凯氏定氮法测定食品中蛋白质
食品中蛋白质凯氏定氮法测定比较
蛋白质测定涉及企业生产和监督 检测众多领域。本次测验用凯氏定氮 法检测，在操作过程中总结出两仪器 方 法 的 适 用 条 件 及 操 作 事 项， 以 便 在 检 测 工 作 中 更 好 的 掌 握 蛋 白 质 的 检测。 1 检测试剂
所 需 试 剂 均 为 分 析 纯， 检 测 用 水 为 实 验 室 合 格 水。 混 合 催 化 剂（ 硫 酸 铜和硫酸钾），硼酸溶液（20 g/L）， 溴 甲 酚 绿 指 示 剂（10 g/L）， 甲 基 红 指 示（10g/L）， 亚 甲 基 蓝 指 示 剂 （10 g/L）， 氢 氧 化 钠（400 g/L）， 硫酸，甲基红溴甲酚绿混合指示液。 （0.050 mol/L）硫酸标准滴定溶液。 2 检测用设备
事项
7.2 凯氏定氮法操作时的注意事项
混匀的固体 0.5 g 左右、半固体 2 g
操作时注意仪器整体装置的密闭
左右、液体摇晃均匀 10 g 左右。这样 性，水蒸气烧瓶要做空蒸试验，保证
的结果比较稳定。开始时控制火力，
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147 Apr. 2021 CHINA FOOD SAFETY
测试。连续做空白测试，结果一致后， 6 结果比较
仪器稳定即可连续测试，空白结果最
以 奶 粉 为 例， 两 种 方 法 的 检 测 结
大值减去最小值小于 0.05 mL 时，仪 果见表 1。 表 1 两种方法的检测结果表
编号和方法
称取样品 质量 /g
蛋白质含量检测 结果 （/ g/100g）
质控样 浓度值
连接好 加甲基红指示剂 3 滴和硫酸 1 mL，使 蒸馏水显酸性，加热蒸馏瓶内的水保 持沸腾。
打 开 装 置 冷 凝 水， 接 收 瓶 加 入 10.0 mL 硼酸溶液及 3 滴混合滴定指 示液。接收瓶放在冷凝管的下端插入
凯氏定氮法测蛋白质含量
凯⽒定氮法测蛋⽩质含量凯⽒定氮法测蛋⽩质含量原理蛋⽩质是含氮的有机化合物。
⾷品与硫酸和催化剂⼀同加热消化，使蛋⽩质分解，分解的氨与硫酸结合⽣成硫酸铵。
然后碱化蒸馏使氨游离，⽤硼酸吸收后再以硫酸或盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，即为蛋⽩质含量。
1. 有机物中的胺根在强热和CuSO4，浓H2SO4作⽤下，硝化⽣成（NH4）SO42反应式为：2NH2+H2S04+2H＝(NH4)2S04（其中CuSO4做催化剂）2. 在凯⽒定氮器中与碱作⽤，通过蒸馏释放出NH3，收集于H3BO3溶液中反应式为:(NH4)2SO4+2NaOH＝2NH3+2H2O+Na2SO42NH3+4H3BO3＝(NH4)2B4O7+5H2O3. ⽤已知浓度的H2SO4（或HCI）标准溶液滴定，根据HCI消耗的量计算出氮的含量，然后乘以相应的换算因⼦，既得蛋⽩质的含量反应式为：(NH4)2B4O7+H2SO4+5H2O＝(NH4)2SO4+4H3BO3(NH4)2B4O7+2HCl+5H2O＝2NH4Cl+4H3BO3试剂所有试剂均⽤不含氨的蒸馏⽔配制。
硫酸铜。
硫酸钾。
硫酸。
2%硼酸溶液。
混合指⽰液：1份0.1%甲基红⼄醇溶液与5份0.1%溴甲酚绿⼄醇溶液临⽤时混合。
也可⽤2份0.1%甲基红⼄醇溶液与1份0.1%次甲基蓝⼄醇溶液临⽤时混合。
40%氢氧化钠溶液。
0.025mol/L硫酸标准溶液或0.05mol/L盐酸标准溶液。
仪器定氮蒸馏装置：如图所⽰。
凯⽒定氮法仪器1.安全管2.导管3.汽⽔分离管4.样品⼊⼝5.塞⼦6.冷凝管7.吸收瓶8.隔热液套9.反应管10.蒸汽发⽣瓶操作⽅法1、样品处理：精密称取0.2-2.0g固体样品或2-5g半固体样品或吸取10-20ml液体样品（约相当氮30-40mg），移⼊⼲燥的100ml或500ml定氮瓶中，加⼊0.2g硫酸铜，6g硫酸钾及20毫升硫酸，稍摇匀后于瓶⼝放⼀⼩漏⽃，将瓶以45度⾓斜⽀于有⼩孔的⽯棉⽹上，⼩⽕加热，待内容物全部炭化，泡沫完全停⽌后，加强⽕⼒，并保持瓶内液体微沸，⾄液体呈蓝绿⾊澄清透明后，再继续加热0.5⼩时。
蛋白质测定凯氏定氮法
同时做试剂 空白试验
冷却 加20mL水 冷却
至蓝绿色澄清透明 继续加热0.5～1h
2、蒸馏、吸收
仪器及试剂的准备 仪器：
100mL 3只
试剂（混合指示剂）： 2份甲基红乙醇液（1g/L）与1份亚甲基蓝乙醇液（1g/L）
临用时混合。指示剂在碱性溶液中呈绿色,在中性溶液中呈 灰色,在酸性溶液中呈红色。
蒸馏及吸收
10.0mL硼酸溶液→100mL三角瓶→加1～2滴混合指示剂 冷凝管下端插入三角瓶液面下→准确吸取10mL试样→由 小玻杯流入反应室→少量水洗涤小漏斗→盖紧玻璃塞→ 量筒取10.0mLNaOH溶液→倒入小玻杯→提起玻塞使其缓 慢流入反应室→立即塞紧玻璃塞→加水于小玻杯防漏气 通蒸汽→颜色变化时开始计时蒸馏5min →移动接受瓶使 液面离开冷凝管下端→再蒸馏1min →用少量水冲洗冷凝 管下端外部→取下接收瓶
注意：此法测定得到的蛋白质含量，实际上包括核酸、生 物碱、含氮类脂、叶啉和含氮色素等非蛋白质氮化合物， 故称为粗pro。
【三、实验步骤】
1、消化
仪器及试剂的准备
仪器：
试剂
作用
硫酸铜 硫酸钾
a催化作用：加速有机物的氧化分解。 b消化完全的指示剂：蓝绿色，澄清，透明； c蒸馏时碱性反应的指示剂：变深蓝色或产生黑色沉淀
④ 在蒸馏时，蒸汽发生要均匀充足，蒸馏过程中不得 停火断汽,否则会发生倒吸。
⑤ 蒸馏完毕后，先将冷凝管下端离开液面，再蒸1分钟， 将附着在尖端的吸收液完全洗入吸收瓶内，再将吸收 瓶移开，最后关闭电源，绝不能先关闭电源，否则吸 收液将发生倒吸。
⑥所用的试剂溶液 必须用无氨蒸馏水配制。
3、盐酸滴定
接收瓶 以HCL标准滴定液滴定
【一、实验目的】
微量凯氏定氮法测定食品中蛋白质含量
微量凯氏定氮法测定食品中蛋白质含量一、实验目的：1、了解微量凯氏定氮法测定蛋白质的卫生学意义。
2、熟悉蛋白质西数在蛋白质含量计算中的应用与凯氏定氮法测定蛋白质的操作过程。
3、掌握微量凯氏定氮法测定蛋白质的原理和方法。
二、实验原理：有机物中的氮在强热和浓硫酸作用下，消化生成硫酸铵，在凯氏定氮器中与碱作用，通过蒸馏释放出氨气，释放的氨气采用硼酸液进行收集，再用已知浓度的盐酸标准溶液滴定，根据盐酸消耗量计算出氮含量，然后乘以相应的系数，计算得到蛋白质含量。
三、实验原始数据记录：HCL标准液的摩尔浓度：M=0.01mol/L空白滴定消耗HCL体积：V1=0.2ml样品滴定消耗HCL体积：V2=1.3ml样品消化液体积：V3=5ml样品质量W=0.212g四、结果计算：样品中蛋白质含量（g/100g）=[(V2-V1)*M*0.014*6.25]*100/(V3*W/100)=9.08五、结果分析及讨论：（1）凯氏定氮法测定食品中蛋白质含量时，样品应是均匀的。
所以固体样品应预先研细混匀，液体样品应振摇或搅拌均匀。
（2）样品放入定氮瓶内时，不要沾附颈上。
若沾附可用少量水冲下，以免样品消化不完全，使结果偏低。
（3）蒸馏前，样品和反应液从加样口加入，每加一次，用蒸馏水冲洗一次，再关闭加样口，并加少量蒸馏水封液，以防止漏气，导致结果偏低。
（4）氨气收集管口应没入指示剂中，防止氨气溢出，导致结果偏低。
（5）利用负压可将反应室内的溶液吸出，在加适量蒸馏水冲洗，反复几次，可清洗反应室。
（6）滴定终点以绿色消失为准，终点稍过即为紫红色。
（7）这种测算方法本质是测出氮的含量，再作蛋白质含量的估算。
只有在被测物的组成是蛋白质时才能用此方法来估算蛋白质含量。
思考题（1）消化时为什么只能用浓硫酸，而不用浓硝酸或高氯酸？答：凯氏定氮的基本原理是使有机物中的氮转化为铵盐，然后加碱蒸出氨气，然后酸碱滴定。
其中消化作用就是使有机氮变为铵盐，如果用硝酸或者高氯酸，在加热、酸性情况下硝酸会氧化铵根，生成氮气、一氧化氮等物质，从而使定氮结果偏低或无法定出。
食品中蛋白质的测定方法
凯氏定氮法测定蛋白质
检测流程
称取样品（半固体2~3g；固体0.2~2g；液体10~25g）于定氮瓶中 硫酸铜0.2g、硫酸钾6g做催化剂 20 mL浓硫酸(轻摇后于瓶口放一小漏斗) 消化至澄清继续0.5-1h 冷却，纯水转移至100mL容量瓶中 准确移取 5ml 10mL消化液用于蒸馏，加入10ml水 缓慢加入10ml40%的氢氧化钠溶液 蒸馏10min(液面离开冷凝管下端，再蒸馏1 min) 10mL2%的硼酸溶液吸收 加5滴甲基红-溴甲酚绿混合指示剂 滴定
凯氏定氮法测定蛋白质
装置
1 －电炉 2－水蒸气发生器（2 L 烧瓶） 3 －螺旋夹 4 －小玻杯及棒状玻塞 5 －反应室 6 －反应室外层 7 －橡皮管及螺旋夹 8 －冷凝管 9 －蒸馏液接收瓶。
凯氏定氮法测定蛋白质
计算方法：
X—试样中蛋白质的含量，单位为克每百克（g/100 g）； V 1 —试液消耗硫酸或盐酸标准滴定液的体积，单位为毫升（mL）； V 2 —试剂空白消耗硫酸或盐酸标准滴定液的体积，单位为毫升 V3 —吸取消化液的体积，单位为毫升（mL）； c —硫酸或盐酸标准滴定溶液浓度，单位为摩尔每升（mol/L）； m——试样的质量，单位为克（g ）； F——氮换算为蛋白质的系数。
食品中蛋白质的测定方法
食品中蛋白质的测定方法
• 第一法：凯氏定氮法 • 第二法：分光光度法 • 第三法：燃烧法
凯氏定氮法测定蛋白质
ห้องสมุดไป่ตู้原理
食品中的蛋白质在催化加热条件下被分解， 产生的氨与硫酸结合生成硫酸铵。碱化蒸馏使氨游 离，用硼酸吸收后以硫酸或盐酸标准滴定溶液滴定， 根据酸的消耗量乘以换算系数，即为蛋白质的含量。
谢谢观赏
袁博
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凯氏定氮法测定蛋白质含量
凯氏定氮法测定蛋白质含量简介凯氏定氮法（Kjeldahl method）是一种常用的测定蛋白质含量的方法，它通过将样品中的有机氮转化为氨，然后将氨转化为氨基氮，再由氨基氮计算得出蛋白质的含量。
这个方法的优点是稳定可靠，适用于各种类型的样品。
实验原理凯氏定氮法的实验原理如下：1.样品预处理：将待测样品进行预处理，去除样品中的非氮有机物。
这样可以确保凯氏定氮方法只测定到蛋白质中的氮。
2.消化反应：将预处理后的样品与硫酸相结合，加热至沸腾。
在这个过程中，有机氮将被转化为氨。
3.碱化反应：将消化后的样品中的硫酸中和，加入过量的氢氧化钠溶液，使样品呈碱性。
4.蒸馏捕收：将碱化后的样品进行蒸馏，捕集捕集样品中的氨。
5.滴定：将捕集到的氨溶液与酸反应，使用盐酸或硫酸等强酸进行滴定，直至中和反应结束，测定出反应过程中消耗的酸的体积。
6.计算：根据滴定所消耗的酸的体积，计算出样品中的氨的量，再根据氨和蛋白质含氮的摩尔比例，计算出样品中蛋白质的含量。
实验步骤以下是凯氏定氮法测定蛋白质含量的实验步骤：1.准备样品：根据实验需要，准备待测样品。
样品的选择应根据实验目的和样品的特性进行。
2.样品预处理：将样品经过细碎、研磨等处理，去除样品中的非氮有机物。
3.消化反应：将预处理后的样品与浓硫酸相结合，加热至沸腾。
消化时间一般为2小时。
4.碱化反应：将消化后的样品中的硫酸中和，加入过量的氢氧化钠溶液，使样品呈碱性。
5.蒸馏捕收：将碱化后的样品进行蒸馏，捕集捕集样品中的氨。
6.滴定：将捕集到的氨溶液与酸反应，使用盐酸或硫酸等强酸进行滴定，直至中和反应结束。
7.计算：根据滴定所消耗的酸的体积，计算出样品中的氨的量，再根据氨和蛋白质含氮的摩尔比例，计算出样品中蛋白质的含量。
实验注意事项1.在进行样品消化时，必须控制好加热温度，避免样品的溢出和烧焦。
2.在进行滴定时，应注意控制滴液的速度，避免过量的酸滴入。
3.实验过程中需注意个人安全，避免触及强酸和强碱。
食品中蛋白质的测定方法
食品中蛋白质的测定方法GB/T14771-931 本标准规定了用凯氏定氮法测定食品中蛋白质的方法。
本标准适用于肉禽制品、豆制品、水产品、调味品、谷物制品、发酵制品、糕点、植物蛋白饮料等食品中蛋白质的测定。
2 引用标准GB 601 化学试剂滴定分析（容量分析）用标准溶液的制备3 原理以硫酸铜为催化剂，用浓硫酸消化试样，使有机氮分解为氨，与硫酸生成硫酸铵。
然后加碱蒸馏使氨逸出，用硼酸溶液吸收，再用盐酸标准滴定溶液滴定。
根据盐酸标准滴定溶液的消耗量计算蛋白质的含量。
4 试剂和溶液：所有试剂均为分析纯；水为蒸馏水或同等纯度的水。
4．1 硫酸铜（GB 665）。
4．2 硫酸钾（HG 3—920）。
4．3 硫酸（GB 625）。
4．4 40%氢氧化钠溶液：称取40g氢氧化钠（GB 629）溶于60mL蒸馏水中。
4．5 4%硼酸溶液：称取4g硼酸（GB 628）溶于蒸馏水中稀释至100mL。
4．6 0.1mol/L盐酸标准滴定溶液：按GB 601规定的方法配制与标定。
4．7 95%乙醇（GB 679）。
4．8 甲基红-次甲基蓝混合指示液：将次甲基蓝乙醇溶液（1g/L）与甲基红乙醇溶液（1g/L）按1+2体积比混合。
5 仪器、设备实验室常规仪器及下列各项：5．1 凯氏烧瓶：500mL。
5．2 可调式电炉。
5．3 蒸汽蒸馏装置：见图1和图2。
6 试样的制备6．1 固体样品：取有代表性的样品至少200g，用研钵捣碎、研细；不易捣碎、研细的样品应切（剪）成细粒；干固体样品用粉碎机粉碎。
6．2 液体样品：取充分混匀的液体样品至少200g。
6．3 粉状样品：取有代表性的样品至少200g（如粉粒较大也应用研钵研细），混合均匀。
6．4 糊状样品：取有代表性的样品至少200g，混合均匀。
6．5 固液体样品：按固、液体比例，取有代表性的样品至少200g，用组织捣碎机捣碎，混合均匀。
6．6 肉制品：取去除不可食部分、具有代表性的样品至少200g，用铰肉机至少铰两次，混合均匀。
食品中蛋白质的测定
食品安全国家标准食品中蛋白质的测定1范围本标准规定了食品中蛋白质的测定方法㊂本标准第一法和第二法适用于各种食品中蛋白质的测定,第三法适用于蛋白质含量在10g/100g 以上的粮食㊁豆类奶粉㊁米粉㊁蛋白质粉等固体试样的测定㊂本标准不适用于添加无机含氮物质㊁有机非蛋白质含氮物质的食品的测定㊂第一法凯氏定氮法2原理食品中的蛋白质在催化加热条件下被分解,产生的氨与硫酸结合生成硫酸铵㊂碱化蒸馏使氨游离,用硼酸吸收后以硫酸或盐酸标准滴定溶液滴定,根据酸的消耗量计算氮含量,再乘以换算系数,即为蛋白质的含量㊂3试剂和材料3.1试剂除非另有说明,本方法所用试剂均为分析纯,水为G B/T6682规定的三级水㊂3.1.1硫酸铜(C u S O4㊃5H2O)㊂3.1.2硫酸钾(K2S O4)㊂3.1.3硫酸(H2S O4)㊂3.1.4硼酸(H3B O3)㊂3.1.5甲基红指示剂(C15H15N3O2)㊂3.1.6溴甲酚绿指示剂(C21H14B r4O5S)㊂3.1.7亚甲基蓝指示剂(C16H18C l N3S㊃3H2O)㊂3.1.8氢氧化钠(N a O H)㊂3.1.995%乙醇(C2H5OH)㊂3.2试剂配制3.2.1硼酸溶液(20g/L):称取20g硼酸,加水溶解后并稀释至1000m L㊂3.2.2氢氧化钠溶液(400g/L):称取40g氢氧化钠加水溶解后,放冷,并稀释至100m L㊂3.2.3硫酸标准滴定溶液[c(12H2S O4)]0.0500m o l/L或盐酸标准滴定溶液[c(H C l)]0.0500m o l/L㊂3.2.4甲基红乙醇溶液(1g/L):称取0.1g甲基红,溶于95%乙醇,用95%乙醇稀释至100m L㊂3.2.5亚甲基蓝乙醇溶液(1g/L):称取0.1g亚甲基蓝,溶于95%乙醇,用95%乙醇稀释至100m L㊂3.2.6溴甲酚绿乙醇溶液(1g/L):称取0.1g溴甲酚绿,溶于95%乙醇,用95%乙醇稀释至100m L㊂3.2.7 A混合指示液:2份甲基红乙醇溶液与1份亚甲基蓝乙醇溶液临用时混合㊂3.2.8 B混合指示液:1份甲基红乙醇溶液与5份溴甲酚绿乙醇溶液临用时混合㊂4仪器和设备4.1天平:感量为1m g㊂4.2定氮蒸馏装置:如图1所示㊂4.3自动凯氏定氮仪㊂说明:1 电炉;2 水蒸气发生器(2L烧瓶);3 螺旋夹;4 小玻杯及棒状玻塞;5 反应室;6 反应室外层;7 橡皮管及螺旋夹;8 冷凝管;9 蒸馏液接收瓶㊂图1定氮蒸馏装置图5分析步骤5.1凯氏定氮法5.1.1试样处理:称取充分混匀的固体试样0.2g~2g㊁半固体试样2g~5g或液体试样10g~25g (约当于30m g~40m g氮),精确至0.001g,移入干燥的100m L㊁250m L或500m L定氮瓶中,加入0.4g硫酸铜㊁6g硫酸钾及20m L硫酸,轻摇后于瓶口放一小漏斗,将瓶以45ħ角斜支于有小孔的石棉网上㊂小心加热,待内容物全部碳化,泡沫完全停止后,加强火力,并保持瓶内液体微沸,至液体呈蓝绿色并澄清透明后,再继续加热0.5h~1h㊂取下放冷,小心加入20m L水,放冷后,移入100m L容量瓶中,并用少量水洗定氮瓶,洗液并入容量瓶中,再加水至刻度,混匀备用㊂同时做试剂空白试验㊂5.1.2测定:按图1装好定氮蒸馏装置,向水蒸气发生器内装水至2/3处,加入数粒玻璃珠,加甲基红乙醇溶液数滴及数毫升硫酸,以保持水呈酸性,加热煮沸水蒸气发生器内的水并保持沸腾㊂5.1.3向接受瓶内加入10.0m L硼酸溶液及1滴~2滴A混合指示剂或B混合指示剂,并使冷凝管的下端插入液面下,根据试样中氮含量,准确吸取2.0m L ~10.0m L 试样处理液由小玻杯注入反应室,以10m L 水洗涤小玻杯并使之流入反应室内,随后塞紧棒状玻塞㊂将10.0m L 氢氧化钠溶液倒入小玻杯,提起玻塞使其缓缓流入反应室,立即将玻塞盖紧,并水封㊂夹紧螺旋夹,开始蒸馏㊂蒸馏10m i n 后移动蒸馏液接收瓶,液面离开冷凝管下端,再蒸馏1m i n ㊂然后用少量水冲洗冷凝管下端外部,取下蒸馏液接收瓶㊂尽快以硫酸或盐酸标准滴定溶液滴定至终点,如用A 混合指示液,终点颜色为灰蓝色;如用B 混合指示液,终点颜色为浅灰红色㊂同时做试剂空白㊂5.2 自动凯氏定氮仪法称取充分混匀的固体试样0.2g ~2g ㊁半固体试样2g ~5g 或液体试样10g ~25g (约当于30m g ~40m g 氮),精确至0.001g ,至消化管中,再加入0.4g 硫酸铜㊁6g 硫酸钾及20m L 硫酸于消化炉进行消化㊂当消化炉温度达到420ħ之后,继续消化1h ,此时消化管中的液体呈绿色透明状,取出冷却后加入50m L 水,于自动凯氏定氮仪(使用前加入氢氧化钠溶液,盐酸或硫酸标准溶液以及含有混合指示剂A 或B 的硼酸溶液)上实现自动加液㊁蒸馏㊁滴定和记录滴定数据的过程㊂6 分析结果的表述试样中蛋白质的含量按式(1)计算:X =(V 1-V 2)ˑc ˑ0.0140m ˑV 3/100ˑF ˑ100 (1) 式中:X 试样中蛋白质的含量,单位为克每百克(g /100g );V 1 试液消耗硫酸或盐酸标准滴定液的体积,单位为毫升(m L );V 2 试剂空白消耗硫酸或盐酸标准滴定液的体积,单位为毫升(m L );c硫酸或盐酸标准滴定溶液浓度,单位为摩尔每升(m o l /L );0.0140 1.0m L 硫酸[c (12H 2S O 4)=1.000m o l /L ]或盐酸[c (H C l )=1.000m o l /L ]标准滴定溶液相当的氮的质量,单位为克(g);m试样的质量,单位为克(g);V 3 吸取消化液的体积,单位为毫升(m L );F氮换算为蛋白质的系数,各种食品中氮转换系数见附录A ;100换算系数㊂蛋白质含量ȡ1g /100g 时,结果保留三位有效数字;蛋白质含量<1g /100g 时,结果保留两位有效数字㊂注:当只检测氮含量时,不需要乘蛋白质换算系数F ㊂7 精密度在重复条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%㊂第二法 分光光度法8 原理食品中的蛋白质在催化加热条件下被分解,分解产生的氨与硫酸结合生成硫酸铵,在p H4.8的乙酸钠-乙酸缓冲溶液中与乙酰丙酮和甲醛反应生成黄色的3,5-二乙酰-2,6-二甲基-1,4-二氢化吡啶化合物㊂在波长400n m下测定吸光度值,与标准系列比较定量,结果乘以换算系数,即为蛋白质含量㊂9试剂和材料9.1试剂除非另有说明,本方法所用试剂均为分析纯,水为G B/T6682规定的三级水㊂9.1.1硫酸铜(C u S O4㊃5H2O)㊂9.1.2硫酸钾(K2S O4)㊂9.1.3硫酸(H2S O4):优级纯㊂9.1.4氢氧化钠(N a O H)㊂9.1.5对硝基苯酚(C6H5N O3)㊂9.1.6乙酸钠(C H3C O O N a㊃3H2O)㊂9.1.7无水乙酸钠(C H3C O O N a)㊂9.1.8乙酸(C H3C O O H):优级纯㊂9.1.937%甲醛(H C HO)㊂9.1.10乙酰丙酮(C5H8O2)㊂9.2试剂配制9.2.1氢氧化钠溶液(300g/L):称取30g氢氧化钠加水溶解后,放冷,并稀释至100m L㊂9.2.2对硝基苯酚指示剂溶液(1g/L):称取0.1g对硝基苯酚指示剂溶于20m L95%乙醇中,加水稀释至100m L㊂9.2.3乙酸溶液(1m o l/L):量取5.8m L乙酸,加水稀释至100m L㊂9.2.4乙酸钠溶液(1m o l/L):称取41g无水乙酸钠或68g乙酸钠,加水溶解稀释至500m L㊂9.2.5乙酸钠-乙酸缓冲溶液:量取60m L乙酸钠溶液与40m L乙酸溶液混合,该溶液p H4.8㊂9.2.6显色剂:15m L甲醛与7.8m L乙酰丙酮混合,加水稀释至100m L,剧烈振摇混匀(室温下放置稳定3d)㊂9.2.7氨氮标准储备溶液(以氮计)(1.0g/L):称取105ħ干燥2h的硫酸铵0.4720g加水溶解后移于100m L容量瓶中,并稀释至刻度,混匀,此溶液每毫升相当于1.0m g氮㊂9.2.8氨氮标准使用溶液(0.1g/L):用移液管吸取10.00m L氨氮标准储备液于100m L容量瓶内,加水定容至刻度,混匀,此溶液每毫升相当于0.1m g氮㊂10仪器和设备10.1分光光度计㊂10.2电热恒温水浴锅:100ħʃ0.5ħ㊂10.310m L具塞玻璃比色管㊂10.4天平:感量为1m g㊂11分析步骤11.1试样消解称取充分混匀的固体试样0.1g~0.5g(精确至0.001g)㊁半固体试样0.2g~1g(精确至0.001g)或液体试样1g ~5g (精确至0.001g ),移入干燥的100m L 或250m L 定氮瓶中,加入0.1g 硫酸铜㊁1g 硫酸钾及5m L 硫酸,摇匀后于瓶口放一小漏斗,将定氮瓶以45ʎ角斜支于有小孔的石棉网上㊂缓慢加热,待内容物全部炭化,泡沫完全停止后,加强火力,并保持瓶内液体微沸,至液体呈蓝绿色澄清透明后,再继续加热0.5h ㊂取下放冷,慢慢加入20m L 水,放冷后移入50m L 或100m L 容量瓶中,并用少量水洗定氮瓶,洗液并入容量瓶中,再加水至刻度,混匀备用㊂按同一方法做试剂空白试验㊂11.2 试样溶液的制备吸取2.00m L ~5.00m L 试样或试剂空白消化液于50m L 或100m L 容量瓶内,加1滴~2滴对硝基苯酚指示剂溶液,摇匀后滴加氢氧化钠溶液中和至黄色,再滴加乙酸溶液至溶液无色,用水稀释至刻度,混匀㊂11.3 标准曲线的绘制吸取0.00m L ㊁0.05m L ㊁0.10m L ㊁0.20m L ㊁0.40m L ㊁0.60m L ㊁0.80m L 和1.00m L 氨氮标准使用溶液(相当于0.00μg ㊁5.00μg ㊁10.0μg ㊁20.0μg ㊁40.0μg ㊁60.0μg ㊁80.0μg 和100.0μg 氮),分别置于10m L 比色管中㊂加4.0m L 乙酸钠-乙酸缓冲溶液及4.0m L 显色剂,加水稀释至刻度,混匀㊂置于100ħ水浴中加热15m i n ㊂取出用水冷却至室温后,移入1c m 比色杯内,以零管为参比,于波长400n m处测量吸光度值,根据标准各点吸光度值绘制标准曲线或计算线性回归方程㊂11.4 试样测定吸取0.50m L ~2.00m L (约相当于氮<100μg)试样溶液和同量的试剂空白溶液,分别于10m L 比色管中㊂加4.0m L 乙酸钠-乙酸缓冲溶液及4.0m L 显色剂,加水稀释至刻度,混匀㊂置于100ħ水浴中加热15m i n ㊂取出用水冷却至室温后,移入1c m 比色杯内,以零管为参比,于波长400n m 处测量吸光度值,试样吸光度值与标准曲线比较定量或代入线性回归方程求出含量㊂12 分析结果的表述试样中蛋白质的含量按式(2)计算:X =(C -C 0)ˑV 1ˑV 3m ˑV 2ˑV 4ˑ1000ˑ1000ˑ100ˑF (2) 式中:X 试样中蛋白质的含量,单位为克每百克(g/100g );C试样测定液中氮的含量,单位为微克(μg );C 0试剂空白测定液中氮的含量,单位为微克(μg );V 1 试样消化液定容体积,单位为毫升(m L );V 3 试样溶液总体积,单位为毫升(m L );m 试样质量,单位为克(g);V 2 制备试样溶液的消化液体积,单位为毫升(m L );V 4测定用试样溶液体积,单位为毫升(m L );1000换算系数;100换算系数;F氮换算为蛋白质的系数㊂蛋白质含量ȡ1g /100g 时,结果保留三位有效数字;蛋白质含量<1g /100g 时,结果保留两位有效数字㊂。
凯氏定氮法测定蛋白质含量公式
凯氏定氮法测定蛋白质含量公式
1 凯氏定氮法
凯氏定氮法是一种常用的测定蛋白质含量的方法，由凯氏于1883
年提出。
它的原理是：将样品中的蛋白质氨基酸氧化分解为氨态水，
测定样品中氨态氮的含量，用凯氏定氮法公式计算蛋白质的实际含量。
2 凯氏定氮法的基本原理
凯氏定氮法的基本原理是将蛋白质氨基酸浓度通过离子交换树脂
提取，然后将氨基酸氧化分解为氨态水，再测定样品中氨态氮的含量，用凯氏定氮法公式计算蛋白质的实际含量，凯氏定氮法公式如下：
3 凯氏定氮法公式
蛋白质的实际含量=样品内的氨态氮的总量（毫克）÷6.25
其中6.25是认为蛋白质中的结构基元氨基酸的比例为1:6.25，也就是说，100毫克蛋白质中含有16毫克氨基酸，以此类推。
4 凯氏定氮法的优势
凯氏定氮法具有准确、快速、重现性好等特点，在实时测定立即
分析模式中，仍是最常用的技术。
从实验时间上看，凯氏定氮法比其
他定氮方式更加快捷，且准确率较高，受其实验程序简单、复杂材料
分离容易使用的优势受到广大研究人员的青睐。
5 凯氏定氮法的应用
凯氏定氮法大多用于测定含氨基酸的蛋白质，应用范围很广，一般应用在动物、植物的分子的氨基酸的分析，主要用于衡量蛋白质含量，便于计算组分，如果其他物质也能被氧化，也可以用它进行测定计算。
另外，凯氏定氮法也可以用于研究病毒、细菌等非蛋白质有机物的含氮量。
凯氏定氮法测定食品中蛋白质
T echno logy科技工艺技术
蛋白质被认为是构成生物体细胞组织的重要成分。
食物中的蛋白质是人体中氮的唯一来源，具有糖类和脂肪不可替代的作用。
含氮量是蛋白质区别于其他有机化合物的重要标志。
在检验食品中蛋白质时，通常是先检定出食品中的总氮量，然后乘以蛋白铜除作为催化剂外，还可以指示消化终点的到达，有机物全部消化完全后，溶液呈现清澈的蓝绿色，硫酸铜还可以做蒸馏时碱性反应的指示剂。
蒸馏
消化液中的硫酸铵在碱性环境下会
DOI:10.16043/ki.cfs.2016.24.079。
蛋白质测定-凯氏定氮法
在蒸馏过程中，要确保冷凝器 工作正常，以免造成氨气泄漏
。
在滴定过程中，要控制好滴定 速度，避免过快或过慢，影响
测定结果的准确性。
实验环境要求与维护
实验室应保持整洁、干燥、通风良好。
实验器具应妥善保管，避免损坏和污 染。
实验台面应定期清洁，保持无尘状态。
实验室的电源和加热设备应定期检查 和维护，确保安全可靠。
体积误差、氮换算系数误差等。
误差传递
02
根据误差来源，评估其对最终结果的影响程度，并计算误差传
递系数。
结果可靠性评估
03
根据误差传递结果，对测定结果的可靠性进行评估，判断是否
需要重新进行实验或采取其他措施来减小误差。
05
注意事项与安全
实验安全注意事项
01
实验操作应在通风橱中 进行，以避免吸入有害 气体。
结果计算
根据实验数据，计算样品 中的蛋白质含量。
误差分析
对实验结果进行误差分析， 确保测定结果的准确性和 可靠性。
04
结果分析与解读
数据记录与整理
实验数据
在实验过程中，需要准确记录每 个步骤中的数据，包括样品质量 、滴定体积、空白实验滴定体积 等。
数据整理
将实验数据整理成表格，列出每 个样品的各个测量值，以便后续 计算和分析。
限制
由于凯氏定氮法操作繁琐、耗时长、试剂消耗量大等缺点，对于一些低蛋白质含量的样 品或者特殊样品（如含有大量非蛋白质氮的样品），该方法可能不太适用。同时，凯氏 定氮法测定的结果受样品处理和操作过程的影响较大，需要严格控制实验条件和操作步
骤。
02
实验材料与设备
实验材料
硫酸铜
用于样品消化，提 供催化剂。
凯氏定氮法测定蛋白质含量
凯氏定氮法测定蛋白质含量摘要：凯氏定氮法被广泛应用于测定蛋白质含量。
本文主要介绍凯氏定氮法的原理、步骤和应用，并对该方法的优缺点进行了分析和讨论。
结果表明，凯氏定氮法具有简便、灵敏度高、重现性好等优点，适用于各种样品的蛋白质含量测定。
关键词：凯氏定氮法，蛋白质含量，测定方法，优缺点引言：蛋白质是生物体内最基本的组成成分之一，对于了解生物过程、疾病诊断和治疗等方面具有重要作用。
因此，准确测定蛋白质含量对于科学研究和医学实践具有重要意义。
目前，常用的蛋白质测定方法包括比色法、光谱法、生物学活性法和凯氏定氮法等。
其中，凯氏定氮法因其简便、灵敏度高、重现性好等优点而被广泛应用。
一、凯氏定氮法的原理凯氏定氮法是基于蛋白质中含有氮元素这一特点进行测定的。
该方法的原理是将样品中的蛋白质完全燃烧后，收集生成的氮气，并用浓碱溶液吸收氮气生成氨水。
然后使用酸滴定法测定可滴定酸的用量，从而间接计算出样品中蛋白质的含量。
二、凯氏定氮法的步骤凯氏定氮法的步骤主要包括样品的预处理、加热燃烧、氨水吸收和酸滴定等。
1. 样品的预处理：将待测样品称取适量，根据样品的特性选择适当的方法进行分解或加热处理，以使蛋白质完全释放出来。
2. 加热燃烧：将经过预处理的样品放入燃烧器中，加热到适当温度，使样品中的蛋白质完全燃烧产生氮气。
3. 氨水吸收：将生成的氮气通过吸收瓶中的浓碱溶液，生成氨水。
氨水的生成量与样品中蛋白质的含量成正比。
4. 酸滴定：用标准酸溶液滴定氨水中的可滴定酸，测定可滴定酸的用量，进而计算出样品中蛋白质的含量。
三、凯氏定氮法的应用凯氏定氮法广泛应用于生物化学、食品科学、环境监测等领域的蛋白质含量测定。
其应用范围包括但不限于以下几个方面：1. 食品科学：凯氏定氮法可以用于测定食品中的蛋白质含量，包括肉类、豆类、谷物等。
2. 生物化学：凯氏定氮法可用于测定细胞培养基中蛋白质的含量，用于生物过程的研究和细胞培养的质量控制。
3. 环境监测：凯氏定氮法可用于测定水样中蛋白质的含量，用于环境污染的监测和评价。
凯氏定氮法测定蛋白质含量
半微量凯氏定氮法测定蛋白质含量(一)方法原理样品与硫酸一同加热消化, 分解有机质, 释放出的NH3 与硫酸结合成硫酸铵留在溶液中。
在定氮消化瓶中,用氢氧化钠中和硫酸铵生成氢氧化铵,加热又分解NH3 ,用硼酸吸收, 用标定过的盐酸或硫酸滴定, 从而计算出总氮量, 换算为蛋白质量。
(二) 仪器、设备1. 仪器分析天平: 感量0.0001克；实验用粉碎机；半微量凯氏蒸馏装置；半微量滴定管, 容积10毫升；硬质凯氏烧瓶: 容积25毫升, 50毫升；锥形瓶: 容积150毫升；电炉: 600瓦。
2. 试剂(1) 盐酸: 分析纯, 0.02mol/L, 0.05mol/L标准溶液(邻苯二甲酸氢钾法标定)；(2) 氢氧化钠: 工业用或化学纯, 40%溶液(W/V)；(3) 硼酸: 分析纯, 2%溶液(W/V)；(4) 硼酸混合指示剂: 溴甲酚绿0.1克, 甲基红0.1克分别溶于95%乙醇中,混合后稀至100毫升, 将混合指示剂与2%硼酸溶液按 1:100比例混合, 用稀酸或稀碱调节PH值为4.5, 使呈灰紫色, 此溶液放置时间不宜过长, 需在1个月之内使用；(5) 加速剂: 五水合硫酸铜(分析纯)10克, 硫酸钾(分析纯)100克在研钵中研磨, 仔细混匀, 过40目筛；(6) 浓硫酸: 比重1.84, 无氮；双氧水: 分析纯,30%；蔗糖: 分析纯；(7) 双氧水硫酸混合液(简称混液): 双氧水、硫酸、水的比例为3:2:1, 即在100毫升蒸馏水中,慢慢加入200毫升浓硫酸, 待冷却后, 将其加入300毫升30%双氧水, 混匀, 此混液可一次配制500～1000毫升贮藏于试剂瓶中备用, 夏天最好放入冰箱或阴凉处贮藏, 室温(20℃)上下时不必冷藏, 贮藏进间不超过1个月。
(三) 操作步骤1. 样品的选取和制备选取有代表性的种子(带壳种子需脱壳)挑拣干净, 按四分法缩减取样, 取样量不得少于20克。
将种子放于60～65℃烘箱中干燥8小时以上, 用粉碎机磨碎, 95%通过40目筛, 装入磨口瓶备用。
.凯氏定氮法
凯氏定氮法是一种测定食物、饮料或饲料中蛋白质含量的经典方法。
这个实验方法需要使用浓硫酸和催化剂，将样品中的有机氮转化为氨，然后通过蒸馏将氨分离出来，最后用酸滴定液滴定，计算出氮的含量。
凯氏定氮法的步骤如下：
1. 样品处理：将样品研磨并干燥，然后加入硫酸和催化剂，进行消化反应。
这个过程需要控制温度和时间，以免样品烧焦或硫酸过度氧化。
2. 蒸馏：将消化液进行蒸馏，使氨气从溶液中分离出来。
蒸馏过程中需要控制温度和压力，以确保氨气能够完全分离。
3. 滴定：将蒸馏后的溶液用酸滴定液进行滴定，根据颜色变化判断滴定终点。
终点判断需要准确控制，否则会影响测定结果。
4. 计算：根据滴定的酸滴定液的体积和浓度，计算出氮的含量。
凯氏定氮法的优点是准确性高、可重复性好，可以用于测定各种食物、饮料和饲料中的蛋白质含量。
但是，该方法也存在一些缺点，例如需要使用浓硫酸和催化剂，操作比较危险，而且实验过程中会产生有害气体。
此外，凯氏定氮法测定的是样品中的总氮含量，而并非所有的氮都以蛋白质的形式存在。
因此，在某些情况下，可能需要采用其他方法来测定样品中的蛋白质含量。
总之，凯氏定氮法是一种经典的蛋白质测定方法，具有较高的准确性和可重复性。
但是，在操作过程中需要注意安全问题，并且需要控制好各个实验条件，以保证测定结果的准确性。
用凯氏定氮法测定食品中的蛋白质含量
溶液呈蓝色，不生成褐色的氢氧化铜沉淀。所以，加入的氢氧
化钠必须过量，并且动作还要迅速，以防止氨的流失。
４．７ 蒸气发生瓶内的水装至 ２／３ 体积并且保持酸性（在蒸气
发生瓶内的水中加入稀硫酸，使之呈酸性，内加甲基橙指示
剂数滴，水应呈橙红色，如变黄时，应该补加酸），以防止在碱
性条件水中游离氨蒸出，使结果偏大。
按图安装好微量定氮蒸馏装置。于水蒸气发生瓶内装水 至 ２／３ 容积处，加甲基橙指示剂数滴及硫酸数毫升，以保持水 呈酸性，加入数粒玻璃珠。在接受瓶中加入 １０ｍｌ ４０ｇ／ｌ 硼酸及 ２ 滴混合指示剂，将冷凝管下端插入液面以下。准确吸取消化 液 １０ｍｌ 于反应管内，经漏斗再加入 １０ｍｌ 氢氧化钠溶液，用 少量蒸馏水冲洗漏斗，夹好漏斗夹并水封，加热煮沸水蒸气 发生瓶内的水进行蒸馏。指示剂变绿色后继续蒸馏 １０ｍｉｎ，将 冷凝管尖端提离液面继续蒸 １ｍｉｎ。 ２．１．３ 滴定
３．１０６ ６．７８１ ５．７２０ ３．６４５ １５．７２０ ４５．４０１ １．１３０ １．２７４
３．１０３ ７．２０２ ６．３４２ ４．４７１ １６．７３３ ４８．４０９ １．１９２ １．５０１
３．１５５ ７．２４５ ６．３４１ ４．４６５ １６．２７４ ４９．４１５ １．２０４ １．５９４
凯氏定氮法检测食物中蛋白质含量与误差分析
结语
食品行业的飞速发展与人们对食 品安全的愈加重视都给食品质量检测 提出更高的要求，作为质量检测的从 业者，需对食品进行更加严格和准确 的检测。
凯氏定氮法检测食物中蛋白质含量与误差分析
□ 石红伟 大连普兰店市产品质量监督检验所
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食品安全导刊
2016年11月
DOI:10.16043/ki.cfs.2016.33.091 越来越多的人开始关注自身健康 与食品安全问题，精确地测定食品中 蛋白质含量对食品质量检测、食品安 全 都 极 为 重 要。 新 的 国 家 标 准《 食 品 中 蛋 白 质 的 测 定》（ＧＢ／Ｔ ５００９．５－ ２０１０）给出凯氏定氮法、分光光度法 和燃烧法 ３ 种可用于食品中蛋白质的 检验方法。其中凯氏定氮法在现阶段 检测中的使用最为广泛，其具有适用 范围广，检测试验重现性好，准确度 和灵敏度高， 被测样品用量少等优点， 因此本文主要具体介绍凯氏定氮法的 步骤和原理并分析其误差。
T
echnology
科技
分析与检测
的蒸发效率和吸收程度都直接决定检 测结果的准确度。 滴定 滴定主要目的定量测量蒸馏得到 的溶液中的铵根离子。其基本原理是 利用弱碱性的硼酸铵与强酸反应生成 铵盐和硼酸。一般采用已知浓度的稀 盐酸或稀硫酸对溶液进行滴定试验， 根据消耗的 ＨＣｌ 或 Ｈ２ＳＯ４ 的量计算出蒸 馏后溶液中氨的含量，折算成样品中 氮元素的含量，从而根据蛋白质中氮 元素的比例，通过计算得到被测样品 中蛋白质的含量。 F＝６．２５。 多次测量取平均值减小偶然误差 整个测量中涉及大量试剂的配制 使用，操作与读数，各种环境因素的 干扰等，这些都会使测量中产生偶然 误差，因此在蛋白质含量的测量中， 最终测量结果需要进行多次重复性试 验，并将得到的结果取算数平均值表 示， 以 此 减 小 测 量 的 偶 然 误 差， 并 且 如 果 待 测 样 品 蛋 白 质 的 含 量 即： Ｘ ≥ １ ｇ／１００ ｇ，其结果需要保留三位 有效数字；如果待测样品蛋白质的含 量即：Ｘ ＜ １ ｇ／１００ ｇ，其结果只需要 保留两位有效数字即可。 其他含氮物质的干扰 通过凯氏定氮法的基本原理与操 作步骤可发现，使用该方法检测时， 第一步消化的本质是将样品中的氮元 素全部转化生成硫酸铵，即凯氏定氮 法测量的是被测样品中有机物中含有 氮元素的总量，因此该办法并无法消 除样品中其他有机物中含有的氮元素 对测量结果的影响，如尿素、三聚氰 胺等。当年三鹿公司使用的蛋白质检 测方法便为凯氏定氮法，最终未能检 测出原料中的三聚氰胺而导致食品安 全事件。除去样品中非蛋白质部分有 （１） 机物中氮元素对整个测量的影响，要 先去除非蛋白质中的氮元素再进行具 体测量，或用其他方法测出非蛋白质 中的氮含量，再用总氮含量减去该值 再进行折算。
蛋白质的测定—凯氏定氮法测定食品中蛋白质
食品中蛋白质的测定——凯氏定氮法
实验原理
• 样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，其中碳和氢被氧化为 二氧化碳和水逸出样品中的有机氮转化为氨与硫酸结合成硫酸铵加碱蒸馏， 使氨蒸出，用硼酸吸收后再以标准盐酸或硫酸溶液滴定。根据标准酸消耗量 可计算出蛋白质的含量。
仪器
500ml凯 氏烧瓶
定氮蒸馏 装置
凯氏定氮法测食品中蛋白质的注意事项
（9）硼酸吸收液的温度不应超过40°C，如高于40°C可置于冷 水浴中。
（10）混合指示剂在碱性溶液中呈绿色，在中性溶液中呈灰色， 在酸性溶液中呈红色。
课后思考
• 凯氏定氮法测定 食品中蛋白质还 有哪些需要注意？
常量蒸馏按下式计算: 微量蒸馏按下式计算：
W c(V2 V1 ) 0.014 F 100 m
W c(V2 V1 ) 0.0 1 4 F 1 0 0 m 10 100
食品中蛋白质的测定——凯氏定氮法
实验步骤——计算 • 式中W—蛋白质的质量分数，%； • c—盐酸标准液的浓度，mol/L； • V1—空白滴定消耗标准液量，mL； • V2—试剂滴定消耗标准液量，mL； • m—样品质量，g； • 0.014—氮的毫摩尔质量，g/mmol； • F—蛋白质系数。
• 凯氏定氮步骤包括消化、蒸馏、 吸收、滴定、计算。
凯氏定氮法测食品中蛋白质的注意事项
（1）凯氏定氮法测定食品中蛋白质含量为粗蛋白
（2）所有试剂应用无氨蒸馏水配制
（3）消化过程应注意转动凯氏烧瓶，促进消化完全 （4）若样品含脂肪或糖较多时，易产生大量泡沫可采用小火或者可加入 少量辛醇、液体石蜡或硅油等消泡剂 （5）控制消化时间 ，一般消化至透明后，继续消化30min即可，但当含 有特别难以氨化的氮化合物的样品，消化时间需适当延长；
食品中蛋白质含量测定(凯氏定氮法,Kjeldahl Method)
食品中蛋白质含量测定（凯氏定氮法，Kjeldahl Method）一、目的与要求1、学习凯氏定氮法测定蛋白质的原理。
2、掌握凯氏定氮法的操作技术，包括样品的消化处理、蒸馏、滴定及蛋白质含量计算等。
二、实验原理蛋白质是含氮的化合物。
食品与浓硫酸和催化剂共同加热消化，使蛋白质分解，产生的氨与硫酸结合生成硫酸铵，留在消化液中，然后加碱蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后，再用盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量来乘以蛋白质换算系数，即得蛋白质含量。
因为食品中除蛋白质外，还含有其它含氮物质，所以此蛋白质称为粗蛋白。
三、仪器与试剂（一）试剂1、硫酸铜（CuSO4·5H20）2、硫酸钾3、硫酸（密度为1.8419g/L）4、硼酸溶液（20g/L）5、氢氧化钠溶液（400g/L）6、0.01mol/L盐酸标准滴定溶液。
7、混合指示试剂：0.1%甲基红乙溶液液1份，与0.1%溴甲酚绿乙醇溶液5份临用时混合。
8、黄豆粉。
（二）仪器微量定氮蒸馏装置：如图3- 所示。
图3-微量凯氏定氮装置1、电炉；2、水蒸气发生器（2L平底烧瓶）；3、螺旋夹a；4、小漏斗及棒状玻璃塞（样品入口处）；5、反应室；6、反应室外层；7、橡皮管及螺旋夹b；8、冷凝管；9、蒸馏液接收瓶。
四、实验步骤1、样品消化称取黄豆粉约0.3g（±0.001g），移入干燥的100mL凯氏烧瓶中，加入0.2g硫酸铜和6g硫酸钾，稍摇匀后瓶口放一小漏斗，加入20mL浓硫酸，将瓶以450角斜支于有小孔的石棉网上，使用万用电炉，在通风橱中加热消化，开始时用低温加热，待内容物全部炭化，泡沫停止后，再升高温度保持微沸，消化至液体呈蓝绿色澄清透明后，继续加热0.5h，取下放冷，小心加20mL水，放冷后，无损地转移到100mL容量瓶中，加水定容至刻度，混匀备用，即为消化液。
试剂空白实验：取与样品消化相同的硫酸铜、硫酸钾、浓硫酸，按以上同样方法进行消化，冷却，加水定容至100mL，得试剂空白消化液。
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课外任务 参考资料
《食品分析与检验技术》《食品理化检测技术》
凯氏定氮法 测定食品中蛋白质
一、概述
蛋白质是以氨基酸为最小构成单元的大分子的
含氮化合物，它是由20种氨基酸通过酰氨键以
一定方式结合，并具有一定的空间结构。
3
生理功能及在食品中的作用
生命的物质基 维持酸碱平衡、 水平衡 遗传信息的表
础
达方式
凯氏定氮法是通过测出样品中的总含氮量再乘以相应 的蛋白质系数而求出蛋白质的含量。
1.原理
1
样品与浓硫酸和催 化剂一同加热消化， 使蛋白质分解，其 中碳和氢被氧化为 二氧化碳和水逸出
2 样品中的有机氮 转化为氨与硫酸
3 加碱蒸馏，使氨
蒸出，用硼酸吸
收后再以标准盐 酸溶液滴定
结合成硫酸铵
2.实验步骤
R>0.999 方可使用
2.标准曲线绘制
（1）配置一定浓度（10mg/ml）的蛋白质标准溶液；
（2）分别量取4ml、5ml、6ml、7ml、8ml、9ml、
10ml蛋白质标准液于7支50ml比色管中；
（3）向上述7支试管中分别加入1ml四氯化碳后、用 最终测定溶 1h； 碱性酒石酸铜溶液稀释至50ml，振摇、静止 液中不能有沉 （4）取上清液在2000r/min离心5min 淀 、560nm测定吸
光度，绘制标准曲线。
3.样品测定
样品含量需在40-100mg内。
4.结果计算（mg/100g）
m 100 X m1
30
燃烧法
硼酸呈微弱酸性（ Ka 1 =5.8×10-10 ），用酸滴定不影响 指示剂的变色反应，它有吸收氨的作用 硫酸、盐酸溶液也可用作吸收剂。
各步骤操作细节图解：
样品消化→蒸馏→滴定 （1）样品消化
盖上小漏斗
瓶口不能对着人
样品+0.4g硫酸 铜+6g硫酸钾 消化终点 +20ml浓硫酸+ 玻珠数粒
45度角
滴定前
滴定终点
同时做一试剂空白实验，记录空白滴定消耗盐酸的体积。 21
实验注意事项—消化
（1）不时转动凯氏烧瓶、缓和沸腾消化 （ 2 ）消化至呈透明后，继续消化 30 分钟，一般消化 时间约4小时
（3）可加如少量辛醇、硅油做消泡剂
（ 4 ）样品不易澄清时可冷却后加入 30% 过氧化氢 23ml
22
消化 蒸馏
吸收、滴定
计算
第一步：样品消化
样品与浓硫酸加热消化，硫酸使有机物脱水并
破坏有机物，C、H氧化为二氧化碳、水逸出，蛋白
质分解为氨、与硫酸结合生成硫酸铵、留在溶液中
消化
对原子的前处理，使被测物质进入 溶液中，使不溶变为可溶、有机物分解 为可溶性无机物
（1）消化
总反应式：
2NH2（CH2）2COOH+13H2SO4 （NH4）2SO4+6CO2+12SO2+16H2O 一定要用浓硫酸（98%）
26
双缩脲法（分光光度法）
1.原理——双缩脲反应
碱性条件下、双缩脲与硫酸铜作用生成紫红色配 合物的反应。
KOH、 CuSO4、酒 肽键（-CO-NH-）与双缩脲结构相似、能呈现此 石酸钾钠配置
反应。
560nm处、由颜色深浅判定蛋白质含量多少。
27
标准曲线
标准曲线（standard curve）是指通过测定一系列 已知组分的标准物质的某理化性质，而得到的性 质的数值曲线。
先小火炭化，无泡沫 后，加大火力，液体 变蓝绿透明，继续加 热微沸30分钟
18
（2）蒸馏
取10ml消化稀释液沿小玻璃杯移入反 应室，少量蒸馏水冲洗，塞紧棒状玻 璃塞，向小玻璃杯内加入10ml40%NaOH, 提起玻璃塞，使NaOH缓慢流入反应室， 立即塞紧玻璃塞，并在小玻璃杯中加 水使之密封。
将消化液全部转移 到100ml容量瓶中
小结
24
自动凯氏定氮仪法
在凯氏定氮法的基础上发展起来的自动凯氏 定氮仪法，具有安全、高效、准确的优点。 仪器： 消化炉
自动蒸 馏装置
25
1、原理及适用范围 2、特点：
（1）消化装置用优质玻璃制成的凯氏消化瓶， 红外线加热的消化炉。 （2）快速：一次可同时消化8个样品，30分钟 可消化完毕。 （3）自动：自动加碱蒸馏，自动吸收和滴定， 自动数字显示装置。可计算总氮百分含量并记录， 12分钟完成1个样。
11
消化装置 “自动回流消化仪”
定氮消化的不同状态
消泡 碳化
澄清
RCH2(NH2)COOH+H2SO4→CO2+H2O+SO2+ (NH4）2SO4
消化过程中试剂作用
硫酸钾：提高溶液沸点、加快反应进程；
K 2 SO4 H 2 SO4 2 KHSO4
硫酸铜（蓝绿色）：催化作用
2CuSO4 Cu 2 SO4 SO2 O2 C 2CuSO4 Cu 2 SO4 SO2 CO2 Cu 2 SO4 2 H 2 SO4 2CuSO4 2 H 2O S 0 2
20-30min 1-10mg氮
Folin－酚试 剂法
紫外吸收法 考马斯亮蓝法
40-60min <5mg氮
灵敏度高、耗 时长、试剂配 制困难
5-10min 5-15min
50-100mg蛋 层析柱流出物 白质 检测 0～0.1mg/mL 较好，标准曲 线有轻微非线 性
7
二、凯氏定氮法测定蛋白质（粗蛋白）
课程名称 授课时间
食品理化检测技术 2016.4.15
授课班级 授课时数
营养1431 2
本次内容
食品中蛋白质含量测定
教具
多媒体
教学目标
重点 难点 能力训练方式方法 教学环节时间安排
能力（技能）目标 知识目标 1. 能 安 装 凯 氏 定 氮 法 1. 了解蛋白质测定意义 的消化、蒸馏吸收 2. 掌握常量凯氏定氮法测定蛋白 装置。 质方法 2. 能 根 据 结 果 判 定 食 3. 了解试验中各种试剂作用 品标准。 蛋白质测定原理、步骤 蒸馏、吸收装置的安装 讲解、问答、互动 复习：5min；讲解、互动：75min 小结：5min；看书巩固知识点：5min 对比微量和常量凯氏定 氮法实验试剂、步骤的 区别 课堂考勤 47
人及动物需要从 食品得到蛋白质
维持物质的代 谢及运转
营养指标、
食品生产工艺 指标。
及其分解产物，
来构成自身的蛋 白质
常见食物中蛋白质的含量
螺旋藻
牛肉
5
常见食物氮系数
氮系数：蛋白质含氮量的倒数，常用6.25表示。
6
蛋白质测定方法
方法 凯氏定氮法 双缩脲法 时间 8-10h 应用范围 0.2-1.0mg氮 优缺点 时间长 4)2SO4+2NaOH→NH3+Na2SO4+2H2O
注意事项：
氢氧化钠需过量、若不够，会生成 H2S,H2S是强酸，会使溶液颜色变红
01
02
防止样液中氨气逸出。
(3）吸收与滴定
吸收：加热蒸馏所放出的氨，硼酸溶液
滴定：盐酸标准溶液，
2 NH 3 4H 3 BO3 ( NH 4)2 B 4O7 5H 2O ( NH 4)2 B 4O7 5H 2O 2 HCl 2 NH 4Cl 4H 3 BO3
通入蒸汽开始蒸馏 加入NaOH溶液后颜色 为深蓝色或褐色 冷凝管下口浸入 硼酸溶液中 加10ml硼酸溶液和 混合指示剂2～3d
19
吸收液变蓝色后继 续蒸馏5分钟，将冷 凝管尖端提离液面 再蒸馏1min，用蒸 馏水冲洗冷凝管尖 端，取下接收瓶， 关闭电源
20
（3）滴定
取下接收瓶，用0.1000mol/L的盐酸或硫酸 标准溶液滴定至终点。