流式细胞仪11-FACSCanto Clinical 四色免洗淋巴细胞亚群的绝对计数

FACSCanto Clinical 四色免洗淋巴细胞亚群的绝对计数

【实验原理】：用已知总数的荧光微球Beads 作标准内参，加入血中，再加入荧光

抗体，应用流式细胞仪中的获取和分析软件，就可以得出血中CD3、CD4，CD8、B 、NK 细胞的绝对数。

【主要试剂】：

（1） 抗体：CD3/CD8/CD45 /CD4；CD3/CD16+56/CD45 /CD19四色

荧光抗体。

（2）Trucount tube （内含数量已知的Beads ）。

（3）FACS Lysing Solution （溶血素）（10×,使用前用蒸馏水稀释成1×）。

【实验步骤】：

1、 取两支TruCount Tube ，编号A 和B ；

2、 用反向加样法在Tube 中加入50ul 充分混匀的抗凝全血，注意血不要碰到试管底部的微球（Beads ）。

3、 取20ul CD3/CD8/CD45/CD4抗体加入到A 管中、取20ul CD3/CD16+56/CD45/CD19标记的抗体加入B 中，注意：不要碰到血。涡旋混匀，室温避光放置15－20min 。

4、 取出加入450ul 1×FACS 溶血素，充分混匀，避光放置15min 。

5、 24小时内上机用FACSCanto Clinical 软件获取2500个淋巴细胞进行检测，上机前应充分混匀。；

【注意事项】：

1、 样本使用EDTA 抗凝全血，室温放置，24小时内处理，处理前充分混匀。

2、 取血时要采用反向加样法，即加样枪吸取血样时，打到第二档，放时打到第一档，保证血量的准确，减少误差。

3、 染色和溶血步骤应在室温避光进行，并充分混匀过程中，尽量防止血样的飞溅，以免血样留在管壁上。

4、 本实验为免洗试剂，操作简单，减少细胞的丢失提高工作效率和计数精确度。

5、TruCOUNT 管2-25°C 保存，从冰箱取出后，应恢复室温再打开封条，保证TruCOUNT 管包装袋密闭，袋内干燥剂变成粉红色时，TruCOUNT 管应弃去不用。

Beads 获取数 × 样本量

获取细胞数 × Beads 总量 细胞(/µl)=

FACSCanto Clinical软件的获取分析的具体操作：

（1）、执行FACSCanto开机程序，在桌面上点击进入FACSCantoClinical软件。

（2）、在出现的“Logging In”窗口中输入用户名及密码，然后点击“Login”。（3）、软件进入“Worklist(工作表)”窗口。

（4）、在“Name”栏中输入患者姓名（可选），在“ID”栏中输入患者ID号（必填），在“Case Number”中输入病例号（可选），点击“Panel”栏，在下拉菜单中选择实验组合如：4color TBNK+TruC；

（5）、如需输入试剂及绝对计数微球批号及数量，可点击菜单栏“Tools”，在下拉菜单中选择“Lot ID”，在弹出的对话框中点击“Absolute Count Beads”标签，在窗口中输入微球批号及微球数量（这些信息均在绝对计数管包装袋上），输入完毕后点击“OK”。

（6）、在窗口最上方的“View”的下拉菜单中，选择“Detectors”、“Spectral

Overlap”、“Threshold”、“Staus”，出现相应的四个窗口。

（7）、然后将第一管样本充分混匀，上样，点击“”，软件出现如下提示框时点击。

（8）、软件显示获取图标，并且出现细胞。如下图：

如图中显示细胞位置不合适，可点击“”，然后再点击“”，即可调整SSC

电压和阈值，调完毕后可点击“”进行数据获取。

（9）、获取完成后，在出现提示后取下样本管。

在把抽吸臂推向左侧的同时握住样本管。

如果在移动抽吸臂时未用手握住试管，则试管有可能从SIT上掉落下

来，你可能会暴露到潜在生物危险样本。

●把试管从SIT中取出来。

●放开抽吸臂。

当抽吸臂到达中心后，SIT进行自动清洗。

（10）、此时显示实验室报告，可点击“Manual Gate”标签人工调整各个门的位置，调整完毕后点击“Continue”。

（11）、软件提示加载下一个样本管。

（12）、此时将第二管样本充分摇匀，上样，点击“OK”，无需进行调节，直接点击“”进行获取，重复（9）、（10）步骤，手动设门完毕后点击“Continue”。（13）、继续其他实验，或点击菜单栏“File”在下拉菜单中选择“Exit”，退出

FACSCanto Clinical软件。

注意：（1）做相对记数时，用普通的流式试管代替TruCount管，在Panel中选择4color TBNK。

（2）FCS格式数据文件保存于“C:\BDFACSCantoFCSFiles\YYYYM MDD”；实验室报告（Lab Report）保存于“C:\Program Files\BD FACSCanto S oftware\LabReportFiles\ YYYYMMDD””路径中可以日后进行重新分析。