人胱硫醚!合酶及其截短型片段的表达纯化和活性测定-生物通

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丝氨酸的结合区 羧基端调控域通过对酶催化域的自 动抑制作用 & 9) ( $ %#$ [$ ) ( P . 来调控酶的活性 2 " ' ?受 到酶激活因子 ' 4 腺苷甲硫氨酸 ' 4 & >* %( F . , I * ) #$ ( %$ %*
3 T >( W * ) 的调控时活性可提高 / Z 3 倍 C4
] ( , H 21 ^ ( H 1/ /011
胨1R 氯 化 钠 以 上 均 为 质 量 分 数 氨 苄 青 霉 素 & I <$ + $ , , $ % 终浓度均为 30 J I , "$ %#方#法 1H /H 1!重组菌 ! " # $ % & E ( F * ) ) & <@ A B CD 4 14 " ' ? 的构建 !以人 " ' ? 基因全长 + G ^ T为模板 通过 M " E扩增获 4 得 基 因 编 码 区 片 段 上 下 游 引 物 分 别 为 3c " D " @ @ T T D D " " " D D " D @ T @ T " " " " " " T @ @ 4 2c 和 3c 4 " T @ D @ " @ @ " " @ " D D T " D D " D @ @ D " " " @ " 4 2c M " E反 应 条件为UCN变性 3 I $ % UCN O0F 3ON 退火 20F 5/N 循环 23 次5/N 延伸 10 I $ % 1/0F 将扩增的 " ' ? 基因编码区 片 段 连 接 到 克 隆 载 体 <W G 164 D上 得 到 质 粒 <W G 164 D 4 " ' ? 测 序 正 确 后 用 ! # $ E $ , G 164 D 4 " ' ? 和 <@ A B 4 CD 4 和 + 双酶切质粒 <W 1 连接酶切后的片段 构 建 重 组 质 粒 <@ A B 4 CD 4 14 " ' ? 将重组质粒转化到 ! " # $ % & E ( F * ) ) & G A 2 感受态细胞 " # $ % & E ( F * ) ) & <@ A B CD 4 14 " ' ? 中获得重组菌 ! 1H /H /! 重 组 " ' ? 的表达!将培养过夜的 ! " # $ % & E ( F * ) ) & <@ A B CD 4 14 " ' ? 按 1d 100 比例接种到 1K含有 30 J I , 氨苄青霉素的 K '培 养 基 中 25N //0P J I $ % 培养至菌液 . C Z 0H O 然 后 加 入 终 浓 度 为 O00 值 为 0H 0H 2I I ( , J K34 T K T及 0H 1I I ( , J K的 L M D @于 20N 诱导 1O# 再于 CNO 000P J I $ % 离心 10I $ % 获得的菌体悬浮 洗涤后离心收获菌体备用 1= /= 2!重组 " ' ? 的纯化! 1 粗提取将上述收获的 菌体 重 悬 于 C0I , 破 碎 缓 冲 液 30I I ( , J KD P $ F 4 S " , 6I I ( , J KA G D T 4 ^ & I ( , J KG D D 3I - 溶 菌 酶 / 3I 1I I ( , J K M W ?Q 1I I ( , J K 盐 酸 苯 甲 醚 1I J K T <P ( ) $ %$ % 0H 1I I ( , J KM K M 1R D P $ ) ( % B 4 100 <S 6H 0 中在冰水浴中超声波 200e 超声 2F 间隔 6F 处理 1 100F 破 碎 细 胞 破 碎 液 在 CN 1/ 000P J I $ % 离 心 20I $ % 上清液即为粗酶液 / @ ?D P & < Q & F ) Q , ( :亲和层析和柱上酶切 将上 述粗酶 液 加 入 到 经 平 衡 缓 冲 液 30I I ( , J KD P $ F 4 S " , /I I ( , J KG D D <S 6H 0 预平衡的 @ ?D P & < Q & F )Q , ( : 3I , 柱 流速 1I , J I $ % 洗脱至基线 然后使用凝血酶 酶 切 缓 冲 液 30I I ( , J KD P $ F 4 S " , 130I I ( , J K^ & " , /H 3I I ( , J K" & " , I ( , J KG D D 2R @ , . + * P ( , 0H 1R / /I " S T M ? <S6H 0 再平衡至基线 在层析柱中加入 3I , 凝血酶 凝 血 酶 加 入 量 约 为 10VJ I -融 合 蛋 白 在 //N下温浴 1/ Z 1O# 收集酶切后 " ' ? 溶液 超滤脱盐 后8 60N保存备用 1H /H C!" ' ?14 ' ?与 C12 的表达和纯化 ! 为了比较全长 "
中国生物工程杂志!" #$ %&' $ ( ) * + #%( , ( . /011 21 1/ 13 /1
人胱硫醚 合酶及其截短型片段的表达 ! 纯化和活性测定
牛卫宁 !羊梦林!曹珊珊!许!乐!钦传光
西北Hale Waihona Puke 业大学生命学院!西安!51005/
摘要!将人胱硫醚 合酶 " 4 ' ? 基因克隆至质粒 <@ A B 4 CD 4 1 中 获得的重组质粒 <@ A B 4 CD 4 14
此关于 " ' ? 结构功能以及活性调控方面的研究具有
催化
域是辅酶磷酸吡哆醛 M K M 以及底物同型半胱氨酸和
收稿日期/0114 034 /0!!修回日期/0114 054 05 06 国家自然科学基金 /060/035 陕西省科技攻关计划 /0117 8 1/ 资助项目 9: * $ %$ %;%: <9= * >9= + % 电子信箱%$
因
" ' ? 的来源最初主要通过哺乳动物组织提取纯化 ' ? 在组织中含量较低 而且在纯化过程中 获得但是 " 很容易聚集沉淀和遭受蛋白酶的降解 很难得到大量 高纯度的 " ' ? 用于研究 随后 D & ( Y& 等 O 在大肠杆菌 中表 达 了 融 合 有 谷 胱 甘 肽4 '4 转移酶, 9) & ) #$ ( %* 4 '4 ) P & %F \ * P & F * @ ?D 标签的 " ' ? 通过三步纯化蛋白质纯度 达到 U3RQ P & %Y 等 5 对上述表达策略进行了改进 通 过两步纯化得到 " ' ? 但是以上两种策略均由于 " ' ? 很容易聚集沉淀蛋白质纯化得率仅为 2 Z CI J K培养 基 另外' * , * :等 6 在大肠杆菌中表达和纯化了融合
" ' ? 转入大 肠 杆 菌 ! " # $ % & E ( F * ) ) & G A 2 菌 株 构 建 了 高 效 表 达 " ' ? 的重组菌 ! " # $ % & E ( F * ) ) & <@ A B CD 4 14 " ' ? 重 组 菌 在 0H 1I I ( , J K的 L M D @ 于 20N 诱 导 1O# 可 溶 性 " ' ? 表达量达到 /6I J K培养基 将重组菌破碎后上清液经 @ ?D P & <Q & F ) Q , ( :亲和层析一步纯化得到 " ' ? 融合蛋
" ' K 并在此基础上建立了一种新的 " ' K偶联的 " ' ? 酶活性测定方法
关键词!人胱硫醚 4 合酶!大肠杆菌!表达纯化!酶活性测定!胱硫醚 4 裂解酶
中图分类号!X 56U 合酶 + . F ) & ) #$ ( %$ %* F . %) #& F * " ' ? 是 !!人胱硫醚 4 4 目前发现的唯一一个磷酸吡哆醛依赖的血红素结合蛋 白催化 体 内 同 型 半 胱 氨 酸 #( I ( + . F ) * $ %* S + . 的去 ' ? 活性 降 低 或 丧 失 会 引 起 血 液 中 S + .浓 度 升 除 " 高继而导致心血管系统 神经系统疾病的发生 非常重要的意义 " ' ? 是由 C 个相同亚基构成的均一四聚体 每个 亚基由 331 个氨基酸组成 分子质量约为 O2YG & 该酶 由三部分 组 成 氨 基 端 的 血 红 素 #* I * 结合域1 Z 50& & 催化域 51 Z C12& & 及羧基端的调控域 C1C Z 331& & 氨基端血红素的功能至今仍存在争论
有组氨酸 S $ F 标签的 " ' ? 同样由于纯化过程中 " ' ? 的聚集导致得率仅有 0H 3Z /H /I J K培养基 因此 提 高重组蛋白表达量 抑制 " ' ? 聚集沉淀以及提高纯化