菌种保藏

在我国为了推动菌种保臧事业的发展，1970年7 月在国家科委和中国科学院主持下，召开了第一次全 国菌种保藏工作会议，在会上成立了中国微生物菌种 管理委员会（CCCMS）委托中国科学院负责担负全 国菌种保藏管理业务，下设六个菌种保藏管理中心。
l）普通微生物菌种保藏管理中心（CCGMC）；
中国科学院微生物研究所，北京（AS）：真菌，细 菌。
2.3.1.2 菌种的复壮： 使衰退的菌种恢复原来优良性状。狭义 的复壮是指在菌种已发生衰退的情况下， 通过纯种分离和生产性能测定等方法，从 衰退的群体中找出未衰退的个体，以达到 恢复该菌原有典型性状的措施；广义的复 壮是指在菌种的生产性能未衰退前就有意 识的经常、进行纯种的分离和生产性能测 定工作，以期菌种的生产性能逐步提高。 实际上是利用自发突变（正变）不断地从 生产中选种。
（3） IAM （Institute of Applied Microbiology）， University of Tokyo，Japan。
日本东京大学应用微生物研究所，日本东京。
（4） IFO （Institute for Fermentation）， Osaka， Japan。
发酵研究所，日本大阪。 （5） KCC （Kaken Chemical Company Ltd）， Tokyo，Japan。
科研化学有限公司，日本东京。
（ 6 ） NCTC（ National Collection of Type Cu⒒ ure）， London United Kingdom，
国立标准菌种收藏所，英国伦敦。
（ 7 ） NIH （ National Institutes of Health ） ， Bethesda， Maryland， U.S.A
保护剂一般采用脱脂牛奶或血清。保护剂的作用 可能是在冷冻干燥的脱水过程中代替结合水而稳定细 胞成分（细胞膜）的构型，防此细胞膜因为冻结而破 坏。保护剂还可以起支持作用，使微生物疏松地固定 在上面。牛奶可以离心或加热的方法脱脂。
E 液氮超低温保藏法
液氮超低温保臧法是近几年才发展起来的，此法国 外已较普遍采用，是适用范围最广的微生物保藏法。 尤其是一些不产孢子的菌丝体，用其它保藏方法不理 想，可用液氮保臧法。其保存期最长。 a 原理 用液氮能长期保存菌种。这是因为液氮的温度可 达一196℃，远远低于其新陈代谢作用停止的温度 （一130℃），所以此时菌种的代谢活动已停止，化 学作用亦随之消失。
（3）冻结 液氮法的关键是先把微生物从常温过渡到 低温。这样在细胞接触低温前，使细胞内自由水通过 膜渗出而不使其遇冷形成冰晶而伤害细胞。
美国 ATCC采用先将菌液降温到0℃，再以每分钟 降低1℃的速度，一直降低到－38℃，然后才把装有 菌液的安瓿管放入液氮罐的气相中。由于液氮要蒸发， 这样温度就会上升，冰晶状态发生变化，从而导致菌 种死亡。所以要常常注意液氮的残存量，定期补加。 （4）重新培养 当要使用或检查所保存的菌种时，可 将安瓿管从冰箱中取出，室温或35－40℃水浴中迅速 解冻，当升温至0℃时即可打开安瓿管，将菌种移到 适宜的培养基斜面上培养。
有效
冷冻干燥法
干燥、无氧、低
各大类
5-15年
简便
温、有保护剂
以上
有效
2.3.3国内外主要菌种保藏机构介绍
菌种是一个国家的重要资源，世界各国都对菌种极为 重视，设置了各种专业性保藏机构，主要的菌种保藏 机构介绍如下： （ 1 ） ATCC American Type Culture Collection. Rockvil1．Maryland.U.S.A。 美国标准菌种收藏所，美国，马里兰洲，罗克维尔市。 （2） CSH〔 （Cold Spring Harbor Laboratory）， U.S.A 冷泉港研究室，美国。
b 操作方法及步骤
（1）安瓿管要求 由于液氮保存于超低温状态，所使 用的安瓿管需能承受大的温差而不致于破裂，一般用 95料或GCl7的玻璃管，安瓿管选好后印上标记，加棉 塞后灭菌，烘干后备用。 （2）菌种准备及分装 因为液氮法菌种要经受超低温 的冷冻过程。所以也需要保护剂，常用的保护剂为10 ％甘油。用保护剂制备好菌液后，加入准备好的安瓶 管中，一般安瓿管的装量为0.2－1mL。
C石蜡油封存法 向培养成熟的菌种斜面上，倒入一层灭过菌的石 蜡油，用量要高出斜面一厘米，然后保存在冰箱中。 此法可通用于不能利用石蜡油作碳源的细菌、霉菌、 酵母等微生物的保存。保存期约一年左右。
D真空冷冻干燥保减法
真空冷冻干燥保臧法是目前常用的较理想的一种 方法。其基本原理是在较低的温度下（－15℃），快 速地将细胞冻结，并且保持细胞完整，然后在真空中 使水分升华。在这样的环境中，微生物的生长和代谢 都暂时停止，不易发生变异。
菌种保藏的方法很多，一般有下面几种：
A 斜面冰箱保藏法 斜面保藏是一种短期、过渡的保藏方法，用新鲜 斜面接种后，置最适条件下培养到菌体或孢子生长丰 满后，放在4℃冰箱保存。一般保存期为三个月到六 个月。 B 沙土管保藏法 这是国内常采用的一种方法。适合于产孢子或芽 孢的微生物。它的制备方法是：
首先，将沙与土洗净烘干过筛后，按沙与土的比例 为l－2∶l混合均匀，分装于小试管中，装料高度约为 1厘米左右，121°C间歇灭菌三次，灭菌试验合格后 烘干备用。一般沙用80目过筛，土用30－100目过筛。 其次，将斜面孢子制成孢子悬浮液接入沙土管中或将 斜面孢子刮下直接与沙土混合，于干燥器中用真空泵 抽干，放在冰箱内保存。一般保存期为1年左右。
中国科学院武汉病毒研究所，武汉（AL－IV）：病 毒。 2）农业微生物菌种保藏管理中心（ACCC）；
中国农业科学院土壤肥料研究所，
3）工业微生物菌种保藏管理中心（CICC）；
轻工业部食品发酵工业科学研究所，北京。 4）医学微生物菌种保藏管理中心（CMCC）； 中国医学科学院皮肤病研究所，南京（ID）∶真菌。 卫生部药品生物制品检定所，北京：细菌。 中国医学科学院病毒研究所，北京：病毒。 5）抗生素菌种保藏管理中心（CACC）；
国立卫生研究所，美国，马里兰洲，贝塞斯达。 （ 8 ） NRRL （ Northern Utilization Research and Developmcnt Division ， U.S. Dpartment of Agriculture，Peoria， U.S.A。 美国农业部、北方开发利用研究部，美国皮奥里亚 市。
中国医学科学院抗生素研究所，北京和四川抗生素工 业研究所，成都：新抗生素菌种。 华北药厂抗生素研究所，石家庄：生产用抗生素菌种
6）兽医微生物菌种保藏管理中心（CVCC）；
农业部兽医药品监察所，北京。
我国国内目前已有部分单位采用液氮法保存菌种。
几种常用菌种保藏方法的比较
方法名称
冰箱保藏法（斜面）
冰箱保藏法（半固体） 石蜡油封藏法*
主要措施
低温
低温 低温、缺氧
适宜菌种
各大类
细菌、酵母菌 各大类**
保藏期
3-6月
6-12月 1-2年
评 价
简便
简便 简便
沙土保藏法
干燥、无营养
产孢子微生物
1-10年
简便
2.3 菌种保藏 2.3.1菌种的衰退与复壮 2.3.1.1.衰退：
菌种在培养或保藏过程中，由于自发突变的 存在，出现某些原有优良生产性状的劣化、 遗传标记的丢失等现象，称为菌种的衰退。 衰退的原因：①基因突变， ②分离现象。
常见的衰退现象：
菌落和细胞形态的改变； 生长速度缓慢，产孢子越来越少； 抵抗力、抗不良环境能力减弱等。 代谢产物生产方法
菌种保藏主要是根据菌种的生理生化特点，人工 创造条件，使孢子或菌体的生长代谢活动尽量降低， 以减少其变异。一般可通过保持培养基营养成分在 最 低 水 平 ， 缺 氧 状 态 ， 干 燥 和 低 温 ， 使 菌 种 处于 “休眠”状态，抑制其繁殖能力。
一种好的保藏方法，首先应能长期保持菌种原有 的优良性状不变。
2.3.2菌种保藏
2.3.2.1 菌种保藏的重要意义 菌种保臧是进行微生物学研究和微生物育种工作的 重要组成部分。其任务首先是使菌种不致死亡，同时 还要尽可能设法把菌种的优良特性保持下来而不致向 坏的方面转化。 当然保藏菌种使其不变异亦是相对而言的。实际上 没有一种方法可使菌种绝对不变化，所以研究菌种保 藏就是要采用最合适的保存方法，使菌种的变异和死 亡减少到最低限度。
因此，菌种可以保存很长时间，一般5年左右。这 种保藏方法虽然需要一定的设备，要求亦比较严格， 但由于该方法保藏效果好，对各种微生物都适用。所 以，国内外都已较普遍地应用。
这种方法的基本操作过程是先将微生物制成悬浮 液，再与保护剂混合，然后放在特制的安瓶管内，用 低温酒精或干冰，使其迅速冻结，在低温下用真空泵 抽干，最后将安瓿管真空熔封，并低温保藏。
菌种的复壮措施：
纯种分离：（平板划线法、涂布法、倾注法、单细 胞挑取法等）； 通过寄主体内生长进行复壮 ； 淘汰已衰退的个体（采用比较激烈的理化条件进行 处理，以杀死生命力较差的已衰退个体）；
2.3.1.3防止菌种衰退的方法： 控制传代次数（一般在DNA的复制过程中，碱基的 错配率是5x10-4，自发突变的频率为10-8—10-9，采用 良好的菌种保藏方法，可以减少移种和传代数）； 选择合适的培养条件； 采用不同类型的细胞进行传代（对丝状微生物而 言，通常采用稳定的单核孢子进行接种）； 采用有效的菌种保藏方法。