紧密连接蛋白claudin-6在人乳腺癌细胞和组织中的表达及与乳腺癌淋巴结转移的关系

grades of breast carcinoma（S-P，×400）
A：Fibroadenoma of breast ；B：Breast non-infiltrative ductal carcinoma；
C：Breast early infiltrative ductal carcinoma；D：Breast infiltrative ductal carcinoma
1.3 细胞株总 RNA 提取及 RT-PCR
用 0.25%胰蛋白酶消化培养的细胞，用 Trizol 试剂盒（Invitrogen 公司）按说明书提取 总 RNA。应用 Prime premier 5.0 软件设计 claudin-6 基因引物，引物序列如下：P1 5’-CAC TGC CAC TTC TGG ATG G-3，P2 5’-CAG TGC AGC TCC TTC AAC CT-3’。 引物由上海生工合 成，扩增片段为 741bp。α-tublin 作为内参照，其引物按文献[3]设计，序列如下：P3 5´-CAC CCG TCT TCA GGG CTT CTT GGT TT-3´，P4 5´-CAT TTC ACC ATC TGG TTG GCT GGC TC-3´。引物由 SBS Genetech 公司合成，扩增片段为 527bp。使用 TaKaRa RNA PCR Kit，按 说明进行 RT-PCR 反应（PCR 扩增仪为 PTC-100TM，美国）。claudin-6 和 α-tublin 基因的退 火温度均为 58℃。PCR 产物经琼脂糖凝胶电泳，照相，观察结果。
P
Breast carcinoma
38
16
Fibroadenoma of breast
30
21
5.25
P＜0.05
Age（Year）
20-40
20
12
40-60
13
3
60-80
5
1
5.56
P＞0.05
Histological grade
Ⅰ
14
10

Ⅱ
18
4
-3-
Ⅲ
6
Clinical stage
Ⅰ
17
2.2 免疫组化法检测结果
38 例乳腺癌组织中 16 例 claudin-6 阳性表达（见图 2），阳性率为 42.1%。30 例乳腺纤 维腺瘤中 21 例 claudin-6 阳性表达，阳性率为 70%，两者比较差异有显著性（P＜0.05）。 claudin-6 表达与乳腺癌病理分级及淋巴结转移有关联（P＜0.05），与患者年龄和临床分期无 关联（P＞0.05），见表 1。
E-mail：quanchengshi@
摘 要：目的：探讨紧密连接蛋白 claudin-6 在人乳腺癌细胞株、乳腺癌组织中的表达及与 淋巴结转移的关系，为判定乳腺癌淋巴结转移及估计预后提供依据。方法：应用 RT-PCR 和 免疫组织化学 S-P 法，对人乳腺上皮细胞株 HBL-100，低侵袭性乳腺癌细胞株 MCF-7，高 侵袭性乳腺癌细胞株 MDA-MB231 和 38 例人乳腺癌组织的 claudin-6 的表达进行检测。结果： claudin-6 在 HBL-100 细胞株中有表达，在乳腺癌细胞株 MCF-7 和 MDA-MB231 中均无表 达；乳腺癌组织中 claudin-6 表达明显低于对照组（P＜0.05）；claudin-6 表达与乳腺癌组织 的病理分级及淋巴结转移有关联（P＜0.05），与患者年龄和临床分期无关（P＞0.05）。结论： claudin-6 可能在乳腺癌的发生和转移中起一定的负性调控作用，并可作为判断乳腺癌淋巴结 转移和估计预后的参考指标。 关键词：claudin-6；乳腺癌；免疫组织化学；逆转录聚合酶链反应 中图分类号：R361.2
研究发现，多种上皮来源的肿瘤 claudins 的表达异常与肿瘤的浸润和转移有关，但 claudin-6 基因表达下调在人乳腺癌发生及转移过程中作用目前尚无定论。
claudins 是构成 TJs 的主要成分，共有 24 个家族成员，含有 4 个跨膜区域和两个胞外环 状区，相对分子质量在 17～27 之间。claudin-6 是 24 个 claudins 家族成员之一，位于染色体 16p13.3 位点，编码 219 个氨基酸，指导合成大约 23 的蛋白质。claudins 作为 TJs 的主要构 成蛋白，不仅具有调节细胞间物质流动和维持上皮细胞极性的功能，而且还参与细胞增殖分 化、基因转录、肿瘤抑制等过程。目前认为，claudins 蛋白的表达下调或缺失可作为细胞黏 附性丢失、凝聚力降低、分化变差及侵袭性增加的重要机制之一，在肿瘤发生发展及转移过 程中发挥重要作用。本实验采用 RT-PCR 和免疫组化技术对乳腺细胞株 HBL-100、低侵袭性 MCF-7 和高侵袭性乳腺癌细胞株 MDA-MB231 中 claudin-6 mRNA 的表达及 38 例乳腺癌组 织中 claudin-6 蛋白的表达进行了检测，并分析了与乳腺癌转移等生物学行为的关系，结果 显示，claudin-6 在 HBL-100 中有表达，而在 MCF-7 和 MDA-MB231 中均无表达；38 例乳 腺癌组织 claudin-6 表达阳性率 42.1%，与对照组 70%比较差异有显著性（P＜0.05），推测 claudin-6 或许作为乳腺癌表型抑制相关基因在乳腺癌的抑制过程中起一定的作用。Hoevel 等 [4]发现，人类乳腺癌细胞株中 claudin-1 mRNA 低表达或无表达，为了观察 claudin-1 对乳 腺癌的作用，他们用基因转染等方法，诱导 MDA-MB 361 乳腺癌细胞株表达 claudin-1。结 果表明，claudin-1 明显促进三维培养的乳腺癌细胞发生调亡，并且抑制细胞间活性分子等的 转运，提示乳腺癌发生过程中 claudins 表达下调一方面引起的 TJs 屏障功能的破坏，导致营 养素、生长因子和其他活性分子向肿瘤内部转运，促使肿瘤一直处于生长状态；另一方面 claudins 表达下调的肿瘤细胞不能进入细胞程序性死亡过程，促进肿瘤的发生和发展。本研 究认为，claudin-6 表达下调或许通过上述相同机制在乳腺癌发生中起作用，但其确切的作用 机制有待于进一步探讨。
计数资料组间比较确切概率法检验。所有数据均使用SPSS 12.0统计软件进行统计处理。
2 结果
2.1 RT-PCR 法检测结果
claudin-6 基因的 PCR 产物为 741bp。乳腺上皮细胞株 HBL-100 有 claudin-6 表达，乳腺 癌细胞株 MCF-7 和 MDA-MB231 均未见目的基因片段，见图 1。
紧密连接（tight junctions，TJs）存在于上皮细胞和内皮细胞的连接复合体中，主要由 claudins、occludin 和连接粘附分子（junctional adhesion molecules，JAM）构成，具有细胞 黏附、维持细胞极性和通透性及辅助信号传递蛋白调节细胞增殖分化等功能[1]。尽管这些蛋 白的确切功能不清楚，但 claudins 作为 TJs 的主要构成成分在 TJs 中起重要作用。目前认为， TJs 结构和功能的异常可作为肿瘤细胞侵袭的先决条件，有利于肿瘤细胞侵袭和转移[2]。本 课题组在前期研究工作中克隆和鉴定了与乳腺癌表型抑制相关的 claudin-6 基因，同时发现 在鼠和人乳腺癌细胞中表达下调[3]，推测 claudin-6 或许在乳腺癌发生和转移过程中起一定作 用。研究发现，claudins 在多种上皮来源的肿瘤中表达异常[2,3]，这种异常表达与一些肿瘤的 浸润和转移表型有关。目前有关 claudin-6 基因与人乳腺癌转移等相关研究尚未见报道。本 实验通过分析 claudin-6 的表达及与乳腺癌淋巴结转移等生物学行为关系，探讨 claudin-6 在 抑制人乳腺癌发生和转移中的作用。
claudin-6 α-tublin
1 2 3M
bp
2000 1500 1000 750 500
图 1 claudin-6 mRNA 在不同乳腺癌细胞株中的表达
Fig.1 Expression of claudin-6 mRNA in mammary tumors M：Marker DGL2000；Lane1：HBL-100；Lane 2：MCF-7；Lane 3：MDA-MB231
1.2 标本来源
收集 2002—2003 年本室乳腺癌活检标本 38 例。所有乳腺癌患者均为女性，术前均未经 任何抗癌治疗，经病理学检测证实均为乳腺导管癌，其中淋巴结转移阳性 15 例，阴性 23 例。按 TNM 临床分期（UICC 1997 年分期标准）：I 期 17 例，Ⅱ期 12 例，Ⅲ期 9 例，Ⅳ期
Ⅱ
12
Ⅲ
9
Lymph node metastasis
+
15
-
23

2
8.047
P＜0.05
9
5
2
2.279
P＞0.05
2
14
8.416
P＜0.05
3 讨论
本文作者在乳腺癌抵抗性 Copenhagen 大鼠乳腺上皮细胞中，克隆和鉴定了 claudin-6 基 因，同时发现鼠和人的乳腺癌细胞中 claudin-6 表达下调[3]，推测 claudin-6 或许作为乳腺癌 表型抑制相关基因在抑制乳腺癌过程中起一定的作用。

紧密连接蛋白 claudin-6 在人乳腺癌细胞和组织中的 表达及与乳腺癌淋巴结转移的关系1
吴琼 1，曲珊珊 1，刘亚芳 1，张海英 1，吴晓艳 1.2，全成实 1，李玉林 1
1 吉林大学基础医学院病理生物学教育部重点实验室，长春 （130021） 2 吉化总医院一院心内科，吉林吉林（132021）
1 本课题得到高等学科博士学科点专项科研基金（项目编号：20060183071），吉林省科技发展计划项目（项 目编号：200505141），国家自然科学基金（项目编号：30670807）的资助。