稳定过表达p50基因细胞株的构建及鉴定
稳定表达猪δ_冠状病毒S1_蛋白CHO_细胞系的构建与鉴定
河南农业科学，2023，52（6）：131‐138Journal of Henan Agricultural Sciencesdoi ：10.15933/ki.1004‐3268.2023.06.014稳定表达猪δ冠状病毒S1蛋白CHO 细胞系的构建与鉴定孙雪珂1，2，丁培阳3，王思桥1，2，刘思源2，李明慧2，常泽杰2，陈艺兰2，李瑞琪2，张改平1，2，4（1.河南农业大学生命科学学院，河南郑州450002；2.河南省农业科学院动物免疫学重点实验室，河南郑州450002；3.郑州大学生命科学学院，河南郑州450001；4.江苏高校动物重要疾病与人兽共患病防控协同创新中心，江苏扬州225009）摘要：为构建稳定表达猪δ冠状病毒（PDCoV ）S1蛋白的CHO 细胞系，利用电转染技术将重组质粒pCGS3-S 1转染至CHO 细胞，通过有限稀释法筛选稳定表达重组S1蛋白的单克隆细胞系。
利用阴离子交换层析和凝胶过滤层析方法对重组S1蛋白进行纯化，采用间接ELISA 方法检测重组S1蛋白活性。
将纯化的重组S1蛋白免疫BALB/c 小鼠，通过间接ELISA 、间接免疫荧光试验（IFA ）及病毒中和试验对重组S1蛋白免疫原性进行检测。
结果显示，稳定表达PDCoV S1蛋白的CHO 细胞系成功建立，并获得了纯度高于90%、产量为28.5mg/L 的重组S1蛋白；且重组S1蛋白与PDCoV 阳性血清反应性良好，具有良好的免疫原性，中和效价为1∶128。
综上，成功建立了稳定表达PDCoV S1蛋白的CHO 细胞系，且纯化获得的重组S1蛋白具有良好的生物学活性。
关键词：猪δ冠状病毒；S1蛋白；CHO 细胞；稳定表达；蛋白质纯化中图分类号：S855.3文献标志码：A文章编号：1004-3268（2023）06-0131-08收稿日期：2023-01-14基金项目：河南省重大科技专项（221100110600）作者简介：孙雪珂（1997-），女，河南新乡人，在读硕士研究生，研究方向：动物免疫学。
过表达质粒的构建及转染
过表达质粒的构建及转染质粒及菌液说明过表达质粒为高纯度的DNA 粉末制品，经过真空冷冻干燥的质粒是呈薄膜状或粉末状附在离心管中，请适当离心(10000r/min 10~15s)后小心开启，以免飞扬丢失。
请根据实验需要的质粒浓度和质粒的总量加入适量的ddH2O (通常建议储存液浓度500ng~1μg/μL），合上管盖充分震荡使其溶解后可用于细胞转染及其他分子生物学实验。
粉末制品的DNA 可长期保存（建议最好不要超过6个月），质粒溶解后建议在-20℃的环境中存贮，避免多次冻融处理。
2、甘油菌液为含有重组质粒的菌液的过夜培养物与甘油的混合物，甘油的终浓度为20% 。
客户收到甘油菌液建议即刻活化（例如取50~100µL到5mL 含有相应抗性(根据载体种类可以选择25~50μg/mL 卡那霉素或50~100μg/mL 氨苄霉素）的LB 培养基过夜活化（12~16h），活化后的菌液与适量甘油混匀后于-80℃保存。
）3、重组质粒测序峰值图文件结果请参见附件报告中的.abl 文件。
测序序列文件参见与峰值图文件同名的.seq 文件。
基因过表达实验设计在使用载体法针对某一基因进行过表达研究过程中，通常会遇到如下几个问题：实验对照组的确立、细胞转染条件的确定、基因表达效率的检测。
1. 实验对照组的确立在一个完善的基因过表达实验设计中，必须考虑设立正确合理的实验对照组。
通常，这些对照组包括阴性对照、转染试剂对照。
阴性对照通常是用基因过表达选择的载体对应的空载体来作为对照。
2. 细胞转染条件的确定使用DNA 载体转染细胞时，为了选择合适的转染方法和确定转染效率，通常采用报告基因来检测DNA 的导入情况。
最常用的报告基因是绿色荧光蛋白。
3. 基因表达效率的检测通常用两大类方法来检测过表达质粒中目的基因表达的效率，一类方法是直接检测目的基因在不同水平如mRNA 和蛋白水平的变化，具体的方法如qPCR 和Western blot 等；另一类方法是通过检测目的基因的生物学效应和细胞效应来间接的反映目的基因的表达变化，这一类方法很多，不同的基因有不同的检测方法。
稳定细胞株筛选
稳定株构建 FAQ转自微博思路迪慢病毒包装1，什么是瞬时转染和稳定转染？答：瞬时转染：顾名思义，外源片段的表达时间短暂。
这主要是因为外源导入的裸露的载体整合入基因组的几率非常低，所以以染色体外(episomal)形式存在，不能随细胞分裂而一同复制导致最后拷贝数被稀释导致的。
而且考虑到细胞分裂会稀释质粒的量，所以起初转染的质粒拷贝数极高。
这就导致瞬时转染呈现一个高拷贝到低拷贝迅速降低的过程，且无法在这个系统上实现可诱导表达。
稳定转染：是相对瞬时转染而言，进入细胞的质粒整合入细胞基因组中，并能随细胞分裂稳定传递下去。
在这个系统中，质粒表达稳定，拷贝数低，且能实现诱导表达。
稳定转染并不是一种与瞬时转染不同的方法，只是对瞬时转染的细胞进行筛选，得到稳定整合的细胞株。
稳定整合的几率因基因传递的方法而异，跨度可以从10-8到10-1。
因此，对于有的转染方法，比如化学试剂介导的转染，其整合几乎可以忽略不计。
质粒载体整合的位点并不是完全随机分布，依据不同的基因传递方法，呈现不同的靶向倾向性，所以是一种半随机整合。
不同基因传递方法对质粒稳定表达的影响见表XXXX。
2，设计稳定株构建实验需要考虑的因素有哪些？∙答：稳定整合试验中需要考虑的几个关键因素有：∙1)，外源插入片段的拷贝数。
多数情况下，低拷贝甚至是单拷贝可以减少人为实验因素的干扰。
∙2)，整合的几率，这不仅决定了稳定株筛选的难易程度，而且还可以帮助人们更容易得到混合稳定株。
∙3)，整合位点的转录活跃度，决定了稳定株中外源片段的表达质量。
最理想的状况是单拷贝，但转录活性比较高。
∙4)，整合后的稳定性。
不同的整合位点决定了外源片段在染色体中的稳定性，有些区域易发生重组或者丢失，从而导致稳定株再次丢失的情况。
∙5)，最好使用混合稳定株或者获得多个不同单克隆稳定株。
因为稳定整合往往伴随这插入失活宿主内源基因，所以实验时通过使用混合稳定株，或者对多个单克隆稳定株进行比较，可以帮助研究人员获得更精确的实验数据。
34βE12-P63及P504S在前列腺增生及前列腺癌组织中的表达及意义
34βE12\P63及P504S在前列腺增生及前列腺癌组织中的表达及意义摘要：目的：探讨34βE12、P63及P504S在前列腺癌及前列腺增生中的表达情况及其在良恶性病变的鉴别意义。
方法：应用免疫组化SP法，选用P504S 联合34βE12及P63抗体，对117例前列腺电切或穿刺标本进行检测。
结论：联合应用P504S、34βE12及P63免疫组化检测，对前列腺良恶性病变鉴别诊断具有重要意义。
关键词：前列腺癌；前列腺增生；34βE12；P63；P504SAbstract: Aim: to study the 34 β E12, P63 and P504S in prostate cancer and prostate hyperplasia of the expressions in good condition and its identification of m alignant change meaning. Methods: using immunohistochemical SP method, choose P504S 34 β E12 and joint P63 antibody, 117 cases of prostate biopsy specimens were cutting or testing.Conclusion: combined application of 34 β E12 P504S, and P63 immunohistochemical testing, the prostate benign and m alignant lesions in the differential diagnosis is of great significance.Key words: prostate cancer; Prostate hyperplasia; 34 β E12; P63; P504S前列腺癌在世界最常见的肿瘤中位于第六位，在男性常见肿瘤中排第三位，且有上升的趋势。
大学分子生物学考试练习题及答案441
大学分子生物学考试练习题及答案41.[单选题]在DNA损伤时激活，可诱导细胞凋亡或转录因子，被称为真核细胞基因组守护神的蛋白是( )A)p50B)p51C)p52D)p53答案:D解析:2.[单选题]真核生物中rRNA包括()。
A)28S,18S和5SrRNAB)23S,16S和5SrRNAC)23S,16S和5.8SrRNAD)28S,23S,5.8S和5SrRNA答案:A解析:3.[单选题]能与tRNA反密码子中的I 碱基配对的是A)GB)C、UC)UD)U、C、A答案:D解析:4.[单选题]下列关于DNA和RNA聚合酶的叙述，哪一项是正确的A)RNA聚合酶用核苷二磷酸而不是核苷三磷酸来合成多核苷酸链B)RNA聚合酶需要引物，并在生长的多核苷酸链的5'端加上核苷酸C)DNA聚合酶能在核苷酸链的两端加上核苷酸D)所有RNA和DNA聚合酶只能在生长的多核苷酸链的3'端加上核苷酸答案:D解析:5.[单选题]DNA引发酶参与了DNA合成，它是一种( )A)催化RNA引物 合成的RNA聚合酶B)催化RNA引物 合成的DNA聚合酶C)催化DNA引物合 成的RNA聚合酶D)催化DNA引物 合成的DNA聚 合酶解析:6.[单选题]在组蛋白Lys残基发生的化学修饰中,哪种方式通常仅激活基因表达?A)甲基化B)乙酰化C)泛酰化D)生物素化答案:B解析:7.[单选题]反密码子的化学性质属于（）分子。
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稳定表达EGFRvIII的U87MG细胞株的建立与鉴定
库 。 ｐＤ ｃ ＮＡ４Ｔ Ｅ Ｆ ｖＩ ／ Ｏ－ Ｇ Ｒ Ｉ Ｉ质 粒 由 Ｕ ｉｅｓ ｙ ｆ Ｔｅａ ｎｖｒｉ ｏ ｘｓ ｔ Ｓ ｕｈ ｓ ｒ ｄｃｌ ｅ ｔ ｏ ｔｗｅｔ ｎＭｅ ｉ ｎｅ ｅ ａＣ ｒ的 Ａｍｙ Ｈａｉ 授 惠 赠 。 ｎＡ． ｂ ｂ教
Ｄ Ｍ 培养基及 Ｚ ｏｉ 自 Ｉｖｔ ｇ ｎ公司 ， ＭＥ ｅｃ ｎ购 ｎｉｏｅ ｒ 胎牛血清 购 自
培养并鉴定 。
表达 Ｅ Ｆ ｖＩ的 Ｕ８ ＭＧ细胞株 ， ＧＲＩ Ｉ ７ 为进一步 的抗肿瘤 治疗及
其 机 制研 究 提 供 基 础 。
１ 材 料 和 方 法
１ １ 材 料 ．
人恶性胶质瘤细胞 系 Ｕ８ ＭＧ由南方医科大学神 经生物 ７ 学教研 室保 存 ， ４ １细胞购 自中山大 学实 验动 物 中心细 胞 Ａ３
ＮＡ４ Ｔ ＥＧ ＲｖＩ质粒导入 Ｕ８ ＭＧ细胞 ， ／ Ｏ￣ Ｆ ｌＩ ７ 加入 ｚｏｉ ｅｃｎ筛选 ， 进一步将细胞有限稀释并克隆化培养 以建立稳定 的转染细胞株 。应用 Ｒ － Ｃ Ｗｅｔｒ ｌｔ 细胞免疫荧光染色方法鉴定稳定表达 Ｅ Ｒ Ｉ！ 因的细胞株 。结果 ： Ｒ Ｐ Ｒ鉴定发现 Ｖ６号和 Ｖ２ Ｔ Ｐ Ｒ、 ｓｅｎｂｏ 及 ＧＦ ｖＩ基 经 Ｔ－Ｃ ４ 号单克隆细胞株 Ｅ ＲｖＩ 基因 ｍＲＮ ＧＦ ｌＩ Ａ水平高表达 ， 进一步 Ｗｅｔｒ ｌｔ ｓｅｎｂｏ 及细胞免疫荧光染色方法鉴定发现 Ｖ６号细胞株 Ｅ ＲｖＩ ＧＦ Ｉ Ｉ 蛋 白水平高表达 。结论 ： 成功建立了稳定表达 Ｅ Ｒ ＩＩ Ｕ８ ＭＧ细胞株 ， ＧＦ ｖＩ 的 ７ 为进一步的抗肿瘤治疗及其机制研究提供基础。 关键词： Ｅ Ｒ Ｉ ； Ｕ８ ＭＧ细胞 ； 基因表达 ＧＦ ｖＩ Ｉ ７
2014年山西省基础研究计划(青年科技研究基金)项目资金表
MAZ和骨骼肌细胞分化的相关性研究 GPRC6A基因稳定低表达细胞株的建立及在前列腺癌转移中的研究 MicroRNA对喉癌血管生成拟态的影响 脑缺血再灌后酸化处理的神经保护作用及其与mPTP的关系 脂联素对缺氧复氧心肌细胞肌浆网钙泵的影响及机制研究 shRNA下调CIAPIN1基因对低氧大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖及凋亡的影响及 2014021038-3 山西医科大学 机制 2014021040-3 肠源性内毒素血症致T2DM中细胞凋亡作用机制的研究 山西医科大学
贾晓军 阴彩霞 杨勇刚 冯丽恒 冯晓晶 姚美萍 张玉驰 卢华东 吕鑫 张静 陈新伟 陈千 温静 刘志强 张姝 李彬春 郭东罡 云洋 马敏 刘亚平 朱芷葳 陈义刚 吴昊 曹锡梅 刘铭 冯彦 范彦英 郭佳 师锐赞 周鑫
2014-2016 2014-2016 2014-2016 2014-2016 2014-2016 2014-2016 2014-2016 2014-2016 2014-2016 2014-2016 2014-2016 2014-2016 2014-2016 2014-2016 2014-2016 2014-2016 2014-2016 2014-2016 2014-2016 2014-2016 2014-2016 2014-2016 2014-2016 2014-2016 2014-2016 2014-2016 2014-2016 2014-2016 2014-2016 2014-2016
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2014年山西省基础研究计划（青年科技研究基金）项目资金表
编 号 项 目 名 称 离子液体阴阳离子协同控制微孔磷酸盐的合成及其应用性能 Hayman 定理的差分对应定理的研究 半代数集的拓扑刻划研究 关于图和有向图圈结构若干问题的研究 三元杂化腔光机械系统中的光学特性研究 骨单元内部液体的流动行为及骨的力-电效应研究 硅铝/炭分子筛的制备及对CH4/N2吸附性能的研究 煤制天然气高稳定性Ni基催化剂的设计、可控制备及机理研究 共轭桥结构对二硫富瓦烯染料敏化太阳能电池性能影响的研究 基于Huisgen两性离子的环化反应研究 磁响应性絮凝剂的组装设计与嵌套结构形成机理研究 LPSO相增强Mg-Li合金组织结构设计及性能研究 多元Mg-Sn-Ca-X合金的连续定向凝固和变形加工研究 锆基非晶复合材料的磨损及其失效机制 Mn-Ni基铁磁形状记忆合金的磁性马氏体相变、磁热和磁电阻效应研究 Nb:SrTiO3衬底上钙钛矿型铌酸盐薄膜的制备、物理特性及磁电耦合研究 基于脉冲沉积和InN嵌入法的高铟InGaN及其量子阱的外延生长和光学性质 研究 Fe3O4磁性纳米粒子的表面改性及其在OLED器件中的应用 贵金属修饰BiOBr薄膜的可控制备、光催化性能及反应机理研究 欠氧型钨基氧化物填料的纳米可控制备及光学性能优化 可生物降解聚乳酸纤维材料的碳纳米管改性及降解行为研究 新型功能蛋白rHGFI在促进碳纳米管表面改性中的应用研究 非共价功能化法修饰碳纳米管分散性及其分散机理的研究 基于统计纹理分析的指纹特征提取与匹配的研究 多示例学习特征提取算法研究 基于视觉认知的图像识别模型研究 融合听觉滤波器子带划分的多声源定位方法研究 基于差分进化的多径估计算法研究 基于共振光隧穿效应的折射率计研究 基于极限学习机的机械故障诊断和状态趋势预测的研究 扭矩激励下转子系统磨损机理与试验研究 基于声发射分析的机械设备碰摩故障信号提取研究 近30年来山西省农业干旱时空演变规律及其对气候变化的响应研究 基于可见光响应碳基磁性TiO2纳米颗粒降解有机废水研究 煤矸石在胶结充填中的改性利用研究 承 担 单 位 太原理工大学 太原理工大学 太原理工大学 太原理工大学 太原理工大学 太原理工大学 太原理工大学 太原理工大学 太原理工大学 太原理工大学 太原理工大学 太原理工大学 太原理工大学 太原理工大学 太原理工大学 太原理工大学 太原理工大学 太原理工大学 太原理工大学 太原理工大学 太原理工大学 太原理工大学 太原理工大学 太原理工大学 太原理工大学 太原理工大学 太原理工大学 太原理工大学 太原理工大学 太原理工大学 太原理工大学 太原理工大学 太原理工大学 太原理工大学 太原理工大学 太原理工大学 主持人 刘雷 丁杰 高犇 杨卫华 陈彬 武晓刚 程文萍 闫晓亮 郭鹍鹏 周荣 马建超 边丽萍 阙仲萍 杨慧君 轩海成 曹恩思 鲁麟 董清晨 张小超 康利涛 刘淑强 牛宝龙 马婧 陈宏涛 柴晶 邓红霞 黄丽霞 程兰 菅傲群 兰媛 庞新宇 武志斐 刘珺 崔佳丽 郭育霞 起止时间 2014-2016 2014-2016 2014-2016 2014-2016 2014-2016 2014-2016 2014-2016 2014-2016 2014-2016 2014-2016 2014-2016 2014-2016 2014-2016 2014-2016 2014-2016 2014-2016 2014-2016 2014-2016 2014-2016 2014-2016 2014-2016 2014-2016 2014-2016 2014-2016 2014-2016 2014-2016 2014-2016 2014-2016 2014-2016 2014-2016 2014-2016 2014-2016 2014-2016 2014-2016 2014-2016 经费 122 10 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 单位：万元 验收
稳定过表达细胞株的鉴定
稳定过表达细胞株的鉴定
鉴定稳定过表达细胞株是确保实验结果准确可靠的重要步骤。
通常，稳定过表达细胞株被构建来表达外源基因，这些基因可以编码蛋白质、RNA或其他生物分子。
在构建过程中，细胞株被转染并在筛选过程中选出表达外源基因的细胞株。
然而，仅仅检测外源基因的表达并不足以证明细胞株是稳定的。
为了鉴定稳定过表达细胞株，需要进行以下步骤：
1. 稳定性测试：通过连续培养稳定过表达细胞株多代，观察外源基因表达是否稳定。
通常，细胞株需要在稳定条件下培养至少20代，以确保表达稳定。
2. 比较分析：与野生型细胞株进行比较分析，例如测量细胞增殖速率、形态学、细胞周期等。
如果稳定过表达细胞株与野生型细胞株存在显著差异，则该细胞株可能存在异常。
3. 稳定性标记：将可观察的标记或标签引入到外源基因表达系统中，以确定细胞株是否稳定。
例如，可以将荧光蛋白或其他荧光标记引入到外源基因中，观察标记的表达是否稳定。
通过以上步骤鉴定稳定过表达细胞株，可以确保实验结果的准确性和可靠性。
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贵州医科大学学报2020年第45卷1
贵州医科大学学报2020年第45卷1〜12期主题索引［按汉语拼音字母顺序排列，文章题名后为作者（期）：页］A癌EGF对三阴乳腺癌细胞迁移和侵袭的影响及CANP-YAP通路的介导作用......张莹，等（1）：23基于TCGA数据库及转录组数据分析HDAC1基因在胃癌中的表达和临床意义....................................................................李抄，等（2）232辛二酰苯胺异羟肟酸联合索拉菲尼对人肝癌细胞增殖和凋亡的影响.......蔡爽，等（2）221前列腺癌差异表达基因的分析及其miRNA和IncRNA的预测............宋咏刚，等（2）221人脑胶质瘤组织PI3K蛋白的表达及其与临床病理特征的关系............吴国敏，等（3）224Ph*急性B淋巴细胞白血病耐伊马替尼细胞模型的建立..................方宗宇，等（4）212直径小于22mm结直肠癌黏膜下浸润内镜特征分析....................李大欢，等（4）：461结直肠癌中HIFYa、CD147和MMPY表达与临床病理特征的关系.......朱长龙，等（4）：466Billroth-II与Roux-en-Y重建消化道对高龄胃癌患者术后中长期生存质量的影响..................................................................杨小进，等（4）266CalothriRnB衍生物对白血病K562细胞的抑制作用及机制..................龙群，等（5）：497Flavaglicns类化合物对人白血病HEL细胞的作用及机制..................龙群，等（5）255阿立塞替通过靶向Aurora激酶A提高人非小细胞肺癌细胞的放射敏感性……李舜，等（5）231PARP抑制剂对胰腺癌细胞的抗肿瘤机制及耐药性分析................王蒲雄志，等（5）256老年肺炎诱发多器官功能障碍患者感染指标、肿瘤坏死因子及血气指标的表达及意义..................................................................徐国宾，等（5）255MMP28在胰腺癌中的表达和对胰腺癌细胞增殖、侵袭及迁移的影响..........李琳，等（6）221MMP23在胰腺癌PFK-Ykt信号通路中的作用及机制......................李琳，等（6）：627沉默LRcO2122对胰腺癌细胞MIAPaCa-2侵袭及迁移的影响............何美玲，等（6）243BRCA2蛋白表达与乳腺浸润性导管癌临床病理特征的关系..............孙紫君，等（6）255miR-32a-5p对口腔鳞状细胞癌CAL-27细胞的影响及分子机制..............马明，等（6）：678CD147和EGFR及HIFY 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I钙蛋白酶抑制剂对雌激素诱导人乳腺癌细胞上皮-间质转化的影响金爱，等（12）：1376基于生物信息学的宫颈癌枢纽基因筛选及其与预后的关系............许修颖，等（12）1382三氧化二砷对体外人小肠癌HIC细胞增殖和凋亡的影响..............杨云洪，等（12）1417NF-k B表达在胰腺癌的诊断和预后中的价值........................郭江福，等（12）：1459地西他滨联合CAG化疗方案对AML老年患者IGF-1和VEGF水平及免疫功能的影响................................................................雷丽华，等（12）:1469B病理生理学灵芝三萜类化合物对砷中毒大鼠脑组织氧化应激损伤的影响..............张癑，等（3）：277辅酶Q10对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用及机制..................李辉，等（7）：805miR-96调节结核分枝杆菌诱导的活动性肺结核的机制..................武丽，等（11）：1027C传染性疾病贵州医疗队赴鄂州救治重症新型冠状病毒肺炎患者的措施探讨............詹玮，等（4）：392腹腔镜下卵巢打孔数目对枸椽酸氯米芬抵抗多囊卵巢综合征疗效的影响…王厚梅，等（4）：482普通型COVIC-14患者肝功能损害与消化道症状的关系..................李永宁，等（9）：733传染性单核细胞增多症儿童外周血中TLR7mRNA及78-9CR型DNT细胞的表达..................................................................吴振奎，等（9）：1077不同免疫治疗方法治疗儿童重症手足口病的效果......................王凌，等（11）:1313CBP和IBP治疗腹腔感染合并腹腔高压的疗效比较..................韦卫琴，等（12）：1433E耳鼻咽喉科低温等离子射频消融术辅助鼻内镜对慢性鼻-鼻窦炎的治疗效果........毛志强，等（1）:114 miR-145-9p对变应性鼻炎小鼠Notch1表达和Treg/Thl7免疫平衡的影响…闫智永，等（6）:669维生素D联合枸地氯雷他定及糠酸莫米松鼻喷雾剂对慢性鼻窦炎鼻内镜术后患者的治疗效果..................................................................陈伟章，等（6）：717儿科学贵州省西部燃煤型地氟病区8~14岁农村小学生营养不良和氟斑牙调查……喻艳琴，等（1）:13 112例新生儿医院内感染临床分析.......................................李君，等（2）：244维生素A和E缺乏与儿童反复呼吸道感染发生的相关性....................李云鹏（3）：331198例小儿重症肺炎病原学分析.......................................孙永烽，等（3）：3452362例新生儿窒息及其器官功能损害分析林晴晴，等（3）：368不同BMI学龄期患儿行四肢手术插管全麻期间的血气参数及呼吸参数特点分析..................................................................李玲霞，等（4）：472机械通气联合PS对早产儿RDS的治疗效果............................方婉茹，等（4）：491未足月胎膜早破新生儿脐血MCP-1和pro-ADM水平与绒毛膜羊膜炎的相关性....................................................................李惠，等（6）：727饮食控制联合肠内营养粉剂对苯丙酮尿症患儿的治疗效果..............左雪梅，等（6）：737毛细支气管炎住院婴儿的临床和病原学特征分析....................蒙文娟，等（11）4366F分子生物学甩UVd基因09594738位点与贵州燃煤污染型地氟病的相关性.................田薇，等（1）4胶原诱导性关节炎大鼠血清TNF-a、IL«、IFN-y及IL-10水平变化............谭艳，等（3）：18PCSK4基因5'UTR区rs45448095基因多态性与血浆LDL-C水平的相关性……张营，等（3）：39幽门螺杆菌毒力蛋白叫剁基因敲除突变株构建及鉴定....................李抄，等（2）：125家蝇三龄幼虫Clip-Msp基因克隆及白假丝酵母菌刺激下的时空表达.....常振策，等（2）：137家蝇三龄幼虫Mdctl基因原核表达及生物信息学分析....................常振策，等（2）：127人参皂苷Rd对U253神经胶质瘤细胞凋亡的影响......................楚丽丽，等（2）：132大鼠Slfn7基因重组腺病毒载体的构建和包装.....Nganguem Nzalle Yranney Brice，等（3）:266柯萨奇病毒B组2型SYBRGreen I RT-PCR检测方法的建立............杨亚平，等（7）：313a硫辛酸对缺血再灌注诱导的PC12细胞应激性凋亡抑制作用的研究.......谢鹏，等（4）：773缺血再灌注诱导PC12细胞发生细胞损伤的分子研究......................谢鹏，等（4）：372SD乳鼠原代心脏成纤维细胞培养及鉴定.................................杨艳，等（4）：447心血管发育相关基因mpx在斑马鱼早期胚胎发育中的表达..............向文碧，等（5）：526Lele-5p对变应性鼻炎小鼠Treg/Thl7细胞失衡的影响....................闫智永等（5）:544hUMSCs向胰岛前体细胞诱导分化过程中Notchl和神经元素3的表达.....韩晶，等（7）:773海马神经元原代细胞培养方法的改良...................................高超，等（8）：894胶原诱导性关节炎小鼠脾脏树突状细胞的检测及意义..................范友羊，等（9）：993GSKC B抑制剂对类风湿性关节炎小鼠脾脏树突状细胞亚群的影响.......范友羊，等（9）：997大鼠/3-arresPn2基因过表达慢病毒载体的构建与鉴定..................陈思思，等（9）：1925/TMK-M基因SNP位点01821777多态性与成人支气管哮喘的相关性.....何志伟，等（9）：1933CYP3A4和CYP1A2及CYP2E3快速免疫印迹检测方法的建立何俊奇，等（19）：1117CYP462蛋白在HepG2细胞与小鼠原代肝细胞中的表达差异李靖，等（12）：1123羊耳菊含药血清对大鼠肝细胞色素P450酶表达的影响..................杨畅，等（（2）：1128羊耳菊活性部位对PXR高表达HepG2细胞中CYP3A4蛋白表达的影响……杨畅，等（（2）：1137桔梗皂苷D对MH7A细胞增殖和凋亡的影响及机制....................王菊，等（（2）：1149肿瘤酸性微环境对未成熟树突状细胞迁移能力和F-actin表达的影响.....邱炜，等（（1）：1246亚砷酸钠诱导SH-2Y6Y细胞凋亡及硫化氢的干预作用................潘际刚，等（11）：1255外源性硫化氢对氟诱导损伤SH-2Y5Y细胞的作用及机制..............潘际刚，等（11）：1226MST过表达及亚砷酸钠对SH-2Y5Y细胞的影响......................潘际刚，等（11）:1225miR-212介导的BO-2下调促进动脉粥样硬化内皮细胞凋亡的机制.......任丽，等（11）：1322复方灯盏花滴丸对H2O2致PC12神经细胞氧化应激损伤的影响.......楚丽丽，等（（1）:1312钙结合蛋白S102A4调节小鼠骨髓源肥大细胞活化的作用..............吴通前，等（12）：1365钙结合蛋白S102A4对鸡卵清白蛋白诱导的免疫应答作用..............吴通前，等（（2）：1371PI3K信号通路的关键信号分子AKT和mTOR在胶质瘤中的表达及意义................................................................吴国敏，等（12）：1442妇产科外周血Hb及PLGF和PI联合检测对早发型子痫前期孕妇再妊娠的诊断价值......................................................................王茜，等（1）:67个体化医学营养疗法对妊娠期糖尿病初产妇剖宫产术后糖脂代谢的影响……王晓琴，等（1）:72产妇血清ACA和抗B2-GP1抗体与不良妊娠结局的相关分析................崔佳，等（1）:87醋酸亮丙瑞林对子宫内膜异位症患者VEGF和CEA及CA125水平的影响……孟侠，等（1）：97宫颈上皮内瘤变患者手术后疾病复发的主要危险因素分析................张艳，等（1）:113不同浓度地氟醚对妇科手术患者心电图QTc、QTd、QTcd、Tp-e和Tp-e与QT比值的影响..................................................................刘艳秋，等（2）:214血清维生素A及维生素E水平与孕期子痫前期的相关性..................邵炅，等（5）:534人绒毛膜促性激素B亚基和游离雌三醇水平对妊娠并发症和妊娠结局的预测作用..................................................................胡诗婉，等（5）:660围产期孕妇抑郁与血清雌激素和脱氢表雄酮水平的相关性..............郭洵溢，等（6）：770反向添加疗法启动时机对卵巢子宫内膜异位囊肿术后GnRHa治疗患者围绝经期症状及骨代谢的影响..............................................................杨雅琴，等（7）：827孕期母体补充益生菌及分娩方式对新生儿胆红素代谢的影响李文平，等（8）：967VOSAC患者血清和腹腔积液中IL9、IL-8、MMP-2和MMP-9水平与临床病理分期及预后的关系....................................................................高翠红，等（8）：983妊娠期糖尿病的危险因素及营养干预效果...............................杨蓓，等（9）：1042正常妊娠孕妇不同孕期白细胞参数区间的建立......................赵丹青，等（10）：1137子痫前期孕妇血清sFlt-1和PLGF及IGF-1的相关性..................周金年，等（（1）:1333呼吸系统疾病干细胞研究血清抗苗勒管激素和促卵泡激素水平在多囊卵巢综合征诊断中的价值……张静华，等（11）1337子痫前期患者胎盘组织中sFlt-1、PLGF及IGF-1的表达和临床意义.......文芳，等（（2）：1433H不同类型肺炎患儿血清hs-CRP和PCT及部分外周血T细胞免疫指标的变化....................................................................范芸，等（）：48外周血SAA、NLR及BNP对COPD合并肺部感染患者预后的评估价值……王月平，等（5）:579呼吸机相关性肺损伤小鼠血清EMPs和NGAL的变化及意义..............何丙寅，等（6）：638特发性肺纤维化患者病情程度与血清TGF-B1、STAT1水平的相关性.....冯银合，等（7）:864不同类型肺结核患者血浆miR-155和SOCS1表达及临床意义..............吕芳，等（8）：987贵州兴仁某镇燃煤型砷中毒病区呼吸系统疾病年门诊人次的现况.......阮璇，等（（0）：1176老年急性脑岀血并发相关性肺炎的危险因素分析及风险预测模型的建立…吴倩，等（（0）：⑵9反复呼吸道感染患儿维生素A、D、E水平及免疫功能指标的相关性.....贺媛媛，等（（1）：1347GSeipin敲低大鼠PC12细胞株的构建和对细胞凋亡的影响..................吕菊，等（3）:246 Seipin敲低对内质网应激通路诱导细胞凋亡的影响........................吕菊，等（3）:255骨科学大鼠骨髓源内皮祖细胞的分离与鉴定............Nganguem Nzalle Yranney Brice，等（3）:265自体脂肪基质细胞组织-脱细胞骨基质-壳聚糖支架对兔胫骨骨缺损修复作用......................................................................杨鹏，等（1）:29腹直肌外侧入路与骼腹股沟入路治疗髋臼骨折的临床疗效................徐静，等（2）:224混合现实技术在人工股骨头置换中的应用初探........................周玉虎，等（6）：694微创手术对脊柱创伤患者围术期指标、脊柱功能及术后并发症的影响.......何睿，等（7）：844 CBT螺钉椎间融合术治疗骨质疏松并滑脱患者的临床效果................王含，等（9）：1088煅烧骨与羧甲基壳聚糖复合材料修复家兔下颌骨缺损的成骨效果廖健，等（10）6156Ilizarov技术治疗骨软骨瘤继发前臂畸形患者的效果吕秉乐，等（1）：1232TESSYS术对腰椎间盘突岀症患者的疗效、腰椎结构参数及运动功能的影响..................................................................张钺，等（12）：1474J检验科液基薄层细胞制片技术联合细胞DNA定量分析对良恶性胸腹水患者的诊断价值....................................................................李楣，等（5）:612中性粒细胞和淋巴细胞比值对克罗恩病的预测价值..................姚芳兰，等（12）：1449教学法研究对分课堂教学法在妇产科临床技能教学中的应用效果...................杨涵琳，等（1）:122《精神病学》CBL改良教学模式的探讨.................................朱祥路，等（6）：746K口腔科贵州省西部燃煤型地氟病区成年人氟斑牙与BMI状况分析.................喻艳琴，等（（）2电动牙刷与手动牙刷对牙菌斑的控制效果...............................李蕙兰，等（1）:78口腔鳞状细胞癌组织CIRP和TLR4蛋白表达与患者临床病理特征及预后的关系....................................................................张琳梅，等（1）:91两种矫治技术对安氏I类错胎畸形患者口腔颌面部软硬组织的影响.....尹雪莲，等（6）：712瓷层厚度对全瓷修复体颜色稳定性及强度的影响........................张丹，等（7）：811昆虫生物学弓形虫SSG1-GRA1复合基因真核表达重组质粒的构建与表达............綦廷娜，等（3）：286M麻醉学硬膜外阻滞麻醉和全身麻醉对术后老年患者血清SY00B蛋白水平及认知功能的影响....................................................................蒋敢，等（6）:722舒芬太尼对关节镜下跟骨骨折复位固定术后镇痛和谵妄的影响.......张玉芬，等（（2）：1455免疫性疾病胸腺肽a1联合血必净对脓毒症患者免疫功能和炎症水平的影响..........詹燕春，等（1）:122 Notch信号途径对过敏性鼻炎小鼠Treg/Thl7细胞免疫失衡调节的机制……廖东，等（（0）：1176N脑夕卜科颅内压监测指导甘露醇应用对开颅术后患者临床效果的影响.............吴然，等（（0）：1231内分泌系统糖通饮对2型糖尿病大鼠胰腺组织PI3K-YKT通路的影响...................马欢，等（1）:50二甲双胍联合格列美脲或卡格列净对糖尿病患者胰岛功能的影响.......阮园，等（（3）:1363自体富血小板凝胶治疗难治性糖尿病足溃疡的疗效和机制..............胡丽，等（（2）：1294P皮肤科点阵双极射频联合透明质酸凝胶敷料治疗座疮凹陷性瘢痕的临床观察……汪凯凡，等（4）：479乳腺外科神经精神疾病526例丹毒患者复发的相关危险因素分析............................赵志国，等（（3）:1367R股深动脉穿支皮瓣与游离腹部皮瓣在乳房重建中的临床效果............房霜，等（（3）:1371S血液生化指标主成分回归模型用于脑梗死患者CISS分型................潘能毅，等（2）：237雷帕霉素改善血管性痴呆小鼠认知功能的机制..........................陈丽，等（3）：292核酸内切酶G在帕金森病大鼠脑组织中的表达及意义....................武林，等（4）：377前庭性偏头痛患者的前庭功能变化及特点分析........................祁晓媛，等（7）：854血压监测及降压干预对急性脑梗死静脉溶栓患者预后的影响............盘爱花，等（9）：1972百适可联合心理治疗对脑卒中患者心理健康和生活质量的影响.......李润霞，等（12）：1272丁苯酞联合阿替普酶静脉溶栓治疗对急性脑梗死患者神经功能和日常生活能力的影响肾内科..................................................................吕虎，等（（2）：1284 IgA型PIGN患者的肾组织病理学特点和治疗效果及预后................郭永力，等（3）:356血清Cys-C和NT-proBNP对维持性血液透析患者心血管事件发生的影响…牛世慧，等（3）:363血管性血友病因子在感染性关节炎发生发展中的作用..................胡智成，等（4）：336糖尿病小鼠肾组织中细胞焦亡发生的现象研究........................周兴艳，等（4）：492连续性肾脏替代治疗对脓毒症患者外周血部分T淋巴细胞、miRNAP55和miRNAP66表达的影响................................................................郑燕玲，等（4）451超声剪切波组织定量技术在IgA肾病牛津分型中的应用..................谢青，等（5）：539脯氨酰羧基肽酶和血管紧张素转化酶2在IgA肾病中的表达及其病理意义..................................................................徐晋徉，等（5）：589高通量血液透析治疗维持血透终末期肾病患者的临床效果..............加妮娅，等（9）:1137 mTOR非依赖途径介导二甲双胍对类风湿关节炎大鼠心血管损伤的作用及机制李培霆，等（（9）:1123训生理学990MHz微波辐射不同时点暴露对雄性大鼠血浆激素水平昼夜节律的影响…赵华，等（2）：156生殖医学卫生统计学微生物学消化系统疾病大鼠头皮组织形态和生物力学参数的增龄性变化......................李明杰，等（4）：402辅助生殖技术中超促排卵对PCOS患者AMH水平及妊娠率的影响.......陈丽萍，等（7）：849饮酒对不育男性精液质量的影响...................................申雪慧子，等（9）4067W贵阳市高校贫困学生受网络欺凌现况调查.................................吴荣，等（1）:56 2213—2210年贵州省基层医疗卫生机构现状..........................季诚杰，等（2）：184贵阳市居民对环境建设的主观评价及与生命质量的关系................姜云芳，等（2）489贵州省41个公立非营利性健康管理（体检）机构资源与运营情况............操植，等（2）：205温泉泡浴对亚健康人群肥胖、血压及心率的改善作用....................杨成鹏，等（5）452 2034例大学生BMI与身体素质指标的相关性..........................林梦娴，等（5）:569贵阳市某社区中老年女性体质量指数和腰围与慢性肾脏病的相关性.....文小芳，等（6）:276认知-行为干预对颞下颌关节紊乱患者的干预效果..................刘知音，等（（0）4022 1056名孕妇新型冠状病毒肺炎的知识、态度及行为调查..............赵丹青，等（（1）4307贵阳市云岩区免疫接种儿童父母乙肝防治知识、态度及行为的现状调查……王雯，等（（2）4446住院患儿血标本中病原菌的分布特点及耐药性分析....................曹慧军，等（6）:565粪便菌群移植通过调节Thl7/Treg平衡发挥对帕金森小鼠的保护作用.......叶明，等（8）：914姜黄药渣真菌分离方法的改良及真菌多样性分析......................兰咏哲，等（9）4004贵州关岭余甘子内生真菌多样性及其抗菌抗氧化活性..................兰咏哲，等（9）4009头花蓼内生真菌Diaponhe SF-代谢产物中的抗菌活性成分研究..........徐国波，等（9）4022 233例新生儿脓毒血症患儿的病原菌分布及耐药性分析..................胡扬，等（9）4102 29种中药提取物对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的体外抑菌活性..........孙广，等（10）4132X双歧杆菌三联活菌胶囊联合四联疗法对Hp阳性慢性浅表性胃炎炎症-氧化应激水平的影响....................................................................翟琦，等（2）:229改良双孔腹腔镜阑尾切除术对急性阑尾炎患者血清疼痛应激指标及ICAM-1.MMP-9的影响................................................................陶新光，等（1）4375大蒜素通过TLR4/NF-CB途径对慢性腹泻大鼠肠黏膜修复和炎性因子的调节作用................................................................赖雁威，等（（2）4442K高通量测序分析六味地黄汤对肝肾阴虚型妊娠期便秘患者肠道菌群的影响心理学..................................................................周平，等((2)：1243 3383名中学生自我效能感及应对方式的关系..........................李梦然，等(2):134共情能力对医患双方医患关系评价的影响............................黄列玉，等(2)：220 297例二胎孕妇抑郁情绪及影响因素...................................杨红梅，等(2)：219颞下颌关节紊乱患者焦虑和心理压力与应对方式的相关性研究..........刘知音，等(3)：333焦虑抑郁对急性心肌梗死PCI术后患者hs-CRP、hs-cTnT、住院时间及近期预后的影响..................................................................杜书敏，等(7)：813多导睡眠图监测青少年抑郁症患者抑郁情绪及睡眠障碍的效果..........林冬梅，等(8)：973高龄孕产妇心理健康状况与社会支持和应对方式的相关性................姚瑞，等(9)：1951贵州部分中学生心理虐待和攻击性行为的相关分析....................秦倩，等(12)：1293心血管系统疾病血液系统疾病PCI术后非ST段抬高型急性冠脉综合征患者再发不良心血管事件的危险因素分析..................................................................李云鸿，等(5):573慢性心力衰竭合并肺部感染患者心肌酶谱4项及炎症因子水平变化.....徐立彦，等(5)：611多支病变稳定性冠心病患者的临床特点及PCI术后的远期预后............王欢，等(8)：973不同年龄急性心肌梗死患者经皮冠状动脉介入治疗后的临床特点及预后..................................................................戚德青，等(9)：1982 ADAMTS13在动脉粥样硬化中的作用.................................李华，等(12)：1866血液病患儿医院感染的临床特点和病原学特征及药敏结果分析..........张盼盼，等(3)：332凝血与纤溶标志物联合检测对早期诊断重症感染引发弥散性血管内凝血的价值....................................................................王猛，等(7):822 ET和PV患者的临床特征及血栓和岀血并发症分析......................肖捷，等(8):943血栓通注射液辅助治疗PILC置管并发上肢深静脉血栓的效果及对凝血纤溶系统的影响..................................................................杨西，等(13):1341药理学Y心脉通胶囊对高血脂大鼠的降脂作用...................................付凌云，等(3):35丹防胶囊对小鼠非酒精性脂肪性肝纤维化的干预效果及作用机制............李璨，等(3):61丹夏降压颗粒对自发性高血压大鼠收缩压及左心室肥厚的影响............王艳炜，等(3):83消痛灵喷雾剂的工艺优化及对小鼠的抗炎镇痛作用梁语嫣，等(2)：174X通痹方热敷对颈椎病家兔颈部痛阈和椎间盘退变的影响徐银琴，等(3)：298解毒愈溃汤联合曲安奈德对糜烂型口腔扁平苔藓的治疗效果..............王蕊，等(3)：332西格列汀与二甲双胍对新诊断2型糖尿病患者胰岛B细胞功能的影响……王艳燕，等(3):340莫西沙星对老年CAP患者肺功能及血清CRP、PCT、sTREMY水平的影响…陈晓红，等(4):477七氟烷与丙泊酚对老年大鼠认知功能的影响及机制....................郑仲磊，等(5):561螺内酯联合贝那普利对心力衰竭患者治疗效果及机制..................李璐娜，等(5)：665橙皮素对PDGFYB诱导的大鼠原代胸主动脉VSMCs表型转化的影响.....李晓杰，等(7)：745橙皮素对高脂血症仓鼠的降脂作用和肝脂肪变性的影响..................覃瑛，等(7)：752橙皮素对仓鼠颈动脉粥样硬化和脂质代谢的作用机制....................覃瑛，等(7)：766良附滴丸抗大鼠乙醇型胃溃疡预防作用及机制..........................潘洁，等(7)：727灵芝三萜类化合物对砷中毒大鼠海马组织形态学及脑组织中AChE和ChAT含量的影响....................................................................张癑，等(7)：781红花黄色素注射液对不稳定型心绞痛患者部分氧化应激和炎性因子水平的影响....................................................................刘俊，等(7)：792左烘诺孕酮宫内缓释系统联合米非司酮对子宫内膜异位症的治疗效果……罗国英，等(7)：839依诺肝素联合华法林对中低危急性肺栓塞的疗效及预后的危险因素分析…朱德才，等(8):933BS332与AR355两种吸附柱对高胆红素血症重症患者的治疗效果..........夏云松，等(8):952骨康胶囊及其组分酢浆草及芭蕉根对大鼠软组织损伤的治疗作用..........李靖，等(9)：1213泻肺利水合剂对慢性心衰大鼠心肌氧化应激和线粒体自噬的影响..........李超，等(9)：1232有柄石韦对小鼠皮肤伤口愈合及转化生长因子Y1水平的影响..........吴遵秋，等(11)：1270吉祥草水提物对小鼠慢性阻塞性肺疾病的作用和机制................陈剑波，等(12)：1412药学贵州产灯盏细辛组织培养快速繁殖体系的建立...........................张洁，等(3)：312玉叶金花质量控制研究...............................................秦兰，等(4)：408贵州省9批不同产地盾叶秋海棠药材中铅、镉、砷、汞及铜的测定..........李小双，等(6)：633川参通注射液中总酚酸、总黄酮及单糖大类成分的含量测定................何峰，等(6)：668凝胶色谱净化高效液相色谱法测定天然维生素E中苯并芘残留量..........田广，等(6)：684ICG磁性PLGA纳米粒的制备及其在小鼠体内的脑靶向作用................杨畅，等(8)：887梧桐子挥发油的气相色谱-质谱分析.................................李林珍，等(8):994三七花药材质量控制方法的建立...................................朱晓青，等(12)：1329眼科不同构型吉法酯对干眼症大鼠角膜的保护作用糜玲，等(1):45基于深度学习的视网膜病变眼底图视盘自动定位与分割研究杨帆，等（4）：236吉法酯保护干眼症大鼠的机制研究糜玲，等（6）:246ILL Master和Accan在白内障合并黄斑病变中的应用比较影像学唐丽，等（9）4061胃肠超声造影在功能性消化不良中的诊断价值喻萍一，等（2）：233左心室声学造影评估房颤患者左室收缩功能的临床价值张琳埜，等（8）：963经盆底超声测量膀胱颈活动度与绝经期妇女压力性尿失禁的相关性徐翠芳，等（9）4097医学遗传学中医中药心脏电影磁共振对慢性心肌梗死的诊断价值应晓燕，等（（0）4196 PROX1-AS1和PRICKLE2-AS1基因多态性与中国汉族人群2型糖尿病的相关性陶文玉，等（2）469 MTHFR基因rsl800133位点多态性与贵州苗族和布依族及汉族人群原发性高血压的关系喻艳琴，等（3）:276 Hey水平无明显差异的H型高血压患者MTHFR C677T基因多态性与脑卒中的相关性VPS13A基因突变致舞蹈病-棘红细胞增多症的诊断及家系研究云南省汉族人群LMP基因多态性与结核病易感性的关联性研究趋化因子受体5A33突变在中国22个民族群体中的分布卢宏艳，等（3）:231姚念廷，等（3）:876刘楠楠，等（5）：510陶玉芬，等（5）：522凝血因子口G20210A、V G1091A及吨R353Q基因多态性与上海汉族人群急性脑梗死的相关性岳孟孟，等（7）:797Z五段拔伸推拿法联合中药热敷治疗腰椎间盘突岀症史珊怡，等（2）:228通痹方热奄包外敷对家兔退变颈椎间盘细胞凋亡相关基因Cpppe-3和Bcl-A mRNA的影响徐银琴，等（4）:438自拟中药汤剂联合百令胶囊对慢性肾脏病大鼠肾脏炎症及P38MAPK信号通路的影响郭亚平，等（4）:444苗药“杆努尽烟”对慢性支气管炎大鼠TLR4-MyD88-NFcB信号通路的影响..................................................................吴宁，等（11）:1283。
G418筛选稳定表达细胞株精要总结
G418筛选稳定表达细胞系总结一分析转化的功能和表达需要DNA稳定转染至宿主细胞染色体。
外源基因进入细胞后，部分能够通过细胞质进入细胞核内，根据细胞类型，至多80％的进入核内的外源DNA得到瞬时表达。
极少数情况下，进入细胞的外源DNA通过系列非同源性分子间重组核连接，形成巨大的***结构最终整合进细胞染色体。
细胞基因组自由部分表达，所以整合并不一定意味着表达，只有整合到表达区的基因才会表达，而且整合到不同的染色体区段的外源基因的表达的量也是不同的。
由于摄取、整合、表达外源基因是小概率事件，通常根据新表型筛选稳定转染体。
一般情况下这种新表型由共转染的编码抗生素抗性基因提供。
细菌Tn5转座子序列（neo抗性基因）携带的氨基糖苷磷酸转移酶可以将G418转变成无毒形式。
G418是一种氨基糖类抗生素，其结构与新霉素、庆大霉素、卡那霉素相似，它通过影响80S核糖体功能而阻断蛋白质合成,对原核和真核等细胞都有毒性 ,包括细菌、酵母、植物和哺乳动物细胞 ,也包括原生动物和蠕虫。
是稳定转染最常用的选择试剂。
当neo基因被整合进真核细胞基因组合适的地方后 ,则能启动neo基因编码的序列转录为mRNA,从而获得抗性产物氨基糖苷磷酸转移酶的高效表达 ,使细胞获得抗性而能在含有Ｇ418的选择性培养基中生长。
Ｇ418的这一选择特性 ,已在基因转移、基因敲除、抗性筛选以及转基因动物等方面得以广泛应用。
在进行转染时细胞膜受到影响，抗生素可能对细胞产生较大影响，加上G418有杀菌作用，所以有人主张转让时不加其它抗生素。
其实G418本身有很好的杀菌效果，在用G418进行筛选的过程中很少会发生污染。
但有一点，其实我觉得问题也不是很大，那就是：在老外的一本实验手册中提到，在脂质体转染时所用培养基中最好不加任何抗生素。
我想他的想法可能是脂质体对细胞膜有影响，可能此时加抗生素对细胞损伤较大。
因为庆大霉素、链霉素、G418均是氨基糖甙类药物，其药理作用完全一样。
稳定过表达p50基因细胞株的构建及鉴定
中的作用奠定基础 。方法 结果
将构建的 ｐ ｅ００质粒稳定转 染至 Ｅ Ｖ ０ 细胞 ， Ｒ一 ５ Ｃ３ 通过 间接免疫荧 光染色和免 疫印迹实验 进行鉴定 。 成功建立 了稳定过
经间接免疫 荧光染色和免疫印迹实验验证 ， 稳定过表达 ００基 因的细胞克隆株命名 为 Ｅ Ｖ ００ ５ Ｃ 一 。结论 ５
［ 关键词 ］病毒 ； 管骨架 ； 微 逆行性运输 ； 过表达 ；５ ｐ０ ［ 中图分类号 ］Ｒ ７ ． ３ ３ ３ ３ ［ 文献标识码 ］Ａ ［ 文章编号 ］１７ － ０ （０９ ０ －０ ８０ ６ ２５ ２ ２０ ）２０ ７ － ０ ３
表达 ０ ０基因的细胞克隆株 Ｅ Ｖ ００ 为后续研究积累 了有价值的实验 资料 。 ５ Ｃ一 ， ５
细胞 ， 到达细胞 内的特定 区域 才 能启 动 并 完成 自我 复
ｄｎｃｎ复合 体 的辅 助 ， 相连 形成 的 ｄｎｉ．ｙａ． ｙａｔ ｉ 二者 ｙｅ ｄｎｃ ｎ ｔ ｉ ｎ复合 体在逆 行性 运输 过 程 中起 了关 键 作用 Ｊ ｙ 。ｄ． ｎｅｎ复 合 体 至 少 由 ９种 蛋 白组 成 ， 括 Ａｐ 、５ 、 ａｔ ｉ 包 ｒｌ ｐ０ ａｔ —ａｐｎ ｒｔｎ等 ， 文 献 报 道 过 量 表 达 ｐ０ ｃｉ ｃｐｉｇｐｏ ｉ ｎ ｅ 有 ５ 将会使 ｄｎｉ．ｙａｔ ｙｅ ｄｎｃｉ 合 体 的功 能 受 到影 响 ， 而 ｎ ｎ复 进
ｐ ｒ ｏ ｎ ｕ ｉ ｓ ｏｔ ｆ Ｄｅ ｇ ｅｖ ｒ ．Ｍ ｅ ｈ ｄ ＥＣ ３ ｅｌ ｅ ｅｓａ ｌ ｒｎ ｆｃｅ ｙｐ ｅ ｐ ０．Ｔ ｅ ｈ ｔｂ ｅｐ ０ ｇ ｎ ｖ ｒ ｘ ｒ ｓ ｉｎ ｃ ｌ ｅ ｅｃ ｎ ｕ ｔｏ ｓ Ｖ ０ ｃ ｌ ｗ ｒ ｔｂ ｅｔ ｓ ｔｄ ｂ Ｒ — ５ ｓ ａ ｅ ｈ ｎ ｔ ｅ ｓ ｌ ５ ｅ ｅｏ ｅ ｅ ｐ ｅ ｓｏ ｅ ｌ ｗ ｒ ｏ — ａ ｓ ｉ ｆ ｍｅ ｙ ｗ ｓｅ ｌｔ ｎ ｄｒ ｃ ｍｍｕ ｏ ｕ ｒ ｓ ｅ ｃ ｓ ａ ．Ｒｅ ｕ ｔ Ｔ ｅ ｓａ ｌ ５ ｅ ｅ ｏ ｅ ｅ ｐ ｅ ｓｏ ｅｌ ｗ ｒ ｅｅ ｔｄ ａ ｄ ｉｅ ｔ ｒ ｄ ｂ ｅ ｔ ｒ ｂｏ ｄ ｉ ｉ ｔｉ ｎ ａ ｎ ｅ ｎｆ ｏｅｃ ｎ ｅａｓｙ ｌ ｓｌ ｓ ｈ ｔ ｂｅ ｐ ０ ｇ ｎ ｖ ｒ ｘ ｒ ｓ ｉｎ ｃ ｌ ｅ ｅ ｓ ｌｃｅ ｎ ｄ ｎ ｉ ｓ －
构建稳定的敲除和过表达的方法
构建稳定的敲除和过表达的方法
在生物学研究中，稳定的敲除和过表达是常用的实验方法，用于研究基因的功能和影响。
通过敲除或过表达特定基因，研究人员可以揭示该基因在生物体内的作用和相互关系。
然而，要确保实验结果的准确性和可靠性，需要采用稳定的敲除和过表达方法。
下面将介绍一些构建稳定的敲除和过表达的方法。
1. 选择合适的载体，在进行敲除和过表达实验时，选择合适的载体是非常重要的。
常用的载体包括质粒、病毒载体和转基因动植物。
选择合适的载体可以确保基因的稳定表达和传递。
2. 优化转染条件，对于细胞实验，优化转染条件可以提高敲除和过表达的效率。
包括转染试剂的选择、转染时间和细胞密度等因素。
3. 使用适当的筛选方法，在进行敲除实验时，需要使用适当的筛选方法来筛选出敲除目标基因的细胞系。
常用的筛选方法包括抗生素筛选和基因编辑技术。
4. 确定稳定的过表达细胞系，在进行过表达实验时，需要确保
过表达基因的稳定性和可靠性。
可以通过PCR、Western blot等方法来鉴定过表达细胞系。
5. 确保实验重复性，为了确保实验结果的可靠性，需要进行多次重复实验，并对实验结果进行统计分析。
总之，构建稳定的敲除和过表达的方法是生物学研究中非常重要的一步。
通过选择合适的载体、优化转染条件、使用适当的筛选方法和确保实验重复性，可以确保敲除和过表达实验的准确性和可靠性，为研究人员揭示基因功能和相互关系提供可靠的实验手段。
稳定表达GFP-LC3蛋白的THP-1细胞系的构建
稳定表达GFP-LC3蛋白的THP-1细胞系的构建雷蕾;黄珊;于明航;刘志强;刘师伟;李婷;赵秀娟;李泽兴;王玺【摘要】目的构建稳定表达GFP-LC3的人急性单核细胞白血病细胞(THP-1).方法采用pCDH-CMV-GFP-LC3-EF1α-puro转染293T细胞构建慢病毒质粒系统,获取的慢病毒感染THP-1细胞,用嘌呤霉素(Puromycin)筛选稳定表达GFP-LC3蛋白的细胞系.通过Western blot和流式细胞术检测THP-1细胞中GFP-LC3蛋白的表达,并利用该稳定表达细胞系观察饥饿和雷帕霉素诱导时细胞发生的自噬变化.结果筛选得到稳定表达GFP-LC3蛋白的THP-1细胞系,在倒置荧光显微镜下观察可见绿色荧光.Western blot和流式细胞术检测证实了GFP-LC3融合蛋白的表达.激光共聚焦法和Western blot均证实饥饿和雷帕霉素可以诱导自噬的发生,且GFP-LC3融合蛋白可以反映内源LC3蛋白的变化,包括蛋白聚集和发生剪切修饰.结论应用慢病毒质粒系统成功构建了高效稳定表达GFP-LC3蛋白的THP-1细胞系,从而为后续利用GFP-LC3融合蛋白研究自噬变化提供了细胞模型.【期刊名称】《天津医药》【年(卷),期】2018(046)004【总页数】4页(P341-344)【关键词】自噬;GFP-LC3;THP-1细胞;稳定细胞系;雷帕霉素【作者】雷蕾;黄珊;于明航;刘志强;刘师伟;李婷;赵秀娟;李泽兴;王玺【作者单位】天津医科大学基础医学院细胞生物学系 300070;天津医科大学基础医学院细胞生物学系 300070;天津医科大学基础医学院细胞生物学系 300070;天津中医药大学中西医结合学院组织胚胎学教研室;天津市津南区咸水沽医院内科;天津医科大学基础医学院细胞生物学系 300070;天津医科大学基础医学院细胞生物学系 300070;天津医科大学基础医学院细胞生物学系 300070;天津医科大学基础医学院细胞生物学系 300070【正文语种】中文【中图分类】R392.1自噬是真核生物的应激调控机制，通过循环利用细胞自身的一些细胞器、蛋白质等生物大分子来满足细胞的代谢更新和细胞内稳态维持。
CD47重组质粒及其过表达大鼠骨髓间充质干细胞的构建及鉴定的开题报告
CD47重组质粒及其过表达大鼠骨髓间充质干细胞的构建及鉴定的开题报告一、选题背景骨髓间充质干细胞（BMSCs）是一种具有自我更新和多向分化能力的细胞，可以分化为骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞等成分。
近年来，BMSCs在组织工程、再生医学和基础研究中得到广泛应用。
然而，BMSCs在移植过程中存在一些限制，如免疫排斥、低存活率和缺乏持续增殖能力等问题。
CD47是一种跨膜蛋白，广泛表达于各种细胞中，包括BMSCs。
研究表明，CD47可以抑制免疫系统的吞噬作用，并促进干细胞的增殖和存活。
因此，过表达CD47可能有助于提高BMSCs的移植效果和存活率。
二、研究目的本研究旨在构建CD47重组质粒，通过转染的方式过表达CD47基因，并鉴定其对BMSCs生物学特性的影响。
三、研究内容及方法（1）构建CD47重组质粒选择pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP载体作为基本质粒，将CD47基因克隆进入该质粒中，构建CD47重组质粒。
（2）过表达CD47基因将构建好的CD47重组质粒转染到BMSCs中，通过Western blot和Real-time PCR等方法鉴定CD47表达水平。
（3）评估CD47对BMSCs生物学特性的影响评估CD47过表达对BMSCs增殖、存活和分化的影响。
四、研究意义本研究有望通过过表达CD47基因，提高BMSCs的移植效果和存活率，为组织工程和临床转化研究提供有益的参考。
五、预期结果预计构建成功CD47重组质粒，通过转染的方式实现CD47基因过表达，并评估CD47对BMSCs生物学特性的影响，为深入探究CD47在干细胞生物学中的作用提供基础。
构建过表达细胞株方法
构建过表达细胞株方法在分子生物学领域中，细胞株构建是一项重要的研究技术，它可以使我们得到某一特定蛋白质的高表达。
这时，过表达细胞株就成了一种不可或缺的工具，它们具有高效的基因表达系统和丰富的细胞学特征，可以为研究者提供丰富、多样的开发平台。
在这篇文章中，我们将探讨如何构建过表达细胞株的方法。
一、构建过表达细胞株的意义过表达细胞株是指为了获得较高的特定蛋白表达水平而构建的细胞株。
它可以为科学家提供高效、精确的基因表达系统，为蛋白质学、生物化学及其它生物研究领域中的科学研究提供了有力支持。
不仅如此，过表达细胞株还可提供大量纯化目标蛋白所需的材料，因此，其价值不言而喻。
二、构建过表达细胞株的方法1、选择合适的表达载体在构建过表达细胞株时，选择合适的表达载体是最关键的一步。
广泛应用的表达载体有质粒、病毒、以及诱导可控性的表达系统，科学家们可以根据研究目的及所需表达的蛋白质的特点来选择合适的表达载体。
2、构建重组表达载体构建表达载体的过程主要有：逆转录RNA、PCR扩增、酶切、连接、Ligation 和转化细胞等环节。
构建重组载体的目的是将所需表达的基因片段与表达载体上的启动子和调控元件连接在一起，以此促进基因的表达。
3、转染细胞转染细胞是将构建好的重组载体导入到靶细胞中的过程，主要有化学法转染、电转染、病毒法转染等转染方法。
其中，化学法转染是最为广泛应用的一种方法，不但操作简单易行，还免去了病毒的安全风险和成本的限制。
4、筛选细胞经过转染后，细胞库中即可得到含重组载体的细胞群，但其中广泛存在着杂质细胞。
因此，需要对这些细胞进行筛选，以得到高表达蛋白的过表达细胞株。
在筛选过程中，可负责响应细胞毒性和抗生素胁迫，并基于载体的表达量或拷贝数的比较等标准，选择具有高表达水平的细胞。
5、优化过表达的运行条件成功构建过表达细胞株并不意味着高效、稳定的表达，对于不同细胞株、表达载体和特定蛋白质，其具体的过表达条件往往需要进一步的优化和探索。
构建稳定过表达转录辅助因子LBH的人间充质干细胞株
构建稳定过表达转录辅助因子LBH的人间充质干细胞株牛琳;段永娟;王文天;杨洋;赵慧娟;胡晓【期刊名称】《生物技术通讯》【年(卷),期】2016(027)001【摘要】目的:构建转录辅助因子LBH(limb-bud and heart)过表达的人间充质干细胞(MSC)株,研究Lbh基因对人MSC功能的调控.方法:通过分子克隆的方法构建人Lbh基因的慢病毒表达质粒pCDHP-Lbh,经限制性内切酶酶切和核酸测序鉴定,利用293T细胞包装表达Lbh基因的慢病毒及对照;将包装的病毒感染人MSC,利用表达载体携带的GFP报告基因,采用流式细胞术分选GFP阳性目的细胞;通过油红O染色鉴定阳性细胞的成脂分化能力,通过茜素红和硝酸银染色鉴定阳性细胞的成骨分化能力.结果:双酶切和测序结果表明正确克隆了人Lbh基因的全长CDS序列,定量PCR和Western印迹结果表明构建的pCDHP-Lbh重组质粒能够表达Lbh基因;流式分选获得LBH稳定表达的人MSC细胞株,该细胞株经成骨和成脂诱导分化培养后,油红O染色、茜素红染色和硝酸银染色结果均呈阳性.结论:构建了人Lbh基因的慢病毒表达质粒pCDHP-Lbh,并获得稳定表达Lbh基因的人MSC 细胞株,该细胞株保留了向脂肪细胞和成骨细胞定向分化的能力.本研究为进一步探讨Lbh基因对人MSC功能的调控提供了重要的实验基础.【总页数】4页(P40-43)【作者】牛琳;段永娟;王文天;杨洋;赵慧娟;胡晓【作者单位】中国医学科学院北京协和医学院血液学研究所血液病医院,实验血液学国家重点实验室,天津300020;中国医学科学院北京协和医学院血液学研究所血液病医院,实验血液学国家重点实验室,天津300020;中国医学科学院北京协和医学院血液学研究所血液病医院,实验血液学国家重点实验室,天津300020;中国医学科学院北京协和医学院血液学研究所血液病医院,实验血液学国家重点实验室,天津300020;中国医学科学院北京协和医学院血液学研究所血液病医院,实验血液学国家重点实验室,天津300020;中国医学科学院北京协和医学院血液学研究所血液病医院,实验血液学国家重点实验室,天津300020【正文语种】中文【中图分类】Q78【相关文献】1.构建逆转录病毒PBabepuro-Bcl-2表达质粒及稳定转染细胞株 [J], 杜星;付旭锋;张志毕;陈贵元;崔清华2.SOCS1在人骨髓间充质干细胞中的表达以及稳定表达SOCS1间充质干细胞株的建立 [J], 邹瑞丰;谢静仪3.稳表达人HSP72的人脐带间充质干细胞株的构建 [J], 王珍;赵昌林;骆敏翔4.转录因子E2F1及其突变体真核表达质粒的构建及稳定表达细胞株的建立 [J], 安娇;朱长军;王雅洁5.转录因子E2F1及其突变体真核表达质粒的构建及稳定表达细胞株的建立 [J], 安娇;朱长军;王雅洁因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
稳定表达人巨噬细胞集落刺激因子的L929细胞株的建立
稳定表达人巨噬细胞集落刺激因子的L929细胞株的建立陆琤;周晨辰;张鹏飞;张硌;张鹏【期刊名称】《中国医学装备》【年(卷),期】2018(15)11【摘要】目的:建立稳定表达人巨噬细胞集落刺激因子(hMCSF)的L929细胞株,用于体外培养人源巨噬细胞.方法:采用慢病毒感染的方法将载体质粒pCDH-hMCSF-HA导入L929细胞中,通过荧光显微镜观察病毒感染情况,利用免疫印迹实验检测细胞及培养上清中hMCSF的表达.结果:慢病毒感染的方法使L929细胞株能够稳定表达hMCSF,并已稳定传代.结论:采用慢病毒重组系统能够成功建立稳定表达hMCSF的L929细胞株,并高效表达hMCSF,为体外培养人源的巨噬细胞提供高效途径.【总页数】3页(P155-157)【作者】陆琤;周晨辰;张鹏飞;张硌;张鹏【作者单位】解放军第307医院医学工程科北京 100071;解放军第307医院医学工程科北京 100071;解放军第307医院医学工程科北京 100071;解放军第307医院医学工程科北京 100071;解放军第307医院医学工程科北京 100071【正文语种】中文【中图分类】R392.12【相关文献】1.SOCS1在人骨髓间充质干细胞中的表达以及稳定表达SOCS1间充质干细胞株的建立 [J], 邹瑞丰;谢静仪2.人PPARγ2真核表达载体构建及稳定表达细胞株的建立 [J], 代芳;王长江;左祥生;王佑民;胡红琳;汪学龙;沈际佳;曹永红3.人胰岛素样生长因子1真核细胞表达质粒的构建及其稳定表达细胞株的建立 [J], 付长峰;刘一;张绍坤;付士波4.稳定高表达人ERP57基因A549细胞株的建立及其对CRT表达的影响 [J], 杨建林;韩钰;王艳林;张伟5.稳定过表达人源SAMHD1基因细胞株的建立及其抗病毒活性的研究 [J], 武晋英;张洲;李子威;王昊然;操孙润;李宇恒;宋晓宇;曹流因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
POR基因敲除、回补及过表达LO2细胞株的构建及作为AFB_(1)染毒模型的初步应用
POR基因敲除、回补及过表达LO2细胞株的构建及作为AFB_(1)染毒模型的初步应用王琳;袁建林;缪昌;马玉晗;曹三杰;赵勤【期刊名称】《浙江农业学报》【年(卷),期】2024(36)2【摘要】为了构建POR基因稳定敲除(POR^(KO))、回补(PORCO)、过表达(POR^(OE))的LO2细胞株,以便为后续深入开展POR基因在AFB_(1)致毒性机理中的功能研究提供细胞模型。
本研究首先利用CRISPR/Cas9技术设计2条靶向POR基因的sgRNA并克隆至lentiCRISPR v2载体,进行慢病毒包装与感染,筛选出LO2 POR^(KO)单克隆细胞后进行测序及Western blot鉴定。
其次用同源重组方法构建pcDNA3.1(+)/myc-His B-POR重组质粒,经对POR^(KO)细胞和野生型细胞转染分别构建LO2 PORCO及LO2 POR^(OE)细胞株,以G-418筛选后进行Western blotting鉴定。
再用4μmol·L^(-1)及8μmol·L^(-1)AFB_(1)分别对野生型、LO2 POR^(KO)、LO2 PORCO、LO2 POR^(OE)细胞株染毒48 h,观察细胞形态并测定细胞存活率。
结果表明,靶向exon5的sgRNA-2可成功敲除POR 基因,得到LO2 POR^(KO)细胞株;成功构建表达POR重组蛋白的LO2 PORCO及LO2 POR^(OE)细胞株。
对AFB_(1)处理后的各细胞存活率测定结果表明,相较于野生型LO2细胞43.66%±0.58%和27.90%±0.46%的存活率,LO2 POR^(KO)细胞存活率具有极显著性差异,均为100%(P<0.0001);LO2 PORCO细胞存活率仍有显著性差异,分别为57.07%±0.74%和42.54%±0.68%(P<0.05);LO2 POR^(OE)细胞存活率则显著降低,分别为24.58%±0.92%和17.99%±0.81%(P<0.01)。
SIRT3-FOXO1介导自噬在H9C2心肌细胞缺血再灌注损伤中的保护作用
细胞与分子生物学SIRT3-FOXO1介导自噬在H9C2心肌细胞缺血再灌注损伤中的保护作用王尚徐，林先和△摘要：目的探究沉默信息调节因子2相关酶类3（SIRT3）-叉头盒转录因子O1（FOXO1）通路介导自噬在心肌细胞缺血再灌注损伤中的作用。
方法慢病毒感染H9C2心肌细胞构建SIRT3过表达稳定株。
实验分4组：正常对照（NC）组、缺血再灌注（IR）组、SIRT3过表达+缺血再灌注（S+IR）组、SIRT3过表达+IR+SIRT3抑制剂（S+IR+3-TYP）组。
Western blot检测SIRT3、乙酰化FOXO1（Ac-FOXO1）、自噬标记蛋白LC3B、Beclin1及凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax的表达；流式细胞分析仪检测细胞凋亡率；全自动生化仪检测细胞培养上清液中乳酸脱氢酶（LDH）水平。
结果与NC组相比，IR组SIRT3表达降低，Ac-FOXO1表达升高，自噬标记蛋白LC3B、Beclin1表达升高，抗凋亡蛋白Bcl-2表达降低，促凋亡蛋白Bax表达升高，LDH水平和细胞凋亡率升高（P＜0.05）。
与IR组相比较，S+IR组SIRT3表达升高，Ac-FOXO1表达降低，LC3B、Beclin1表达升高，Bcl-2表达升高，Bax表达降低，LDH水平和细胞凋亡率降低（P＜0.05）；加入SIRT3抑制剂3-TYP后，与S+IR组相比，SIRT3表达水平无明显变化，但Ac-FOXO1表达升高，LC3B、Beclin1表达降低，Bcl-2表达降低，Bax表达升高，LDH水平和细胞凋亡率升高（P＜0.05）。
结论SIRT3-FOXO1通路激活可提高H9C2心肌细胞自噬水平，对心肌缺血再灌注损伤有保护作用。
关键词：肌细胞，心脏；再灌注损伤；自噬；细胞凋亡；叉头框蛋白O1；沉默信息调节因子2相关酶类3；H9C2细胞中图分类号：R542.2文献标志码：A DOI：10.11958/20211124The protective effect of SIRT3-FOXO1-mediated autophagy on ischemia-reperfusioninjury of H9C2cellsWANG Shang-xu,LIN Xian-he△Department of Cardiovascular Medicine,the First Affiliated Hospital of Anhui Medical University,Hefei230032,China△Corresponding Author E-mail:******************Abstract:Objective To investigate the role of silent mating type information regulator2homolog3(SIRT3)-forkhead box O1(FOXO1)pathway-mediated autophagy in myocardial ischemia-reperfusion(IR)injury.Methods SIRT3 overexpression stable strain was constructed by lentivirus infection of H9C2cells.The cells were divided into four groups: the normal control(NC)group,the ischemia-reperfusion(IR)group,the SIRT3overexpression+IR(S+IR)group and the SIRT3overexpression+IR+SIRT3inhibitor(S+IR+3-TYP)group.The expressions of SIRT3,Ac-FOXO1,autophagy labeled protein LC3B,Beclin1and apoptotic proteins Bcl-2and Bax were detected by Western blot assay.The apoptosis rate was detected by flow cytometry.The level of lactate dehydrogenase(LDH)in the supernatant of cell culture was determined by automatic biochemical analyzer.Results Compared with the NC group,the expression of SIRT3was decreased,Ac-FOXO1was increased,the expressions of autophagy related proteins Beclin1and LC3B were increased,the expression of anti-apoptotic protein Bcl-2was decreased,the expression of pro-apoptotic protein Bax was increased,LDH release and cell apoptosis rate were increased in the IR group(P＜0.05).Compared with the IR group,the expression of SIRT3increased, Beclin1,LC3B and Bcl-2were increased,the expressions of Ac-FOXO1,pro-apoptotic protein Bax were decreased,LDH release and cell apoptosis rate were decreased in the S+IR group(P＜0.05).After adding SIRT3inhibitor3-TYP,there was no significant change in SIRT3expression compared with that of the S+IR group,but the expression of Ac-FOXO1was increased,the expressions of Beclin1and LC3B were decreased,the expression of anti-apoptotic protein Bcl-2was decreased,the expression of pro-apoptotic protein Bax was increased,LDH release and cell apoptosis rate were increased (P＜0.05).Conclusion The activation of SIRT3-FOXO1pathway can increase autophagy level of H9C2cells,and has a 基金项目：安徽省自然科学基金资助项目（2008085MH239）作者单位：安徽医科大学第一附属医院心血管内科（邮编230032）作者简介：王尚徐（1996），女，硕士在读，主要从事冠心病相关基础和临床研究。
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稳定过表达p50基因细胞株的构建及鉴定（作者:___________单位: ___________邮编: ___________）作者：陈炜，高娜，王嘉丽，张俊磊，田衍平，安静【摘要】目的筛选出稳定过表达p50基因的细胞克隆株ECV p50，为研究dynei n dynactin复合体在登革病毒逆行性运输中的作用奠定基础。
方法将构建的pRe p50质粒稳定转染至ECV304细胞，通过间接免疫荧光染色和免疫印迹实验进行鉴定。
结果经间接免疫荧光染色和免疫印迹实验验证，稳定过表达p50基因的细胞克隆株命名为ECV p50。
结论成功建立了稳定过表达p50基因的细胞克隆株ECV p50，为后续研究积累了有价值的实验资料。
【关键词】病毒；微管骨架；逆行性运输；过表达；p50Abstract: Objective To construct stable p50 gene overexpression cells for studying the role of dynein dynactin in the retrograde transport of Dengue virus. Methods ECV304 cells were stable transfected by pRe p50. Then the stable p50 gene overexpression cells were confirmed by western blot and indirect immunofluorescence assay. Results The stable p50 geneoverexpression cells were selected and identified，named ECV p50. Conclusion The stable p50 gene overexpression cells have been constructed successful, which lays a base for further study on roles of p50 in virus infection.Keywords: virus；microtubules；retrograde transport；overexpression；p50病毒感染宿主细胞必须经过吸附到宿主细胞表面、穿入细胞质或内含体、脱壳、早期病毒蛋白合成、基因组复制、晚期病毒蛋白合成、病毒组装/成熟、释放几个步骤，这实际上是一个病毒与宿主细胞相互作用的过程。
为了有效地感染宿主细胞，病毒必须进入宿主细胞，到达细胞内的特定区域才能启动并完成自我复制。
目前研究证实，病毒主要利用宿主细胞骨架系统或膜运输系统完成其在细胞内的移行。
细胞骨架系统由微丝、微管、中间纤维及其摩托蛋白（motor protein）组成。
当病毒利用微管骨架完成其在细胞内的移行时，运输的动力则来自两类摩托蛋白：胞质动力蛋白（cytoplasmic dynein）和驱动蛋白（kinesin）。
它们分别介导病毒和病毒蛋白从细胞周边向细胞核方向的逆行性运输，以及从细胞中心向细胞周边区域的顺行性运输［1］。
研究显示，多数情况下胞质动力蛋白需要有dynactin复合体的辅助，二者相连形成的dynein dynactin复合体在逆行性运输过程中起了关键作用［2］。
dynactin复合体至少由9种蛋白组成，包括Arp1、p50、actin capping protein等［3］，有文献报道过量表达p50将会使dynein dynactin复合体的功能受到影响，进而影响到病毒的逆行性运输。
登革病毒是否也利用微管骨架在dynein dynactin复合体指导下完成逆行性运输，目前尚未见文献报道。
为了研究dynein dynactin复合体在登革病毒逆行性运输中的作用，本研究将构建的真核表达质粒pRe p50稳定转染至ECV304细胞后，经筛选得到细胞克隆株，为进一步的实验研究奠定工作基础。
1材料与方法1.1实验材料和主要试剂ECV304细胞、真核表达质粒pReceiver M01a和pRe p50由本室保存，转染采用美国Invitrogen公司的Lipofectamine 2000脂质体转染试剂，小鼠抗p50单克隆抗体购自BD公司，羊抗小鼠IgG FITC、小鼠抗βactin单克隆抗体和G418购自美国Sigma公司，辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG抗体购自北京中杉金桥公司。
1.2稳定过表达p50基因细胞株的建立ECV304细胞用含10%新生小牛血清（fatal calf serum，FCS）的DMEM培养基于37 ℃，5%CO2孵箱内培养。
转染前1 d，将对数生长期的ECV304细胞以2×103个/孔接种96孔细胞培养板，于24 h以内、细胞融合达80%～90%时将pReceiver M01a与pRe dyn质粒转染细胞，pReceiver M01a作为对照（根据说明书步骤操作）。
将96孔细胞培养板的1孔细胞传代至6孔细胞培养板的2孔，稀释约150倍，操作时注意避免胰酶过分消化细胞，吹打细胞应轻柔，每孔中加入2 mL含10üS的DMEM，37 ℃孵育48 h，以使细胞表达足够量的抗性酶。
以含1 mg/mL G418和10% FCS的DMEM 2 mL替换6孔细胞培养板中的培养液，进行筛选，时间约为1周，其间以含G418的培养基换液一次。
待镜下观察到有成团的单个细胞克隆生长后，胰酶局部消化，将每个单克隆细胞分别转入24孔细胞培养板培养，仍保持G418筛选压力，但G418浓度降为0.5 mg/mL。
细胞长至70%～80％融合时，传代细胞扩大培养，G418浓度保持0.5 mg/mL。
得到的稳定表达pReceiver M01a与pRe p50质粒的ECV304细胞株，分别命名为ECV pRe和ECV p50。
1.3间接免疫荧光染色将盖玻片置于6孔板中，将ECV304、ECV pRe和ECV p50细胞悬液（2×105个/孔）接种于6孔培养板中的盖玻片上，37 ℃，5%CO2孵育18～24 h。
取出细胞爬片，PBS漂洗2～3遍，4%多聚甲醛室温固定20 min。
PBS漂洗后，0.2%Triton X100/PBS室温通透5 min。
PBS漂洗后，加1%BSA/PBS室温对非特异性位点封闭1 h后加小鼠抗p50单克隆抗体，4 ℃孵育过夜。
PBS漂洗3～5遍，加入FITC标记的羊抗小鼠IgG，室温孵育1 h，漂洗、干燥后40%甘油封片，荧光显微镜下观察，并拍照。
1.4免疫印迹将ECV304、ECV pRe和ECV p50细胞悬液（2×105个/孔）接种于6孔培养板中，37 ℃，5%CO2孵育18～24 h。
PBS洗涤1次，加入2×SDS上样缓冲液50 μL，使用细胞刮子将细胞从6孔细胞培养板底部剥离，吸入1.5 mL离心管中，沸水浴5 min，取15 μL上样电泳，配制10%分离胶，5%积层胶，行SDS PAGE。
电泳结束后，采用半干转印仪，以15 V恒压转印30 min，将凝胶中的蛋白质转移至硝酸纤维素膜（NC膜）上。
NC膜以含5%脱脂奶粉的TTBS室温封闭2 h；参照蛋白Marker的位置，将p50和βactin所在部分的NC膜剪开，分别与p50鼠单抗（工作浓度为1∶250）、鼠抗βactin单抗（工作浓度为1∶2 000）4 ℃反应过夜；辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG（工作浓度为1∶1 000）室温反应1 h；以缓冲液TTBS 洗涤膜3次，每次10 min。
将膜放入显色底物溶液，DAB显色10～30 min，用ddH2O洗膜，终止反应，观察并拍照。
2结果2.1免疫荧光染色经筛选得到的p50过表达的单克隆ECV304细胞株（ECV p50）、空质粒对照细胞株（ECV pRe）及ECV304细胞进行了间接免疫荧光染色，结果显示，与对照ECV pRe和ECV304相比，ECV p50细胞内的特异性荧光明显增强（图1）。
2.2免疫印迹将ECV p50、ECV pRe及ECV304细胞进行了免疫印迹，结果显示，与对照ECV pRe和ECV304相比，ECV p50细胞中的p50蛋白的含量明显增加（图2）。
3讨论病毒具有严格的细胞寄生性，病毒感染宿主细胞，必须经过吸附、穿入/脱壳、大分子生物合成及组装、释放这样一个完整的复制周期。
已知真核细胞中充满的细胞器和由微丝、微管、中间纤维组成的细胞骨架，限制分子量大于500 kD分子的自由扩散，若不借助细胞的运输体系，病毒颗粒难于通过粘滞的、半流体的细胞质到达特定目的地。
因此只有在宿主细胞内某种运输体系的参与下，病毒运动才能保持一定的目的性和方向性。
大量实验证明，病毒颗粒的分布与微管骨架关系密切，病毒利用微管骨架完成其在细胞内的移行。
微管（microtubule，MT）广泛存在于各种真核细胞中，与维持细胞形态、细胞运动、细胞分裂有关。
微管以靠近核周的微管组织中心（microtubule organizing center，MTOC）为“－”端，向外周呈辐射状分布。
研究表明，微管与病毒和病毒蛋白的胞内运输有关［46］，为运输物质提供轨道并对运输方向具有指导作用，而运输的动力则来自作为摩托蛋白的胞质动力蛋白和驱动蛋白。
胞质动力蛋白由2条重链、2条中等链、2条轻中等链和数目可变的轻链组成，ATP和微管结合区域位于重链，而运输货物的特异性与中等链和轻链有关。
胞质动力蛋白介导从细胞周边向细胞中心的逆行性运输，驱动蛋白介导从细胞中心向细胞周边区域的顺行性运输。
近年来，大量研究显示胞质动力蛋白需要有Dynactin复合体的辅助，dynein的中等链与dynactin相结合，形成dynein dynactin复合体，在逆行性运输过程中发挥关键作用。
dynactin复合体至少由9种蛋白组成，p50是dynactin复合体中含量居第2位的亚组分，过量表达p50使dynein dynactin复合体的功能受到影响，进而影响到病毒的逆行性运输。
Suikkanen等［7］的实验显示，过量表达p50使dynein dynactin复合体的功能受到影响，使大量的病毒颗粒不能运输到微管组织中心区域而弥散在细胞质中。
Aspasia Ploubidonz 等［8］在痘苗病毒的研究中亦得到了类似的结果。
登革病毒（dengue viruses，DV）是黄病毒属（Flavivirus）的单股正链RNA病毒，引起人类登革热（classical dengue fever，DF）和登革出血热/登革休克综合征（dengue hemorrhagic fever/dengue shock syndrome，DHF/DSS）［9-11］。