大劣按蚊成蚊cDNA文库的构建与质量鉴定
cDNA文库的构建
cDNA文库的构建cDNA文库的构建基因文库的构建是现代生命科学研究中的一项重要技术。
自70年代初首例cDNA克隆问世以来，已用构建和筛选cDNA文库的方法克隆了很多基因。
通过构建cDNA文库能直接分离到生命活动过程中的一些调控基因及了解这些基因所编码的蛋白质的相互作用关系．因此cDNA文库的构建是基因克隆的重要方法之一，从cDNA文库中可以筛选到所需的目的基因，并直接用于该目的基因的表达。
它是发现新基因和研究基因功能的工具。
1.cDNA文库构建的原理真核生物基因的结构和表达控制元件与原核生物有很大的不同。
真核生物的基因是断裂的，在基因最后产物中表达的编码序列（外显子）被非编码序列（内含子）分隔开，需经RNA转录后加工过程才使编码序列拼接在一起。
真核生物的基因不能直接在原核生物中表达，只有将加工成熟的mRNA经逆转录合成互补的DNA （complementary DNA,cDNA）接上原核生物表达控制元件，才能在原核生物中表达。
而且，真核细胞的基因通常只有一小部分进行表达，由于mRNA的不稳定性，对基因表达和有关mRNA都常通过对其cDNA来进行研究。
为分离cDNA克隆或研究细胞的cDNA 谱，需要先构建cDNA文库。
所谓cDNA文库是指细胞全部mRNA逆转录成cDNA并被克隆的总和。
cDNA文库应包含的克隆数目可由以下公式来计算：N=ln(1-p)/ln(1-1/n)式中：N－cDNA文库所包含的克隆数目；P－低丰度cDNA存在于库中的概率，通常要求其大于99％；1/n－每一种低丰度mRNA占总mRNA的分数。
2.构建cDNA文库的基本步骤构建cDNA文库的基本步骤有五步：①制备mRNA；②合成cDNA；③制备载体DNA；④双链cDN 的分子克隆；⑤对构建的cDNA文库进行鉴定，测定文库包含的克隆数，抽查克隆的质量和异质性，如果需要可适当扩增。
对cDNA的文库的要求：一是希望文库能包括各种稀有mRNA的cDNA克隆；二是克隆的cDNA应是全长的，避免丢掉5’端的序列。
大劣按蚊和斯氏按蚊核糖体基因内转录第二间隔区序列分析
ＡＢ Ｓ ＴＲＡＣ Ｔ： Ｔｏ ａ ｎ ａ ｌ ｙ ｓ ｅ ｔ ｈ ｅ ｇ ｅ ｎ ｅ ｔ ｉ ｃ ｃ ｈ ａ ｒ ａ ｃ ｔ ｅ ｒ ｉ ｓ ｔ ｉ ｃ ｓ ｏ ｆ ｔ ｈ ｅ ｓ ｅ ｃ ｏ ｎ ｄ ｉ ｎ ｔ ｅ ｒ ｎ ａ ｌ ｔ ｒ ａ ｎ ｓ ｃ ｒ ｉ ｐ ｔ ｉ ｏ ｎ ｓ ｐ ａ ｃ ｅ ｒ ｏ ｆ ｒ ｉ ｂ ｏ ｓ ｏ ｍａ ｌ ＤＮＡ （ ｒ ＤＮＡ
大 劣按蚊和斯 氏按 蚊核 糖体基 因内 转录第二 间隔区序列分析 ＊
孙 恩涛 ， 张锡 林 ， 秦 志辉
摘 要 ： 目的 分 析 对 约 氏疟 原 虫 不 易感 的 大 劣 按 蚊 和 易 感 的 斯 氏按 蚊 核 糖 体 基 因 内转 录 第 二 间 隔 区（ ｒ Ｄ Ｎ Ａ Ｉ Ｔ Ｓ ｚ ） 的 基 因特 征 。方 法 对 大 劣 按 蚊 和 斯 氏按 蚊 Ｉ Ｔｓ ２ 基 因进 行 Ｐ Ｃ Ｒ扩 增 ， Ｐ Ｃ Ｒ产 物进行 限制性 片断长 度 多态性分析 （ Ｒ Ｆ Ｌ Ｐ ） 和基 因 测序 ， 并 采 用 相 关 在 线 程 序 及 软 件 进 行 序 列 分 析 。测 序 结 果 与 Ｇｅ ｎ Ｂ ａ ｎ ｋ数 据 库 中其 它传 疟 按 蚊 的 Ｉ Ｔｓ ２ 序列进行多序列比对， 构 建 分 子 系统 树 。 结 果 大 劣 按 蚊 和 斯 氏按 蚊 的 Ｉ Ｔｓ ２ 基因Ｐ Ｃ Ｒ 产 物 经 限制 性 内 切 酶 Ｘ ｈ ｏ Ｉ 消化， 产 生 不 同 的 酶切 图谱 ； 测 序 结 果 表 明 大 劣按 蚊 和 斯 氏按 蚊 Ｉ Ｔ Ｓ ｚ 序列分别为 ７ １ ５ ｂ ｐ和 ４ ６ ６ ｂ ｐ ， 且 两种 按 蚊 Ｉ Ｔｓ ２ 序列的 Ｇ Ｃ 含 量 和 简 单 重 复序 列等 特 征 存 在 明显 差 异 ， 两者 碱 基 差 异 水 平 为 ５ ３ ． ５ ％； 分 子进 化 树 显 示 ， 大 劣 按 蚊 和 斯 氏 按 蚊 形 成 单 独 的 支 系 。结 论 大 劣 按 蚊 和 斯 氏按 蚊Ｉ Ｔ ｓ ２ 基 因具 有 不 同 的基 因特 征 ， 其 遗 传 多态 性 可 能 与 产 生 对 约 氏疟 原 虫 的 易感 性 不 同有 关 ， 为 进 一步 研 究 按 蚊 与 疟 原 虫 之 间 的相 互 作 用 奠 定 了基 础 。
cDNA文库的构建方法与原理
c D N A文库的构建方法与原理蛋白质是细胞的功能分子：它们构成结构和调控分子，动力和泵蛋白，酶和受体。
然而，如果仅用传统的生化方法确定某一特异蛋白的全序列，或制备足够量的蛋白进行操作和鉴定都是使人厌烦且昂贵的步骤。
基因克隆和遗传工程对生化领域有很大贡献。
如果只限于将基因组DNA作为材料来源，由于其中仅2%被认为可能编码蛋白质，那么确定蛋白质序列仍然是令人生畏的工作。
其他部分包括结构和调节因子、内含子、非编译外显子和重复及功能未知的非编码序列。
如果分析仅局限在编码序列，那么确定基因产物序列所需的努力就会大大的降低。
因此分子生物学主要原则之一是mRNA作为蛋白质合成的模板，所以mRNA是确定蛋白质序列的理想底物。
不幸的是，现有通用的克隆载体没有一个能容纳mRNA分子作为插入片段。
因此，产生表达序列文库的一个基本步骤是将mRNA分子转变成双链DNA。
来自mRNA分子的DNA拷贝称cDNA，由来自细胞或组织mRNA种类的DNA拷贝组成的文库称为cDNA文库。
1．基本原理cDNA（Complementary DNA）是以mRNA为模板，在反转录酶作用下合成的互补DNA，它的顺序可代表mRNA序列。
cDNA文库的构建是指将cDNA与克隆载体DNA体外重组，然后去转化克隆载体DNA 的宿主细胞，从而得到一群含重组DNA的细菌或噬菌体克隆的过程。
这些序列来自并代表一定组织或细胞类型特定发育或分化阶段的整个mRNA群体。
其过程可概括为：（1）通过反转录酶将各种mRNA转变在cDNA；（2）cDNA与合适的载体重组并导入到宿主中。
cDNA基因文库具有许多优点和特殊用途：首先，cDNA克隆以mRNA为起始材料，这对于有些RNA病毒来说非常适用，因为它们的增殖并不经过DNA中间体，研究这样的生物有机体，cDNA克隆是唯一可行的方法。
第二，cDNA基因文库的筛选简单易行，恰当选择mRNA的来源，使所构建的cDNA基因文库中，某一特定序列的克隆达到很高的比例，简化了筛选特定基因序列克隆的工作量。
cdna文库的构建和测序方法
cdna文库的构建和测序方法**CDNA Library Construction and Sequencing Methods**The construction of a cDNA library is a fundamental technique in molecular biology, enabling researchers to isolate, clone, and study specific genes. The process begins with the isolation of mRNA from a target cell or tissue. This mRNA is then reverse-transcribed into cDNA using a reverse transcriptase enzyme. The resulting cDNA fragments are subsequently cloned into a suitable vector, such as a plasmid or bacteriophage, to form a recombinant DNA molecule. These recombinant molecules are then introduced into host cells, typically bacteria, for amplification and storage.cDNA文库的构建是分子生物学中的一项基础技术，它使研究者能够分离、克隆和研究特定的基因。
该过程始于从目标细胞或组织中分离出mRNA。
随后，使用逆转录酶将这种mRNA逆转录成cDNA。
接着，将得到的cDNA片段克隆到合适的载体中，如质粒或噬菌体，形成重组DNA分子。
然后，这些重组分子被引入宿主细胞，通常是细菌，进行扩增和保存。
**Sequencing of cDNA Library**Once the cDNA library is constructed, sequencing becomes the next crucial step. Sequencing technologies have evolved significantly in recent years, with next-generation sequencing (NGS) platforms becoming increasingly popular. NGS allows for high-throughput sequencing, generating millions of reads in a short time. Thesereads are then aligned to a reference genome or transcriptome, enabling the identification and analysis of individual genes and gene expression patterns.cDNA文库构建完成后，测序成为下一个关键步骤。
第二节 cDNA 文库的构建
引物 : 5‘-T11VN 或 5‘-T12VN V=A, G, or C
• 以 10 核苷酸随机引物引导 cDNA 第二链合成 (PCR)
• 12 种可锚产定生引50物-1和002条0 种10随0-机50引0b导p D组N成A 条24带0 组引 物 , 产生约 20000 DNA 条带
1 ． gt10 和 gt11 gt10: 可用核酸探针 克隆 0-6kb EcoRI 插入后载体变 cIcI+ 在 hflA 中发生溶原
GenBank: U02447
E.coli
C600 allowing growth of parental and recombinant phage
C600hfl represses parental phage growth 50-100fold, recombinant phage form clear plaques and parental phage form turbid plaques
• 总 mRNA 制剂指导合成 cDNA 第一链长分子的能 力 合成的 cDNA 也应为上述范围 脱氧胸苷酸 12-18 聚体 [oligo(dT) ] 12-18 引物可刺激 cDNA 第一链的放射性活度掺入量至少 增加 30 倍
2 ． mRNA 的丰度
• 高丰度 mRNA 珠蛋白，免疫球蛋白，卵清蛋白 在特定细胞中占 50-90%
六、 PCR 在 cDNA 克隆中的应用 1. RACE 等
获得的 cDNA 克隆片段
2 、 cDNA 第二链的扩增
用合成的引物 链
CCCC
mRNA
AAAA
TTTTT-------
合成 cDNA 第一, 加入 polyC 尾
cDNA文库构建技术手册
目录1 材料与方法 (1)1.1 植物材料以及菌株的保存与培养 (1)1.2 Trizol法提取Total RNA (1)1.3 Oligo（dT）磁珠纯化mRNA (1)1.4 三框cDNA的合成 (2)1.5 cDNA均一化与小片段去除 (4)1.6 双链cDNA与pGADT7（lineared）同源重组 (6)1.7 质粒转化大肠杆菌 (7)1.8 文库鉴定 (7)1.9 文库质粒大抽 (8)2 结果与分析 (9)2.1 RNA质量较好无降解 (9)2.2 ds cDNA合成 (10)2.3 ds cDNA均一化与去除小片段 (11)2.4 克隆计数 (11)2.5 文库质量鉴定 (12)附录 (14)1．材料与方法1.1 植物材料以及菌株的保存与培养1.1.1 植物材料的保存盐穗木由客户提供，存放于-80℃超低温冰箱。
1.1.2 菌株的保存与培养大肠杆菌（Eschrichia coli）菌株TOP10于LB培养液摇菌后保存成20%的甘油菌于-80℃冷冻保存。
大肠杆菌于37℃培养箱中培养。
1.2 Trizol法提取Total RNA1）研钵研棒药勺用液氮预冷，样品在液氮中研磨成粉末状，转移到离心管中；2）按50-100 mg/ml trizol加入trizol，充分振荡混匀。
室温静置5 min，使其充分裂解；3）按200 μl/ml trizol加入氯仿，振荡混匀后室温放置10 min；4）4℃ 12000 rpm离心15 min，吸取上层水相至一新的离心管中，按500 μl/ml trizol加入异丙醇混匀，-20℃放置10 min；5）4℃ 12000 rpm离心10 min，弃上清，此时RNA沉淀于管底；6）按1 ml/ml trizol加入75%乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀。
4℃ 8000 g 离心5 min，尽量弃去上清；7）重复步骤6一次；8）室温晾干或真空干燥5-10 min，用29 μl RNase-free ddH2O和1 μl的RNase inhibitor 溶解RNA样品；9）分别吸取2 μl进行电泳检测与浓度测定。
烟草优质品种花全长cdna文库的构建和质量鉴定
烟草优质品种花全长cdna文库的构建和质量鉴定以《烟草优质品种花全长cdna文库的构建和质量鉴定》为标题，近年来以CDNA技术为主要研究技术的生物识别领域发展迅速，烟草，作为世界上最常见的特殊作物，是基因工程实验的重要模式植物。
因此，烟草优质品种的花全长cdna文库构建和质量鉴定是非常重要的。
本文基于现有技术和数据，综述了烟草优质品种花全长cdna文库的构建和质量鉴定的原理、方法和实践。
由于烟草作物具有特殊的结构和分子特性，烟草花蕊组织是花全长cdna文库构建的主要材料，其具有高等生命特性。
因此，构建烟草优质品种花全长cdna文库的技术原理主要有以下四点：（1）采集和筛选烟草花蕊组织;（2）烟草花蕊组织的破裂、抽提、纯化和检测;（3）烟草花蕊组织cdna的文库构建;（4）文库的质量检测和鉴定。
在烟草优质品种花全长cdna文库的构建方法中，采用烟草花蕊抽提cdna的方法来构建文库，这是一种新型的cdna文库构建方法。
该方法可以有效提高文库构建的效率，避免无效cdna的异常累积。
在质量鉴定方面，主要通过计算文库深度和宽度，鉴定全长文库的覆盖率，检测文库中的cDNA来进行鉴定，以保证烟草优质品种花全长cdna文库的质量。
目前，烟草优质品种花全长cdna文库的构建和质量鉴定技术已取得了较好的效果，成功构建了大量的花全长cdna文库，将用于今后烟草基因工程实验等研究。
然而，在构建和质量鉴定过程中，仍然存在着不少问题，比如文库构建效率低、文库覆盖率不足等，需要进一步改进和完善技术流程，以提高文库构建效率和质量鉴定的准确性。
综上所述，烟草优质品种花全长cdna文库的构建和质量鉴定是烟草基因工程实验的重要前提，也是进行后续研究的基础。
未来，研究者将开展更多的实验研究以改善文库构建和质量鉴定技术，更深入地研究烟草基因工程实验。
2.4.2 cDNA文库的构建
cDNA文库的构建LOGOcDNA文库某种生物基因组转录的部分或全部mRNA经反转录产生的各种cDNA片段分别与克隆载体重组，贮存在一种受体菌群体中，这样的群体称为cDNA文库。
如果此群体中只贮存该基因组的部分cDNA，则称为部分cDNA基因文库。
cDNA文库的构建过程AAAAAAA TTTTTTTTRNA提取分离mRNAOligo dT或随机引物合成cDNA第一链合成cDNA第二链补平cDNA链末端连接接头连接载体噬菌体颗粒的包装及转染或质粒的转化参数测定分装、保存分离纯化mRNA通过真核生物mRNA分子的3'端的polyA尾与oligo（dT）发生碱基配对的方法分离纯化胞质中RNA混合物在杂交条件下混合洗掉rRNA和tRNA低盐缓冲液中的洗脱过柱纯化的mRNA检测mRNA的完整性1、利用麦芽提取物或兔网状红细胞裂解物的无细胞翻译系统来检测mRNA是否 能被翻译2、用琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶电泳检测5’mRNAAAAAA -3’ HO-TTTTT P -5’5’逆转录酶 四种 dNTPsAAAAA -3’TTTTT P -5’ mRNAmRNAc DNAc DNA c DNA双链 c DNA AAAAA -3’TTTTT P -5’TTTTT P -5’3’3’-CCCCCCC 末端转移酶 dCTP碱 (水解 RNA)纯化的 DNA oligo(dG)Klenow 聚合酶 或逆转录酶 四种 dNTPs5’-pGGGG-OH 5’3’-CCCCCCC5’-pGGGG 3’-CCCCCCCTTTTT P -5’-3’5’-pGGGG 3’-CCCCCCC HO-CCGAATTCGGGGGG 3’-GGCTTAAGCCCCCC 5’-pAATTCGGGGGGTTTTTGGCTTAAGCC-OHCCGAATTCGG-3’ 3’-CCCC3’-CCCCCCC3’-CCC5’-pGGGG 5’-pGGGG TTTTTp-5’ -3’TTTTTp-5’TTTTTp-5’-3’ -3’ TTTTTGGCTTAAp-5’HO-CCG/AATTCGG-3’ 3’-GGCTTAA/GCC-OHCCG-3’单链特异性核酸酶Klenow 聚合酶Eco RI 甲基化酶处理加 Eco RI 接头 T4 DNA 连接酶Eco RI 酶切与载体连接并转化转化或感染宿主菌培养分离，形成菌斑或噬斑。
基因组文库、cDNA文库的构建和筛选
mRNA的提取
• 全长mRNA具有 一个polyA的3’ 末端，可以被用 于mRNA的分离；
• 可以用寡聚纤维 素柱，选择性地 吸附mRNA
• 纯化
• 用结合有寡聚（dT ）的磁珠加到细胞裂解 液，在用强磁铁吸出磁珠并洗出mRNA。
检测mRNA
• 翻译，检测翻译产物： 用无细胞翻译系统（如麦胚抽提液 或兔网织红细胞裂解液）来检测 mRNA的完整性，也可用凝胶电泳 直接检测，用杂交法分离 mRNA。
特特点点：： 对应的菌斑或噬菌斑位置不变， 可以直接找出阳性菌落。
寡聚核苷酸探针
抗体探针
• 表达筛选 通过抗体筛选来检测cDNA编码 的蛋白质
cDNA表达为与β半乳糖苷酶相嵌合的目的基因的融合 蛋白，用抗血清来筛选目的cDNA编码的融合蛋白。 筛选流程与噬菌斑杂交程序相似。
质粒蛋白 A
外源蛋白B
• 质粒载体：cDNA相对较短。 • 噬菌体载体：构建表达cDNA与载体的连接筛选流程
筛选• 从基因的大量克隆中鉴定出某个含有目的基 因的特定克隆的过程，称为筛选
• 筛选过程通常需要一个核酸探针进行杂交，该探 针可以与其互补序列结合从而检测出含目的基因 的克隆。
• 将菌落或噬菌斑转移到膜上，将其置入含放射性 标志探针溶液中保温，检出相应克隆。
• 合适的酶切片段可由琼脂糖凝胶电泳
质粒载体
蓝白筛选
YAC载体
置换型载体
• 允许外源 DNA 片段替换非必须 DNA 片段 的载体，称为置换型载体（replacement vectors）。一般情况下，置换型载体克隆 外源片段的大小范围是 9-2究 人 员 迫 切 地 寻 找 CFTR 及 HD 基 因 时 尚 无 YAC 可 用 。 疾 病 基 因 与 标 记 DNA 的 距 离 远 比 载 体 所 携 带 的 DNA 片 段 还 长 。 他 们 想 出 了染色体步移的方法。虽然标记 DNA 所 制 成 的 探 针 无 法 找 到 包 含 疾 病 基 因 的 片 段 ， 但 所 找 到 的 片 段 (即 与 探 针 杂 交 的 片 段) 有 一 部 分 可 能 比 标 记 DNA 更 接 近 疾 病 基 因 。 在 他 们 制 作 的 基 因 库 里 ， DNA 片 段 之 间 有 部分重叠。因此可以用新找到的片 段做为探针寻找与它重叠的片段。 如此重复许多次后，应该可以找到 包 含 疾 病 基 因 的 片 段。
cDNA文库的构建
cDNA文库的构建一、cDNA文库的构建在细胞分化方面的知识（一）在某种特定细胞中的某个特定时期提取总RNA（mRNA 与micro-RNA、NATs、long no-coding RNA）：以小鼠股骨组织为例；以小鼠骨髓巨噬细胞系RAW264.7为例；以原代小鼠骨髓巨噬细胞（纯度70%？）为例；cDNA文库（百度）以mRNA为模板，经反转录酶催化，在体外反转录成cDNA，与适当的载体（常用噬菌体或质粒载体）连接后转化受体菌，则每个细菌含有一段cDNA，并能繁殖扩增，这样包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合称为该组织细胞的cDNA文库。
cDNA文库特异地反映某种组织或细胞中，在特定发育阶段表达的蛋白质的编码基因，因此cDNA文库具有组织或细胞特异性。
目录1概述2定义3原理4注意事项5 mRNA制备来源完整性丰度分离6 TRNA7 cDNA第一链第二链自身引导置换合成8克隆9筛选鉴定10载体制备11鸟枪法12物化方法13分离基因14化学合成15 PCR1概述cDNA文库是以特定的组织或细胞mRNA为模板，逆转录形成的互补DNA（cDNA）与适当的载体（常用噬菌体或质粒载体）连接后转化受体菌形成重组DNA克隆群，这样包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合称为该组织或细胞的cDNA文库。
cDNA文库特异地反映某种组织或细胞中，在特定发育阶段表达的蛋白质的编码基因，因此cDNA文库具有组织或细胞特异性。
cDNA文库显然比基因组DNA文库小得多，能够比较容易从中筛选克隆得到细胞特异表达的基因。
但对真核细胞来说，从基因组DNA 文库获得的基因与从cDNA文库获得的不同，基因组DNA文库所含的是带有内含子和外显子的基因组基因，而从cDNA文库中获得的是已经过剪接、去除了内含子的cDNA。
真核生物基因组DNA十分庞大,其复杂程度是蛋白质和mRNA的100倍左右,而且含有大量的重复序列. 采用电泳分离和杂交的方法,都难以直接分离到目的基因.这是从染色体DNA 为出发材料直接克隆目的基因的一个主要困难。
cDNA文库制备
质达，产生具有天然构像的编码产缺点：库容、双链cDNA与载体连接
1）同聚物加尾：借助末端转移酶给载体和双链c DNA的3’端分别加上几个C或G，成为粘性末 端 2）加接头或衔接子引入酶切位点：添加带有限 制性酶切位点的接头。
寡聚（dT）－纤 维素柱层析
二、cDNA的第一链合成 由mRNA到cDNA的过程称为反转录，由反转录 酶催化。 反转录酶 常用的反转录酶有2种： 1）AMV（禽成髓细胞癌病毒） 2）M-MLV（Moloey鼠白血病病毒） 都是依赖于RNA的DNA聚合酶，有5’→3’ DNA聚合酶活性。前者最适温度为42℃，后者 为37℃。
2、重组 cDNA 片段的序列完整性:
在细胞中表达出的各种mRNA基本上都是由 3部分组成，即5'端非翻译区，中间的编码区 和3'端非翻译区。非翻译区的序列特征对基因 的表达具有重要的调控作用，编码序列则地反应出天然基因的结构。
3）器官特异性 有的结构基因的表达就有器官特异性 ，故由同代谢阶段（或发育阶段）的结 适用于RNA病毒的基因组结构研究。 2）出现假阳性的概率较低。 3）有效地分析间断基因的结构。 4）发育过程中时间调节基因及组织特异中期供构建分子标记连锁图谱的所用探 针，更重要的是可以用于分离全长基因进而开展基因 功能研究。因此，cDNA在研究具体某类特定细胞中基 因组的表达状态及表达基因的功能鉴定方便具有特殊 的优势，从而使它在个体发育、细胞分化、细胞周期 调控、细胞衰老和死亡调控等生命现象的研究中具有 更为广泛的层出不穷， 相信cDNA定能更加迅速、高效满足研究的需要。
反转录引物
1、Oligo dT引物
一般包括15－30 个脱氧胸腺嘧啶核苷和一段带有稀
有酶切位点的寡核苷酸片段。
3’ 5’ 引物
cDNA文库构建策略及其分析研究进展
自20世纪70年代中期首例cDNA克隆问世以来，构建cDNA文库已成为研究功能基因组学的基本手段之一。
cDNA便于克隆和大量表达，它不像基因组含有内含子而难于表达，因此可以从cDNA文库中筛选到所需的目的基因，并直接用于该目的基因的表达。
通过构建cDNA表达文库不仅可保护濒危珍惜生物资源，而且可以提供构建分子标记连锁图谱的所用探针，更重要的是可以用于分离全长基因进而开展基因功能研究。
因此，cDNA在研究具体某类特定细胞中基因组的表达状态及表达基因的功能鉴定方便具有特殊的优势，从而使它在个体发育、细胞分化、细胞周期调控、细胞衰老和死亡调控等生命现象的研究中具有更为广泛的应用价值，是研究工作中最常使用到的基因文库。
从1976年HOFSTETTER 成功的构建了第一个cDNA文库以来，构建cDNA 文库的技术方法经历了一个逐步发展完善的过程。
初期cDNA文库，由于当时技术的限制，选用质粒载体存在着连接效率低、难以扩增和保存等缺点，而YOUNG 和DA VIS重组载体为表达性文库构建和保存提供了质的飞跃。
近年来，cDNA文库构建的新方法层出不穷，但其共同目的是使cDNA文库更加迅速、高效满足研究的需要。
本文就近年来发展的cDNA文库的构建及其类型特点作一简要综述。
1 cDNA文库的构建1.1 cDNA文库构建的基本原理与方法cDNA文库是指某生物某发育时期所转录的全部mRNA经反转录形成的cDNA 片段与某种载体连接而形成的克隆的集合。
经典cDNA文库构建的基本原理是用Oligo(dT) 作逆转录引物，或者用随机引物，给所合成的cDNA加上适当的连接接头，连接到适当的载体中获得文库。
其基本步骤包括：RNA的提取(例如异硫氰酸胍法，盐酸胍—有机溶剂法，热酚法等等，提取方法的选择主要根据不同的样品而定)，要构建一个高质量的cDNA文库，获得高质量的mRNA是至关重要的，所以处理mRNA样品时必须仔细小心。
由于RNA酶存在所有的生物中，并且能抵抗诸如煮沸这样的物理环境，因此建立一个无RNA酶的环境对于制备优质RNA很重要。
大劣按蚊丝氨酸蛋白酶cDNA克隆和表达
大劣按蚊丝氨酸蛋白酶cDNA克隆和表达徐文岳;黄复生;夏莉莎;段建华【期刊名称】《中国人兽共患病学报》【年(卷),期】2004(020)002【摘要】目的克隆、表达大劣按蚊丝氨酸蛋白酶.方法根据已报道昆虫的前酚氧化酶激活酶(prophenoloxidase-activating enzyme,PPAE)的保守氨基酸序列设计简并引物,以大劣按蚊血细胞mRNA为模板,进行RT-PCR扩增,克隆和测定插入片段;所得序列进行BLAST查询,并原核表达其中的两种PPAE样丝氨酸蛋白酶cDNA,通过SDS-PAGE和Western blotting 检测表达产物.结果和结论获得了3种大劣按蚊血细胞丝氨酸蛋白酶cDNA部分序列,即AdsP1(512bp),AdsP2(488bp)和AdsP3(512bp).AdsP1和AdsP3与冈比亚按蚊sP14D1、sP14D2、3种昆虫PPAE和黑腹果蝇Easter很相似,推测AdsP1和AdsP3可能是大劣按蚊的PPAE,起调节大劣按蚊黑化包裹约氏疟原虫反应的作用.另外,成功表达了AdsP1和AdsP3 部分cDNA序列.【总页数】4页(P92-95)【作者】徐文岳;黄复生;夏莉莎;段建华【作者单位】第三军医大学基础部病原生物学教研室,重庆,400038;第三军医大学基础部病原生物学教研室,重庆,400038;第三军医大学基础部病原生物学教研室,重庆,400038;第三军医大学基础部病原生物学教研室,重庆,400038【正文语种】中文【中图分类】R384.1【相关文献】1.大劣按蚊血淋巴中疟原虫感染相关蛋白的cDNA克隆 [J], 王英;黄复生;段建华;周桃莉;陈继德2.大劣按蚊丝氨酸蛋白酶AdSP3的组织定位和定量研究 [J], 王英;黄复生;张锡林;徐文岳;段建华3.大劣按蚊血淋巴中丝氨酸蛋白酶的分离与鉴定 [J], 王英;张健;张锡林;周桃莉;段建华;徐文岳;黄复生4.大劣按蚊与烟草天蛾丝氨酸蛋白酶的交叉免疫活性 [J], 王英;徐文岳;陈继德;段建华;周桃莉;黄复生5.与大劣按蚊先天免疫相关丝氨酸蛋白酶的克隆及分析 [J], 张健;徐文岳;黄复生;段建华因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
大劣按蚊对约氏疟原虫卵囊黑化相关血细胞类型的初步鉴定
论著 文章编号:100025404(2004)0620498203大劣按蚊对约氏疟原虫卵囊黑化相关血细胞类型的初步鉴定杨 松,时超美,周桃莉,黄复生,况明书,王 英 (第三军医大学基础医学部病原生物学教研室,重庆400038) 提 要:目的 鉴定与抗疟黑化反应相关的大劣按蚊血细胞。
方法 采用姬氏染色法初步鉴定大劣按蚊血细胞类型,继而利用免疫细胞化学技术检测大劣按蚊血细胞内前酚氧化酶和丝氨酸蛋白酶。
结果 颗粒细胞和浆细胞为大劣按蚊主要血细胞,前酚氧化酶和丝氨酸蛋白酶也主要分布于颗粒细胞和浆细胞内,其中颗粒细胞最常见。
结论 抗疟黑化相关性血细胞可能主要为颗粒细胞和浆细胞。
关键词:大劣按蚊;血细胞;黑化;免疫细胞化学 中图法分类号:R382.31;R384.1;R446.113 文献标识码:APreliminary identification of Anopheles dirus hemocytes related with anti2malaria mela2 nization of Plasmodium yoelii oocystsY ANG S ong,SHI Chao2mei,ZH OU T ao2li,H UANG Fu2sheng,K UANGMing2shu,W ANG Y ing(Department of Pathogenic Biol2 ogy,C ollege of Medicine,Third Military Medical University,Chongqing400038,China) Abstract:Objective T o identify the hem ocytes related with anti2malaria melanization response.Methods The types of hem ocytes were identified preliminarily by G iemsa’s staining,and then both prophenoloxidase(PPO) and serine protease(SP)were detected by immunocytochemical technique.Re sults The hem ocytes were mainly granular cells and plasmatocytes in which S p22D and PPO were distributed.Conclusion Hem ocytes related with anti2malaria melanization may mainly be granular cells and plasm ocytes. K ey w ords:Anopheles dirus;hem ocyte;melanization;immunocytochemistry 昆虫先天性免疫系统分为体液性和细胞性防御反应,体液性防御反应包括抗菌肽,血淋巴黑化和凝固的级联,氧和氮活性中间产物。
中华按蚊防御素基因cDNA序列和基因组序列的克隆及鉴定
中华按蚊防御素基因cDNA序列和基因组序列的克隆及鉴定张亚晶;陈晓光;郑学礼;王春梅【期刊名称】《中国寄生虫学与寄生虫病杂志》【年(卷),期】2006(24)1【摘要】目的克隆中华按蚊防御素基因全长cDNA序列及基因组序列,并对其进行鉴定和生物信息学分析。
方法根据已发表的埃及伊蚊和冈比亚按蚊等的防御素基因序列设计引物,提取中华按蚊总RNA并构建其基因组文库,分别进行多轮RT-PCR 和巢式PCR扩增,将所得片段进行克隆、测序,并应用相关生物信息学软件对序列进行鉴定和分析。
结果从中华按蚊基因组文库中扩增出完整的防御素基因组序列(由两个外显子和一个内含子组成)以及5′端和3′端的非编码序列(UTR)片段,总长度为2256bp;从中华按蚊总RNA中扩增出大小为324bp的cDNA片段,经测序证实为中华按蚊防御素基因全长cDNA序列,其开放阅读框共编码107个氨基酸,成熟肽部分具有40个氨基酸残基。
结论首次克隆出中华按蚊防御素基因全长cDNA序列及基因组序列,为进一步的功能研究奠定了基础。
【总页数】6页(P35-40)【关键词】中华按蚊;防御素;cDNA序列;基因组序列;克隆【作者】张亚晶;陈晓光;郑学礼;王春梅【作者单位】南方医科大学公共卫生与热带医学学院病原生物学系【正文语种】中文【中图分类】R384.111【相关文献】1.新型皱纹盘鲍防御素hd-def的cDNA序列分析、基因组克隆及表达研究 [J],洪旭光;孙修勤;郑明刚;昝金东;曲凌云;张进兴2.人血小板生成素基因cDNA和基因组DNA的克隆和序列测定 [J], 宁云山;周宏伟;周明乾;陈泽洪;方向东;富宁;王小宁3.雨生红球藻β-胡萝卜素酮化酶基因的cDNA和基因组DNA克隆及序列分析 [J], 滕长英;张立;秦松;曾呈奎4.安徽三黄鸡β-防御素Gal-6cDNA基因片段的克隆与序列分析 [J], 江龙海;高恒;彭开松;祁克宗5.团头鲂β-防御素1基因cDNA的克隆、序列分析及表达特征 [J], 张涓;陈思思;何玉慧;黄金海;刘小玲;陈孝煊;袁改玲因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
大劣按蚊
生态习性
大劣按蚊是典型的野栖蚊种,常见分布于山麓丛林或林缘地区，其栖息场所有草丛、灌木丛及竹林等处。通过 窗阱观察，它吸血后绝大多数即飞离人房。胃血沉淀试验表明它嗜吸人血；在人、牛同时并存环境中，吸人血的 占96%，而吸牛血的仅占4%。夜间吸血活动，在日落后1小时左右先后龟入人房四周树丛中栖息，约晚上9点钟逐 渐入人房，11—1点钟达高峰，吸血时间很短。季节消长和降雨量有密切关系，据海南岛调查资料，1—10均有发 现，以6—7月份捕获成蚊较多。孽生在有浓荫遮蔽的森林中、石穴或溪床积水中。
大劣按蚊(5张)成蚊翅纵脉6有黑斑6个以上,纵脉1分脉前黑斑伸向基部不超过前缘脉黑斑的中央；各足股节、 胫节和部分跗节有白点，后足胫节和跗节关节处有一个显著的宽白环。幼虫的头毛2-c和3-c简单；各胸节侧毛的 长毛简单，前胸内肩毛(1-p)的基瘤大而且发达，与中肩毛(2-p)的基瘤完全或者部分相连；腹节前背片正常，不 包围后背片。
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本种提示
过去我国海南岛和云南芒市、瑞丽、盈江以及我国台湾等地均记载巴拉巴按蚊。已证实，海南和云南的为大 劣按蚊，而我国台湾的则为高砂按蚊。
国外，Colles（1956 )，将白踝按蚊种团（An. leucosphyrusgroup）重新分类，定出了10余种、亚种或 型。Reid（1968）对马来亚和婆罗洲等地白踝按蚊和巴拉巴按蚊成虫、蛹、幼虫的形态作过比较，认为由于翅分 脉前黑斑在纵脉1部分长度、后足跗4基白环以及蛹的特征等等，提出巴拉巴按蚊有不同的类型。Peyton和 Harrison (1979,1980）对泰国的巴拉巴按蚊以及巴拉巴岛、巴拉望岛、菲律宾、北婆罗洲等地的巴拉巴按蚊模 式标本作了比较后，认为泰国过去记述的巴拉巴按蚊有所差别，另立为大劣按蚊。同时，他们又对我国台湾巴拉 巴按蚊进行了研究，同意Morishita (l946）描述台湾白踝按蚊高砂亚种，并与巴拉巴按蚊和大劣按蚊作了比较， 将亚种升为种即高砂按蚊，但Pal等（1981）从细胞学等实验认为大劣按蚊非独立种。Sucharit等（1983）对巴 拉巴按蚊和大劣按蚊的雄蚊尾器作了比较观察，证明这两种是可以区别的。国外关于大劣按蚊的鉴别曾进行过许 多研究，包括形态、染色体、同功酶谱、DNA探针等。从广泛野外采集及种群细胞学研究结果，“大劣按蚊”确 切地讲是一个复合体，它至少包括A, B, C, D, E, F及takasagoensis等7种（Baimai et al., 1981, 1984, 1987, 1988 )，它们的地理分布、生态习性、传疟作用也有差异。我国大劣按蚊的鉴定与命名经历了一个曲折的 历史过程，早在50年代初期，何琦教授等在海南岛抗疟资料中将它鉴定为白踝按蚊（An.leucosphyru,1974年邓 达等将它更名为巴拉巴按蚊An. balabacensis,1982年邓达等又将它更名为人劣按蚊An.
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文章编号:100025404(2003)1120971203 论著大劣按蚊成蚊cDNA文库的构建与质量鉴定郝宏兴,徐文岳,段建华,况明书,黄复生 (第三军医大学基础医学部病原生物学教研室,重庆400038) 提 要:目的 构建大劣按蚊成蚊cDNA文库,为进一步筛选、克隆按蚊免疫及疟原虫发育相关基因奠定基础。
方法 分离大劣按蚊成蚊mRNA,用S tratagene公司的Z AP Express文库构建试剂盒构建cDNA文库并鉴定其质量。
结果 所建文库滴度达211×106pfu/ml,重组效率达98%以上,插入片段长度平均为1kb以上。
结论 采用Z AP Express文库构建试剂盒可以成功构建出较高质量的大劣按蚊成蚊cDNA文库。
关键词:大劣按蚊;cDNA文库 中图法分类号:R342.3;R384.1;R394.2 文献标识码:AConstruction of cDNA library from adults of Anopheles dirusH AO H ong2xing,X U Wen2yue,DUAN Jian2hua,K UANG Ming2shu,H UANG Fu2sheng(Department of Pathogenic Biology,Third Military Medical University,Chongqing400038,China) Abstract:Objective T o construct cDNA library from adults of Anopheles dirus for cloning the immune genes or related genes for malaria parasites development.Methods The mRNA of adult Anopheles dirus was is olated.The library was constructed by using the Z ap Express vector(Stratagene)and the quality was evaluated.Re sults The ef2 ficiency of the library was2.1×106pfu/ml with98%clones positive.The average length of the insert fragment was over1kb.Conclusion cDNA library of adult Anopheles dirus with high efficiency can be constructed by using the Z ap Express library construction K it(Stratagene). K ey w ords:cDNA library;Anopheles dirus 疟疾是一种严重危害人类健康和流行区国家经济、社会发展的寄生虫病,随着多抗药虫株的出现和媒介按蚊对杀虫剂产生抗性,疟疾的防治面临新的挑战。
20世纪90年代初,WH O/T DR提出了“遗传改造媒介按蚊”的防治策略[1],构建按蚊cDNA文库并从中筛选与克隆出按蚊体体内支持或抑制疟原虫发育的相关基因是实现这一策略的前提[2]。
1 材料与方法111 材料11111 蚊种 大劣按蚊(Anopheles dirus):羽化后3～5d龄成蚊,只喂糖水,该蚊种为我国南方主要的疟疾媒介之一,从海南岛采集后经驯化,常规饲养。
11112 试剂盒 总RNA、mRNA提取分别采用Promega公司RNAgents(R)T otal RNA分离试剂盒及P olyAT tract(R)mRNA分离试剂盒;文库构建采用S tratagene公司Z AP Express高效文库 作者简介:郝宏兴(1967-),男,山西省平定县人,博士研究生,讲师,主要从事疟疾方面的研究,发表论文8篇。
电话:(023)68752243 通信作者:黄复生,电话:(023)68752244 收稿日期:2002206225;修回日期:2002209215构建试剂盒。
112 方法11211 大劣按蚊成蚊mRNA的提取 取3～5d龄雌蚊约300只,加入异硫氰酸胍变性液后匀浆[3],操作参照Promega公司RNAgents(R)总RNA分离试剂盒说明进行。
所得RNA经1%琼脂糖凝胶电泳及测定A260、A280分别检查其完整性和纯度。
mRNA的分离使用Promega公司P olyAT tract mRNA分离试剂盒。
11212 cDNA第1链、第2链的合成 用S tratagene公司的cDNA合成试剂盒,以5μg mRNA做模板;Linker2primer序列如下:5′2G AG AG AG AG AG AG AG AG AG AACT AG T CT CG AG TTTTTTTTTT TTTTTTTT23′(下划线处为XhoⅠ酶切位点)。
该反应体系总体积为50μl,其中5μl第1链反应缓冲液,3μl甲基化核苷酸底物,2μl Linker2primer,1μl RNase抑制剂,DEPC处理水与polyA RNA共3715μl。
轻轻混匀,室温下令引物和mRNA模板退火10 min后,向反应体系中加入M M LV2RT(50U/μl)115μl,混匀、放42℃水浴1h后加入第二链反应混合物,16℃孵育215h(保证温度不超过16℃)后置于冰上。
11213 cDNA末端修饰及大小选择 cDNA末端修饰包括: DNA P olymerse催化的末端平滑反应;T4DNA连接酶催化的接头连接反应;T4多核苷酸激酶催化的Eco RⅠ接头5′端磷酸化179第25卷第11期2003年6月 第 三 军 医 大 学 学 报ACT A AC ADE MI AE ME DICI NAE MI LIT ARIS TERTI AEVol.25,N o.11Jun.2003反应以及XhoⅠ酶切反应,实验操作均按试剂盒说明进行。
cD2 NA分级分离采用N ovagen公司的小量树脂柱分离试剂盒。
11214 cDNA片段与载体重组及体外包装 合成的cDNA3μl(约100ng)与预先用Eco RⅠ和XhoⅠ处理好的Z AP2Express 载体在T4DNA连接酶(4U/μl)作用下于12℃连接过夜,反应总体积为5μl。
(反应体系设置产品提供的阳性对照)。
第2天,取2μl连接反应用于包装,包装蛋白为S tratagene G igapack G old Packaging Extract,22℃,2h完成噬菌体DNA的包装过程,然后加入500μl S M液和20μl氯仿后贮于4℃。
初级文库经常规稀释、感染宿主菌后铺平板测定滴度。
11215 文库的扩增与贮存 将初级文库均分为20等份(约5×104pfu),每份与600μl宿主菌X L12Blue MRF′(A600=015)混合后于37℃孵育15min,然后加入615ml NZY顶层琼脂后铺于平板上,于37℃培养6～8h,当噬菌斑边缘相接但直径未超过1～2mm时,加入8～10ml S M液,4℃振荡过夜。
第2天收集S M上清,离心后加入7%的二甲亚砜(DMS O)-70℃保存。
11216 pBK2C M V噬菌粒批量内切除 包含于Z AP2Express噬菌体序列内部的pBK2C M V噬菌粒可以在辅助噬菌体共感染宿主菌时被切除并分泌于细菌外。
其反应体系为:1×107pfu的噬菌体文库与10倍数量的X L12Blue MRF′宿主菌混合,然后加入1×109pfu的辅助噬菌体(ExAssit phage),37℃、15min后加入20ml NZY肉汤于37℃摇菌215h,然后于68℃、20min灭活宿主菌和λ噬菌体,再于1000×g离心10min,将上清移至新管即为噬菌粒文库。
取1μl上清与200μl X LO LR细菌混合后铺于LB抗生素选择平板,经过夜培养测得其滴度为115×107pfu/ ml。
11217 PCR法测定插入片段的长度 取107pfu的文库原液与200μl的X L12Blue MRF′(A600=015)混合后于37℃孵育15 min,加入NZY顶层琼脂、混匀后铺板。
待噬菌体长成后随机取出10个噬斑,分别溶于25μl S M液,室温1h后取其中5μl做模板,99℃变性5min,以T3和T7启动子引物引导PCR反应,检查插入片段的长度。
2 结果211 大劣按蚊成蚊总RNA、mRNA的得率与质量 大劣按蚊成蚊总RNA得率平均达3187μg/mg蚊组织,A260/ A280达1175,1%琼脂糖电泳可见5、18、28S rRNA条带完整。
mR2 NA得率达16ng/mg蚊组织;A260/A280达1180;经1%甲醛变性胶电泳分析所得mRNA为介于500bp到4kb以上的一片拖影。
212 cDNA含量测定 合成的cDNA过柱以去除小于500bp的小分子、多余的Eco RⅠ接头,收集大分子流份经酚、氯仿抽提、乙醇沉淀后溶于5μl无菌水中,取015μl经溴化乙啶平板法测定cDNA含量约为30ng/μl,总得率达150ng。
213 文库的滴度与重组效率 本研究采用S tratagene公司的Z AP Express噬菌体载体,目的基因定向插入位于载体多克隆位点内的Eco RⅠ和XhoⅠ内切酶位点之间,该载体设计通过α互补形成蓝白斑筛选重组克隆。
1∶10稀释时1μl噬菌体形成白斑206个、蓝斑4个,重组率达98%以上,滴度达211×106pfu/ml;扩增文库滴度达1×1010～1×1011pfu/ml。
214 插入片段的长度 以随机挑取的10个噬菌斑为模板,根据载体多克隆位点两端的T3、T7启动子序列设计引物做PCR,扩增产物的1%琼脂糖电泳结果显示插入片段长度为600～2000bp;平均达1000bp以上,见图1。
M:DNA marker;Lanes1-10:Random phage plaques PCR products图1 随机噬菌斑PCR产物电泳图谱Fig1 PCR products of ph age plaques3 讨论 构建cDNA文库是系统地研究一种生物的基因结构与功能的基础,从理论上讲,研究者可以从一个合格的文库中调取任何目的基因。
据报道,当一个cDNA 文库的容量为416×104～416×105时,得到所需克隆的概率为99%,从而可筛选出低丰度的cDNA[4]。