cDNA文库的构建和筛选

第三节 cDNΒιβλιοθήκη Baidu表达文库的筛选
2 酵母双杂交系统 原理
A、转录激活因子GAL4
✓ N端：147个氨基酸组成的DNA结合域(DNA binding domain,BD)
✓ C端：113个氨基酸组成的转录激活域(transcription activation domain,AD)。
✓ GAL4分子的DNA结合域可以和上游激活序列(upstream activating sequence，UAS)结合，而转录激活域则 能激活UAS下游的基因进行转录。
➢局限性：
表达的外源蛋白均为融合蛋白，可能与
天然状态不符，造成结果的不准确
本身就具有转录激活活性 的兴趣蛋白
不适合于该系统
不能定位于核内 的兴趣蛋白不适合于
该系统
需要翻译后修饰的蛋白 不适合该系统
第五节：体外克隆编码细胞内信号蛋白的 基因
研究目的 鉴定突变体细胞中编码蛋白酶的cDNA克隆 研究基础以及原理 1、突变体细胞 2、野生型细胞cDNA文库，且可进行体外
第二节 cDNA文库的筛选
基因序列未知 常用筛选cDNA文库的方法 A、用已知氨基酸序列来获得简并序列 B、纯化蛋白质相应的抗体 C、利用同源基因（?）中的目标基因序列 D、利用差异表达基因的扣除cDNA探针
A、用已知氨基酸序列来获得简并序列
某些基因编码的蛋白质的性质已知 通过氨基酸序列反推核苷酸序列
TGG-GAT/C-GAA/G-AAT/C-AAT/C-ATG 进行至少两轮的筛选才能获得阳性的克隆
B、利用抗体进行杂交
免疫学筛查：检测克隆基因编码的蛋白 免疫学筛查所需要的抗体 免疫学筛查首先获得抗原
抗原 一 抗
二 抗
信号 放大
利用的基因文库必须是表 达文库，能够表达抗原
特点是： 已知蛋白 产物，但 对其核酸 序列或氨 基酸序列
在构建cDNA 文库之前，需要将单链cDNA合成 双链，主要有以下二种种方法：
A、降解mRNA-cDNA杂合链中的RNA，cDNA 第一链3’端回折充当引物，形成第二链
mRNA cDNA
AAAAAA TATATATTT
TTT
第一节：将mRNA转变成cDNA
B、用来自E. coli中的RNase H
第五章 cDNA文库的构建和筛选
将RNA转变成cDNA以及cDNA文库构建 cDNA文库筛选策略 cDNA表达文库的功能筛选 用cDNA检测基因的表达 体外克隆编码细胞内信号蛋白的基因
细胞中总 RNA
• 信使 RNA (mRNA): 1-5%. 作为蛋白质合 成的模板。
• 核糖体 RNA (rRNA): >80%. 构成核糖体 ，参与蛋白质翻译
COOH
+
共转化
?
Gal4
AD cDNA COOH Leu-
Gal4
BD
X
Promoter
cDNA library
Gal4
AD Reporter
酵母双杂交系统的小结
➢用途：
快速筛选与一种已知蛋白结合的目的蛋白，发现新 基因
验证 已知蛋白间的相互作用及作用强度
酵母双杂交系统(Yeast Two-hybrid System)
三、cDNA克隆载体
它是包含了丝状噬菌体大间隔区域的质 粒，是一种双链质粒，含噬菌体来源的 复制子，在细菌的细胞中出现有辅助噬 菌体的情况下，可被诱导成单链DNA噬 菌粒同时具有噬菌体和质粒的特征，可 以像噬菌体或质粒一样复制。。
优点：1.双链DNA既稳定又高产，具有 常规质粒的特征；2.免除了将外缘DNA 片段从质粒亚克隆于噬菌体载体这一繁 琐又费时的步骤；3.由于载体足够小， 故可得到长达10kb的外源DNA区段的单 链。
第三节 cDNA表达文库的筛选
B、酵母双杂系统的组成部分 （1）与BD融合的蛋白表达载体，被表达的蛋
白称诱饵蛋白（bait）； （2）与AD融合的蛋白表达载体，被其表达的
蛋白称靶蛋白（prey）； （3）带有一个或多个报告基因的宿主菌株。 C、酵母双杂系统的工作原理
BD gene Bait gene
第三节 cDNA表达文库的筛选
D、肽库与被测试的靶蛋白分子经过一定时间孵 育后，洗去未结合的游离噬菌体，然后以竞争 受体或酸洗脱下与靶分子结合吸附的噬菌体
E、洗脱的噬菌体感染宿主细胞后经繁殖扩增， 进行下一轮洗脱
F、经过3轮～5轮的“吸附-洗脱-扩增”后，与 靶分子特异结合的噬菌体得到高度富集。所得 的噬菌体制剂可用来做进一步富集有期望结合 特性的目标噬菌体。
mRNA cDNA
TTTTTT
TTT
降解的RNA充当引物，在DNA聚合酶和连接酶的
作用下合成第二链DNA
cDNA文库的组建：
mRNA 反转录酶
cDNA
基因重组
cDNA 文库的特点
cDNA 文库代表了某个器官或组织中的 RNA群体。
在某个给定的cDNA文库中某些表达丰富 的mRNAs 的克隆数目比较多，在文库中 也有少数的克隆代表稀少mRNAs
AD gene prey gene
prey plasmid
诱饵与靶蛋白之间 的相互作用激活了 报告基因的表达
Gal4激活 Prey (Y)AD Gal域4 Bait (X)BD
结合 operator
LacZ
Repoter gene
第三节 cDNA表达文库的筛选
NH2 NH2
Trp-
Gal4
BD X
RT反mR应NA制备标
记的cDNA 转
转 记的cDNA
膜
膜
杂交获得杂交信号
杂交获得杂交信号
目标基
D、利用差异表达基因的扣除cDNA探 针
扣除杂交P112
A B 剪C 切
A C 用生物素标记
变性、退火
和杂交
B基
过柱
因
进一步构建文库获得目标基因
流 出
第三节 cDNA表达文库的筛选
间的相互作用
研究蛋白质与蛋白质之
• 水相在上层 (contains total 乙醇沉吸R淀取NRNA上A)并清用至水新重管新溶解
• 洗白破碎物以及大片段的基因 组DNA在两相界面
用层析柱分离总 RNA
Lyse cells, and spin to remove large particulates/cell debris
Apply lysate (containing nucleic acids and cellular contaminants) to column with glass
• mRNA from biological samples – Oligo(dT) resins
从生物体内分离 total RNA（有机分离法 ）
Lyse/homogenize cells
加入酚:氯仿:异戊醇到裂解细胞中并离心
Organic phase separates from aqueous phase • 有机相在底层
第一节：将mRNA转变成cDNA
二、cDNA 的合成 A、用polyT作为引物
mRNA G U A A U C C U CAAAAAAAAAAAAAAA
cDNA
Reverse transcriptase
TTTTTTTTTTTTTTT
逆转录polyT引物
B、基因特异的引物
C、随机引物
第一节：将mRNA转变成cDNA
DNA
2´ H (deoxyribose)
Thymine binds Adenine (A,T,C,G)
Multiple types and roles One biological form
Often permanently modified Permanently modifications
via splicing
C、利用同源基因中的目标基因序列
用不同来源的DNA分子制备成探针进行检测。 如：用来自鼠的基因A去检测人类中基因A 或基因家族中成员A去检测成员B
D、利用差异表达基因的扣除cDNA探针
差示杂交P112 表达目标基因
不表达目标基因
提取
RT反应获
提取
RT反应mR制NA备标
得cDNA 获得cDNA文库
• 转运RNA (tRNA): 10-15%. 将mRNA 中的
信息翻译成氨基酸（携带正确的氨基酸）
mRNA特点
信使RNA的表达在生物体内具有组织和时空特异 性。因此， mRNA对于了解细胞中的信息流非常
重要. • Size – examine differential splicing（
检测可变剪接） • Sequence – 预测蛋白产物 • Abundance – 检测表达水平 • Dynamics of expression – 不同的时间、
membrane
用乙醇洗涤柱子，核酸结合在柱子上，其他物质 从侄子中流出。用 DNase 处理污染的DNA
Apply water to the column; purified RNA washes off
the glass and is collected
Messenger RNA Isolation
➢优点：
根据兴趣蛋白的基因序列 即可筛选与
其作用的目的蛋白
蛋白质在真核细胞内，处于天然状态，
蛋白质之间的相互作用符合细胞内情况 ，即使是两种蛋白质的瞬时结合也可被 检测出来
可以直接获得目的蛋白的基因序列，从
而可以初步判断目的蛋白的结构和功能 。
酵母双杂交系统(Yeast Two-hybrid System)
发育阶段和组织的特异性。
第一节：将mRNA转变成cDNA
cDNA：与mRNA互补的DNA，称为cDNA。 由某个生物体的某个器官或组织mRNA反
转录形成的总cDNA，构建形成的基因文 库，称之为cDNA文库
一、mRNA的分离纯化
RNA
2´ OH group (ribose)
Uracil binds Adenine (A,U,C,G)
翻译
三、研究策略
1、制备规范化的野生型cDNA文库
A B CD E F
61234578
G
H K
I L
J
自动 制备 质粒
体外 翻译
A B CD E F G H I
1
JKL
2
3
4
5
6 7 8
检测荧 光信号
突变 体细 荧胞光提反 应取底物物
酵母双杂交技术 噬菌体展示技术
第三节 cDNA表达文库的筛选
1、噬菌体展示技术原理 A、噬菌体展示技术是将多肽或蛋白质的编码基因
或目的基因片段克隆入噬菌体外壳蛋白结构基因 的适当位置，在阅读框正确且不影响其他外壳蛋 白正常功能的情况下，使外源多肽或蛋白与外壳 蛋白融合表达。 B、融合蛋白随子代噬菌体的重新组装而展示在噬 菌体表面。 C、被展示的多肽或蛋白可以保持相对独立的空间 结构和生物活性，以利于靶分子的识别和结合。
• mRNA的 3’ 末端具有polyA 尾巴 • Oligo(dT) 探针用于分离总RNA中的mRNA • mRNA can be eluted from oligo(dT) matrix using water or low-salt buffer
Messenger RNA Isolation
are rare (mutation)
Usually single-stranded Double stranded
Intermolecular binding Double helix structure
第一节：将mRNA转变成cDNA
一、mRNA的分离纯化 RNA在体内具有容易被内切核酸酶（RNase）降解
以及自然降解的特性。分离以及保存RNA需针对 上述特点进行。 加入RNase抑制剂
RNA 分离
RNA 分离
• Total RNA from biological samples
– Organic extraction – Affinity purification
• mRNA from total RNA – Oligo(dT) resins
Bait plasmid
AD gene prey gene
prey plasmid
Gal4 Bait (X)BD 结合 operator 域
BD gene
Bait gene
LacZ
Repoter gene
Gal4 Prey (Y)AD 激活
operator
域
LacZ
Repoter gene
Bait plasmid
如果某个基因有多种拼接方式，在文库 中也有代表该基因不同拼接方式的克隆 。
第一节：将mRNA转变成cDNA
三、cDNA克隆载体 1、根据不同的筛选策略选择 不同的载体 质粒载体：用功能测定的方法进行筛选 噬菌体载体：分子杂交或抗体筛选。 2、噬菌粒载体：是一类人工构建的含有
单链噬菌体包装序列、复制子以及质粒 复制子、克隆位点、标记基因的特殊类 型的载体。