。
辐射标记技术在医学、生物学和环境科学等领域都有广泛的应用。
在医学方面，辐射标记技术可以用于肿瘤的早期诊断和治疗、药物代谢和排泄的研究等。
在生物学方面，辐射标记技术可以用于研究生物体的代谢过程、病原体的传播途径等。
在环境科学方面，辐射标记技术可以用于了解污染物的迁移和转化、生态系统的功能及稳定性等。
三、化学标记技术化学标记技术是一种通过化学反应将标记物与目标分子结合的技术。
常见的化学标记物包括生物素、抗原抗体等。
该技术的原理是通过物质间的化学反应使两者结合，并通过检测化学标记物的特征来获得目标分子的信息。
化学标记技术在生物医学研究、食品安全检测和环境监测等领域有广泛应用。
常用分子标记技术原理及应用 共35页
形态标记（Morphological marker）
形态学上 如何区分
细胞学标记
植物细胞染色体的变异：包括染色体核型（ 染色体数目、结构、随体有无、着丝粒位置 等）和带型（C带、N带、G带等）的变化。
优点: 能进行一些重要基因的染色体或染色 体区域定位。 缺点: (1)材料需要花费较大的人力和较长时 间来培育，难度很大。
分子标记的特点： (相对形态，细胞，生化标记具有的优点)
（1）直接以DNA的形式表现，在生物体的各个组织、各个发育 阶段均可检测到，不受季节、环境限制，不存在表达与否等问题 ；
（2）数量极多，遍布整个基因组，可检测座位几乎无限； （3）多态性高，自然界存在许多等位变异，无须人为创造； （4）表现为中性，不影响目标性状的表达； （5）许多标记表现为共显性的特点，能区别纯合体和杂合体 。
几种主要的ＤＮＡ分子标记
英文缩写 RFLP STS RAPD AFLP SSR SNP
英文名称
Restriction fragment Iength polymorphism
Sequence tagged site
Random amplified polymorphic DNA
Amplified frangment length Polymorphism
(2) 有些变异难以用细胞学方法进行 检测。
人类22对常染色体
细胞学标记
细胞分裂中期（Metaphase）
• 染色体组karyotype(Chromosome phenotype) analysis
生化标记（Biochemical Marker）
概念：主要包括贮藏蛋白、同工酶等标记，也指以基因表达的 蛋白质产物为主的一类遗传标记系统。
DNA分子标记技术及其应用
DNA分子标记技术及其应用摘要：分子遗传标记是近年来现代遗传学发展较快的领域之一。
本文系统阐述了DNA分子标记的概念，以及RFLP、RAPD、ALFP、STS、SSR和SNP为代表的分子标记技术的原理和主要方法，并简单介绍了DNA分子标记技术的应用。
最后探讨了其进展以及存在的一些问题。
关键词：分子标记；应用分子遗传标记技术作为一种新的分子标记技术，在分子生物学特别是在分子遗传学的研究中得到了广泛的应用和发展，其所构建的遗传图谱具有高度的特异性。
与其它遗传标记相比较，DNA分子标记具有诸多优点，如：遗传稳定，多态性高，多为共显性，数量丰富，遍及整个基因组，操作简便。
这些优点使其广泛地应用于生物基因组研究、进化分类、遗传育种、医学等方面，成为分子遗传学和分子生物学研究与应用的主流之一。
1DNA分子标记的概念遗传标记是基因型特殊的易于识别的表现形式，在遗传学的建立和发展过程中起着重要作用。
从遗传学的建立到现在，遗传标记的发展主要经历了4个阶段，表现出了4种类型：1形态标记（Morphological Markers），指生物的外部特征特性,包括质量性状作遗传标记和数量性状作遗传标记；2细胞标记（Cytological Markers），主要指染色体组型和带型；3生化标记（Biochemical Markers），指生物的生化特征特性，主要包括同工酶和贮藏蛋白两种标记；4DNA分子标记（Molecular Markers）是以生物大分子（主要是遗传物质DNA）的多态性为基础的一种遗传标记。
前3种标记是对基因的间接反映,而DNA分子标记是DNA水平遗传变异的直接反映。
与其它遗传标记相比较，DNA分子标记具有诸多优点，如：遗传稳定，多态性高，多为共显性，数量丰富，遍及整个基因组，操作简便。
这些优点使其广泛地应用于生物基因组研究、进化分类、遗传育种、医学等方面。
目前，被广泛应用的DNA分子标记主要有RFLP（限制性片段长度多态性）、RAPD（随机扩增多态性DNA）、ALFP（扩增片段长度多态性）、STS（序列标记位点）、SSR（简单重复序列）和SNP（单核苷酸多态性）等。
分子标记技术及其应用_ISSR
• 徐志祥等ISSR分子标记对南丰柑桔品种的遗传多样 性进行研究。从100个ISSR引物中筛选出17个多态引
物，对14份柑桔样品进行ISSR-PCR分析。UPGMA聚类
分析结果表明，以遗传相似系数为0.67为分界线， 可以将14份供试柑桔样品分成三类：第一类包含以 ss-28为代表的7个柑桔品种；第二类包含以杨小2,6 为代表的3个柑桔品种；第三类包括以早系97-1 为
5′锚定引物 NNNN(CA)n
3′锚定引物 NN(CA)n
锚定ISSR-PCR示意图
CACACACACACACACA
GTGTGT GTGTGT GTGTGTGT GTGTGTGT
GTGTGT GTGTGTGTGT
CACACACACACACACACACACACACACA
3′锚定引物 NN(CA)n
PCR扩增反应
反应体系 • 模板DNA • dNTP • 引物 • Taq DNA聚合酶 • PCR反应缓冲液
扩增步骤
• 变性（denaturation） • 退火（anealing） • 延伸(extension)
PCR产物的电泳与数据分析
•
•
PCR产物需经电泳分离、染色显示后才能进行 条带观察、统计。
代表的4个柑桔品种。
基于ISSR分析的14份南丰蜜桔UPGMA聚类图
种质资源鉴定与亲缘关系
分子标记技术及其应用
RFLP
1.1 基于Southern杂交的分子标记
小卫星DNA又称数目可变串联重复序列 （Variable Number of Tandem Repeat，VNTR）是一种重复DNA小序 列，为10-几百核苷酸，拷贝数10-10000 不等。
– 缺点：多态性分布集中，合成探针困难，应 用并不广泛。
Right primer
SBE1 CAPS marker derived from 3’-end was used to detect SBE1 gene in DH lines
SCAR标记
1.2 基于PCR技术的分子标记
简单重复序列（Simple Sequence Repeat， SSR）或称微卫星DNA（Microsatellite Repeat）、简单串联重复序列（Short Tandem Repeat Polymorphism，STRP）。 –在真核生物中，存在许多2-5bp简单重复序 列，称为“微卫星DNA”其两端的序列高度保 守，可设计双引物进行PCR扩增，揭示其多 态性。
–酶切扩增多态性序列（Cleaved Amplified Polymorphic Sequence，CAP） –序列特异性扩增区（Sequencecharacterized Amplified Region，SCAR） 和位点特异相关引物（Allele－Specific Associated Primers，ASAP）
–无种属特异性 –适合于自动化分析 –不需制备探针、杂交等程序，成本较低。 –DNA用量少，允许快速、简单地分离基因组 DNA。
1.2 基于PCR技术的分子标记
RAPD缺点：
–是一种显性标记 –稳定性较差
1.2 基于PCR技术的分子标记
常用分子标记技术原理及应用-文档资料
分子标记的分类
在遗传学研究中广泛应用的DNA分子标记已经发展了 很多种，一般依其所用的分子生物学技术大致可以分 为三大类： 第一类：是以分子杂交为核心的分子标记，包括RFLP、DNA
指纹技术等，这类分子标记被称为第一代分子标记；
第二类：是以PCR为核心的分子标记，包括随机扩增多态性 RAPD、简单序列重复SSR、扩增片段长度多态性AFLP、序列 标签位点STS等，为第二代分子标记； 第三类：是一些新型的分子标记，如：SNP标记、表达序列 标签EST标记等，也以PCR技术为基础，为第三代分子标记。
eg:蛋白质标记如种子贮藏蛋白同工酶（指由一个以上基 因位点编码的酶的不同分子形式）
2.狭义的分子标记（DNA marker)概念只是指DNA标记
能反映生物个体或种群间基因组中某种差异特征的
DNA片段，它直接反映基因组DNA间的差异。
分子标记（DNA marker）
分 子 标 记 的 概念：是以直接检测DNA核苷酸序列的 差异为基础的遗传标记，又叫DNA分子标记。 分子标记的特点： (相对形态，细胞，生化标记具有的优点)
几种主要的ＤＮＡ分子标记
英文缩写 RFLP STS RAPD AFLP 英文名称 Restriction fragment Iength polymorphism Sequence tagged site Random amplified polymorphic DNA Amplified frangment length Polymorphism 中文名称 限制性片段长度多态性 序列标签位点 随机扩增多态性DNA 扩增片断长度多态性
( Amplified Fragment Length Polymorphism )
分子标记参考资料
分子标记技术及其应用I. Term Explanation (10%, 2 points for each)1. Probe：是一段具有特异碱基序列的单链DNA或RNA分子，经过放射性或非放射性标记、杂交，用于检测互补碱基序列（Single-stranded DNA or RNA molecules of specific basesequence, labeled either radioactively or non- labeled, that are used to detect the complementary base sequence by hybridization.）2. Marker-assisted selection (MAS)：通过对分子标记检测目标基因与某个分子标记的连锁，获知目标基因的基因型。
借助分子标记对目标性状的基因型进行选择，这称为MAS。
3. Gene pyramiding：通过分子标记，选择与目标基因连锁的基因型，将分散在不同品种中的有用基因聚合到同一个基因组中。
4. Molecular marker：是指能反映生物个体或种群问基因组中某种差异特征的DNA片段。
这种DNA片段的特性可通过将基因组DNA经限制性内切酶酶切、PCR扩增、分子杂交等技术在电泳凝胶上检测出来。
DNA分子标记是遗传变异在DNA水平上的直接反映。
5. Recombination inbred Lines (RIL)：由两个亲本杂交后，从F2代开始采用SSD等方法经连续多代自交或姊妹交而育成的近交系。
6. Quantitative trait loci (QTL)：控制数量性状的基因在基因组中的位置称为数量性状基因座（QTL）。
7. Primer：一段DNA或RNA序列。
通过复性结合到模板单链DNA，在DNA聚合酶作用下，能使核苷酸数目得到增加。
（A short DNA or RNA fragment annealed to a singled-strandedDNA and to which further nucleotides can be added by DNA polymerase. ）8. Genetic marker：指受基因控制的能够稳定遗传的，且能代表个体或群体的遗传特征，并可被用作遗传分析的物质。
SSR分子标记
细胞通讯和信息传导
杨一 细胞通讯是指在生物体内细胞与细胞之间的联络、 识别以及相互作用称细胞通讯。 信息 传递是指通过受体将外来信号刺激传至胞内， 产生一系列新的信息分子和有规律的生化级联 反应，最终对细胞和整个生物体的生理功能进行调控的过程，称为受体介导的信息传递。 1. 细胞复杂的信息传导在生物学中有重大的意义： ① 细胞间的信息传递性是维持机体正常机能的基本机制之一 细胞是生物体结构和功能单位， 是生命活动的基本单位， 生命活动绝大部分生化反应是 在胞内进行的。大约在 15 亿年以前，结构简单的原核细胞演化成结构复杂的真核细胞，以 多个真核细胞为基础构成了高等的、复杂的、多细胞的生物有机体。多细胞生物学特点是细 胞产生了特化，同时又能协作，使众多细胞联合成一个协调的整体。多细胞机体内细胞间的 信息传递是维持机体正常机能的基本生物学机制之一。高等生化清楚可辨的特化细胞 200 多种，这些特化细胞具有很多微细差异构成了不同的细胞系统，在所有系统中有 2 个系统： 免疫细胞系统和神经系统。 ② 特化了的细胞的协作和协调 1）免疫细胞系统具有化学识别能力，能够识别“异己” ，消灭其致病作用，当病毒 细胞侵入体内，辅佐细胞提呈 TDAg、TiAg 激活 TC 介导细胞免疫应答(CML)、BC 介导细胞体 液免疫应答(Ig)消灭致病作用。ICC(免疫活性细胞)吞噬病毒、细菌，首先涉及到识别异己的 能力，如何识别并把信息传递给其它 ICC，这就涉及细胞通讯和信息传递问题。 2）神经系统功能是传递兴奋，它迅速将感受器⇌CNS，使多细胞高等生物适应周围 环境，且使 C 各部分协调一致。这种 IS 识别“异己”到消灭“异己” ，神经细胞传递“兴奋” 都属细胞通讯和信息传递范畴。 ③ 人体通讯的三大干线和两类信息物质及三种传递方式 假若大脑是人的通讯总站，人的细胞通讯和信息传递至少有 3 大干线： “硬线”NS； “软线” IS；经络系统。 目前， 了解比较深入的细胞外信息物质有两大类， 一类是甾体激素， 它们可以通过膜脂双层， 自由进入细胞与胞浆或核内相应受体反应，从而影响基因活动。另一类包括蛋白质、多肽、 生物胺等其它小分子，它们共同特点是不能通过脂双层，其信息传递方式有如下几种： 1）简单直接摄入，如 Na+、K+、ATP 酶转运细胞内 Na+、K+可视为特殊信息物 质、 影响细胞内代谢过程。 2）与载体蛋白结合后进入细胞、如 VitB12 和胆固醇。 3）通过受体跨膜信息传递。 2. 信息传递 ①信息传递——通过受体将外来信号刺激传至胞内， 产生一系列信息分子和有规律的生 化级联反应，最终对细胞和整个生物体的生理功能进行调控的过程，称（受体介导的） 信息传递。 ②信息分子——传递信息的媒介称为信息分子。 ③信息传递的方式，可分为： 1） 直接传递——如局部化学介质，在邻近小群 C 之间传递信息； 2） 间接传递——如激素细胞因子（第一信使）→膜 R 结合，活化，→偶联蛋白（G 蛋白）效应酶活化→级联反应→细胞功能性应答。
分子标记技术的类型原理及应用--ppt
单核苷酸多态性标记(SNP)
应用 种群生物学特征、遗传性疾病检测、疾病关联
分析及特定功能基因或片段的分型等研究，在基 因组作图和数量性状定位等方面也有越来越多的 应用。 优点
数量多，分布广泛，检测快速、 易于实现自动化，遗传稳定性高。 缺点
表达序列标签标记技术(EST)
ESTs( Expressed Sequence Tags)是在人类基 因组计划实施过程中，由美国国立卫生研究院 生物学家Venter J提出的发现基因的新战略。
分子标记技术
姓 名：赵 淑 莉 学 校：吉林大学
主要内容
1
概
述
2
类
型
3
原理及应用
4
致
谢
概述
分子标记技术(Molecular Markers)
1974年,Grozdicker 等人在鉴定温度敏感表型的腺 病毒DNA突变体时， 利用限制性内切酶酶解后得到 的DNA片段的差异，首创了DNA分子标记。
所谓分子标记是根据基因组DNA存在丰 富的多态性而发展起来的可直接反映生物个 体在DNA水平上的差异的一类新型的遗传标 记,它是继形态学标记、细胞学标记、生化标 记之后最为可靠的遗传标记技术。
位
多次串联重复的DNA序列。
微卫星由核心序列和两侧的保守侧翼序列构成
。保守的侧翼序列使微卫星特异地定位于染色体
某一区域，核心序列重复数的差异则形成微卫星
的高度多态性。
简单序列重复(SSR)
原理：
由于重复次数的不同及重复程度的不完全造成 了每个位点的多态性。
根据其两端的保守序列设计一对特异性引物 ， PCR 扩增，再经聚丙烯酰胺凝胶电泳即可显示 不同基因型个体在这个SSR位点的多态性。
分子标记技术原理、方法及应用
分子标记技术原理、方法及应用一、遗传标记的类型及发展遗传标记（genetic marker)：指可追踪染色体、染色体某一节段、某个基因座在家系中传递的任何一种遗传特性.它具有两个基本特征，即可遗传性和可识别性；因此生物的任何有差异表型的基因突变型均可作为遗传标记。
包括形态学标记、细胞学标记、生化标记和分子标记四种类型。
形态学标记:主要包括肉眼可见的外部形态特征，如:矮秆、紫鞘、卷叶等；也包括色素、生理特性、生殖特性、抗病虫性等有关的一些特性。
优点：形态学标记简单直观、经济方便.缺点：(1）数量在多数植物中是很有限的; （2）多态性较差，表现易受环境影响; (3)有一些标记与不良性状连锁；(4)形态标记的获得需要通过诱变、分离纯合的过程，周期较长细胞学标记：植物细胞染色体的变异:包括染色体核型（染色体数目、结构、随体有无、着丝粒位置等）和带型（C带、N带、G带等)的变化。
优点：能进行一些重要基因的染色体或染色体区域定位。
缺点: (1)材料需要花费较大的人力和较长时间来培育，难度很大；(2) 有些变异难以用细胞学方法进行检测生化标记：主要包括同工酶和等位酶标记。
分析方法是从组织蛋白粗提物中通过电泳和组织化学染色法将酶的多种形式转变成肉眼可辩的酶谱带型.优点: 直接反映了基因产物差异，受环境影响较小.缺点：（1)目前可使用的生化标记数量还相当有限；(2)有些酶的染色方法和电泳技术有一定难度分子标记：主要指能反映生物个体或种群间基因组中某种差异特征的DNA片段，它直接反映基因组DNA间的差异,也叫DNA标记。
（1）数量多，高多态性,信息量大(2）与生长发育无关，取材不受限制(3)能明确辨别等位基因(4）均匀分布于整个基因组（5）选择中性，不影响目标性状的表达(6)检测手段简单、快速(7）成本低廉(8)稳定,重复性好（9)共显性遗传在遗传学研究中广泛应用的DNA分子标记已经发展了很多种，一般依其所用的分子生物学技术大致可以分为三大类：第一类是以分子杂交为核心的分子标记,包括RFLP、DNA指纹技术等，这类分子标记被称为第一代分子标记;第二类是以PCR为核心的分子标记，包括随机扩增多态性RAPD、简单序列重复SSR、扩增片段长度多态性AFLP、序列标签位点STS等，为第二代分子标记;第三类是一些新型的分子标记,如：SNP标记、表达序列标签EST 标记等，也以PCR技术为基础，为第三代分子标记。
分子标记的应用
Young等人提出近等基因系法 Near等人提出近等基因系法（ （一）Young等人提出近等基因系法（NearLines，NILs） isogenic Lines，NILs）它是通过杂交及多代回 交或自交分离而获得的（一般6 ），除了目 交或自交分离而获得的（一般6-8代），除了目 标基因外，控制其它性状的位点同轮回亲本（RP） 标基因外，控制其它性状的位点同轮回亲本（RP） 基本一致， 基本一致，该系与原来的轮回亲本就构成了一对 近等基因系。 近等基因系。 Michelmore等人 1991） 等人（ （二）Michelmore等人（1991）提出了混合群体 分组分析法（ Analysis， 分组分析法（Bulked Segregant Analysis， BSA）。利用BSA法不需创造近等基因系，利用F2 ）。利用BSA法不需创造近等基因系 BSA）。利用BSA法不需创造近等基因系，利用F2 BC1的分离群体即可完成标记 简单易行， 的分离群体即可完成标记， 或BC1的分离群体即可完成标记，简单易行，目 前在辅助选择研究中占据了重要位置, 前在辅助选择研究中占据了重要位置,其前景也 非常广阔。NILs与BSA的结合运用 的结合运用， 非常广阔。NILs与BSA的结合运用，加速了与目 的基因紧密连锁标记的建立与鉴定。 的基因紧密连锁标记的建立与鉴定。
应用cDNA AFLP技术进行杂种优势机 应用cDNA－AFLP技术进行杂种优势机 cDNA－ 理的研究表明， 理的研究表明，强优势与弱优势组合 间基因表达有明显差异，有增强型、 间基因表达有明显差异，有增强型、 减弱型和沉默型。 减弱型和沉默型。 杂种优势表现与单亲沉默、双单亲沉 杂种优势表现与单亲沉默、 默有密切关系。 默有密切关系。
展望
随着分子标记技术已飞速发展，该技术已 随着分子标记技术已飞速发展， 被广泛应用于作物遗传研究中。已在玉米、 被广泛应用于作物遗传研究中。已在玉米、 大豆等植物育种和生产中有许多应用研究， 大豆等植物育种和生产中有许多应用研究， 主要集中在基因定位、 主要集中在基因定位、辅助育种等方面的 应用研究工作，取得了一些应用成果。 应用研究工作，取得了一些应用成果。 分子标记技术与提取程序化、 分子标记技术与提取程序化、电泳胶片分 析自动化、信息(数据) 析自动化、信息(数据)处理计算机化的结 必将加速遗传图谱的构建、基因定位、 合，必将加速遗传图谱的构建、基因定位、 基因克隆、 基因克隆、物种亲缘关系鉴别及相关的致 病基因的诊断和分析。 病基因的诊断和分析。 常规育种和现代分子技术的结合必将加快 创新品种的开发和应用！ 创新品种的开发和应用！
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采取富集步骤的SSR标记开发策略
接SSR作 为PCR扩增引物或者将RAPD扩增产物条带用SSR探针进行Southern杂交， 可以有效富集重复序列。 2. 基于ISSR-PCR的SSR分离策略 与基于RAPD的分离策略相比，ISSR-PCR基础上的分离方法避免了SSR 富集的随机性，无论在理论上还是实践操作中，都具有更明了研究费用。
DNA用量少
技术要求低，成本低廉 PCR扩增的可重复性高
disadvantages：
开发和合成新的SSR引物投入高、难度大 现有的SSR标记数量有限，不能标记所有的功能基因 SSR多态性的检测和应用很大程度上依赖PCR扩增的效果 SSR座位突变率高，对变异反应非常敏感等等。
9.4 Procedure
用于遗传作图〔19〕、品种鉴定等研究。
9.5 与其他标记结合的标记
随机扩增微卫星多态性(Random amplified microsatellite
polymorphism,RAMPs)
这是SSR与RAPD技术相结合产生的一种微卫星标记。其原理是利用一 个5′端锚定的SSR引物和一个RAPD随机引物进行PCR扩增〔6〕， RAPD引物的结合位点是以微卫星为基础的扩增产物的终止位点，它所
SAMPL所揭示的多态性几乎是无限的。与其它方法相比，该法的实验步骤可能
最复杂，但其结果可能是最有价值的。
Thank you!
揭示的是出现于微卫星位点本身或两个引物之间的相关序列长度的多
态性，扩增产物也不象ISSR一样仅限于基因组中一个特定的微卫星位 点。
9.5 与其他标记结合的标记
选择性扩增微卫星多态性位点(Selective amplification of microsatellite polymorphism loci,SAMPL)
Microsatellite have many function, such as recombination hotspot, gene regulation, expression and sex determination and so on. Microsatellite (MS) or Simple sequence repeat (SSR) is widely distribute in different position of eucaryote genome, such as (CA)n, (AT)n, (GGC)n, and so on. And also their distribution is uniformity in genome, about average per 10kb DNA sequence will appear a micrisatellite sequence. (CA)n, (TG)n and (AT)n
A、B、C denote different genotype
SSR多态性分析示意图.
9.3 Characteristic
Advantages：
SSR在真核生物基因组中分布广 多态性丰富 其产物进行测序胶电泳分离时单碱基分辨率高、遗传信息量大 SSR通常为显性标记，呈孟德尔式遗传 具有很好的稳定性和多态性
这是SSR与AFLP相结合产生的一种分子标记，结合了二者的优点。该方法利用 微卫星序列设计引物，不需要预先对微卫星位点进行克隆、测序等研究。在 AFLP实验中，一般要进行几个主要的步骤，包括：(1)基因组DNA的双酶切； (2)酶切片段与接头连接；(3)预扩增(第一次扩增)；(4)扩增(第二次扩增)；(5)扩 增产物的检测〔42〕。SAMPL的具体做法就是在AFLP反应的第二次扩增时将 一个具有3个选择性碱基的AFLP引物与一个16～18bp的人工设计的SAMPL引 物组合在一起，这个SAMPL引物通常都是位于复杂重复单位中的、连接在一起 的两个不同序列的微卫星及介于其间的序列构成的。这样，在扩增时SAMPL引 物的5′端重复提供进行严格复性的5′端锚定位点，因而该引物的3′端的第二个微 卫星就可延伸。由于不同的限制性内切酶、SSR引物及选择性接头引物的组合，
DNA extraction and purification
从有关数据库（GenBank, EMBL D使用近缘种的引物
PCR Amplification
Gel electrophoresis
Data analysis
Gain primerFra bibliotek Tandem Repeats Sequence ,TRS （串联重复序列）:
According to motif, copy number, and position of repeat sequence:
Satellite DNA(卫星DNA)：100～300bp（1000～100000bp）
PCR amplification
Detect of PCR product
PAGE
9.5 由微卫星衍生的微卫星标记
微卫星引物PCR(MP-PCR)
也叫单引物扩增RCP(single amplification PCR,简写为SPAR)该方法
是利用单个微卫星的人工合成寡核苷酸片段为引物进行PCR扩增。可 以想象，如果两个反向排列的微卫星出现于同一可扩增的范围内，这 两个反向排列的微卫星间的序列就可扩增出来，因而该方法称为微卫 星引物PCR〔24〕。用此方法扩增出来的是两个反向排列的微卫星之 间的序列，并非微卫星位点本身。实践证明，用该方法对三核苷酸、 四核苷酸、五核苷酸重复的微卫星位点的扩增效果较好，而对二核苷 酸位点重复的扩增效果较差。甚至有人认为，与RAPD技术相比，该法 并没有明显的优越之处。
开发不象SSR引物一样需测序获得SSR两测的单拷贝序列，开发费用
降低。与SSR标记相比，ISSR引物可以在不同的物种间通用，不象 SSR标记一样具有较强的种特异性；与RAPD和RFLP相比，ISSR揭示 的多态性较高，可获得几倍于RAPD的信息量，精确度几乎可与RFLP
相媲美，检测非常方便，因而是一种非常有发展前途的分子标记，已
9.5 由微卫星衍生的微卫星标记
ISSR(Intersimple sequence repeat)
这是Zietkiewitcz等(1994)发展起来的又一种微卫星基础上的分子标记 〔44〕。与SSR标记相反，该法是直接利用同位素标记的SSR序列为 引物，用PCR的方法扩增两个SSR之间的单拷贝序列。为增加特异性， 设计引物时在引物的5′端和3′端分别引入1～2个选择性碱基，引物长度 16～18bp，扩增产物通过放射自显影显现，这样其扩增物就是MPPCR扩增产物中的一部分，提高了实验结果的可重mer
Database search 专门的SSR分析软件：Sputnik， WisconsinGCG程序包中的 FindPatterns程序，搜索GenBank，EMBL和DDBJ等公共数据库 中的DNA序列和EST序列。Expression sequence tag
Minisatellite（小卫星DNA）：10～60bp
Microsatellite（微卫星DNA）：1～6bp
Microsatellite
198简单重复序列在真核生物中广泛存在。Tautz和Renz(1984)发现这种短的重 复是真核基因组独有的，并称之为“简单重复”。后来Litt等(1989)在心肌肌动 蛋白的基因内扩增了一种二核苷酸重复，首创“微卫星(microsatellite)” 这个名 称。Edwards等(1991)所谓的SSR是上述命名的连续。
9.2 Concept and principle of SSR technique
MS（SSR）（short tandem repeats,STR）具有高度多态性，微卫星在结构 上的最大特点是两端序列较保守，SSR引物根据与微卫星重复序两端的特定短序 列设计，用来扩增重复序列本身，从而揭示微卫星的多态性。 High polymorphism of SSR marker derive from number of tandem repeats, SSR marker technology is one kind of effective techniques.
Chapter9 SSR (Simple sequence repeat)
9.1 Introduction
In genome of eucaryote, except encoded sequence and regulation region of gene，have a lot of unknown repeat sequence. Repeat sequence of plant genome is above 50%. ＞80％， 1974年，Skinner 在寄居蟹中发现了卫星DNA的重复序列(TAGC)n。
Type of repeats sequence
According to their distribution on chromosome
Dispersed Repeats Sequence (散布重复序列): 散布的重复序列拷贝数很多，而 且在重复单位之间彼此常有序列的变化，标记中不能显示出清晰的带型（通常为模 糊一片），因此难于利用。在人类基因组中有一个Alu重复序列的家族，重复单位 约300bp左右，他们广泛地散布在人的基因组中，而且有丰富的多态性。目前已可 以用专门设计的PCR方法揭示这种Alu多态性，称为Alu-PCR。不过，迄今在植物 中尚未见利用散布重复序列提供分子标记的报道。