cDNA文库

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cdna文库的构建步骤

CDNA文库是基因组学和转录组学研究中非常常见的技术，它可以用来快速鉴定不同组织或不同生长条件下基因表达的变化情况。下面将介绍CDNA文库的构建步骤。

一、RNA提取

RNA提取是构建CDNA文库的第一步，它是从不同组织或生长条件下采集的样品中提取出RNA。RNA提取需要注意以下几点：

1. 样品必须在冰上保存，并尽可能快地进行处理。

2. RNA提取要使用无菌工具和试剂，并严格遵守操作规程。

3. RNA提取要避免DNA污染，可使用DNase对RNA进行处理。

4. RNA质量要进行检测，以保证后续实验的可靠性。

二、反转录

反转录是将RNA转化为cDNA的过程。反转录需要注意以下几点：

1. 反转录试剂必须新鲜，并且使用前应该预先热处理。

2. 反转录反应时间和温度要根据实验需求进行调整。

3. 可以选择使用随机引物或寡聚dT引物作为反转录引物。

三、二代测序前的PCR扩增

PCR扩增是将cDNA扩增为足够的量以进行二代测序的过程。PCR扩增需要注意以下几点：

1. PCR反应体系要严格控制，避免引物和模板过量。

2. PCR反应时间和温度要根据实验需求进行调整。

3. 可以选择使用高保真PCR酶，以保证扩增产物的准确性。

四、文库构建

文库构建是将PCR扩增产物连接到载体上，形成完整的CDNA文库的过程。文库构建需要注意以下几点：

1. 选择合适的载体，如pBluescript II SK+、pUC19等。

2. 连接PCR扩增产物时要控制连接比例，避免连接过多或过少。

3. 连接后可以进行转化、筛选和纯化等步骤，得到CDNA文库。

cDNA和基因组文库DNA的构建

• 2 . 11. 加入0.1倍体积的3mol/L乙酸钠（pH5.2）和2倍体积的乙醇, 沉淀柱层析洗脱下来的cDNA,将样品置于冰上至少15分钟,然后在微量离心机上以最大速度4℃离心15分钟,回收沉淀DNA.用手提微型监测仪检查,是否所有放射性都沉淀下来. 2 . 12. 用70%乙醇洗涤沉淀物,重复离心. 2 . 13. 小心吸出所有液体,空气干燥沉淀物. 2 . 14. 如果需要用EcoR I甲基化酶对cDNA进行甲基化,可将cDNA 溶解于80μl TE(pH7.6)溶液中.另外,如果要将cDNA直接与Not I或 Sal I接头或寡核苷酸衔接子相连,可将cDNA悬浮在29μl TE(pH7.6) 溶液.沉淀的DNA重新溶解后,尽快进行cDNA合成的下一步骤.
6：cDNA与λ噬菌体臂的连接
• 6 . 1.按下述方法建立4组连接-包装反应： • 连接A(μl)B(μl)C(μl)D(μl)λ噬菌体DNA(0.5μg/μl)1.01.01.01.010×T4DNA连
接酶缓冲液1.01.01.01.0cDNA0 ng5 ng10 ng50 ngT4噬菌体DNA连接酶（105 Weiss单位/ml）0.10.10.10.110 mmol/L ATP1.01.01.01.0加H2O至 10101010连接混合物于16℃培育4~16h.剩余的cDNA储存于-20℃. 6 . 2.按包装提取物厂商提供的方法,从每组连接反应物中取5μl包装到噬菌体颗粒中. 6 . 3.包装反应完成后,在各反应混合物中加入0.5ml SM培养基.

cdna基因文库构建的基本路线

以cdna基因文库构建的基本路线为标题的文章

概述

CDNA基因文库是基因组学研究中的一个重要工具，可以用于克隆和表达特定基因。本文将介绍构建cdna基因文库的基本路线，包括RNA提取、逆转录、cDNA合成、文库构建和筛选等步骤。

第一步：RNA提取

构建cdna基因文库的第一步是从所研究的生物样品中提取总RNA。这可以通过使用商业化的RNA提取试剂盒或经典的酚-氯仿法等方法来实现。在提取RNA的过程中，需要注意样品的保存和处理，以确保所提取的RNA完整无损。

第二步：逆转录

逆转录是将RNA转化为相应的cDNA的过程。逆转录反应通常使用逆转录酶（Reverse Transcriptase）进行，该酶能够将RNA模板上的信息转录成DNA。在逆转录反应中，需要加入随机引物、dNTPs和逆转录酶，以及适当的缓冲液。逆转录反应的温度和时间也需要根据具体的逆转录酶和反应体系进行优化。

第三步：cDNA合成

在逆转录反应完成后，需要对产生的cDNA进行纯化。一种常用的方法是通过酶切和连接反应，将cDNA连接到载体上，形成重组

DNA，再通过转化等方法将其导入到大肠杆菌等宿主中。在cDNA 合成的过程中，需要注意对cDNA的纯化和测序质量的控制，以确保所获得的cDNA具有高质量和完整性。

第四步：文库构建

文库构建是指将cDNA插入到合适的载体中，形成cdna基因文库。常用的载体包括质粒和噬菌体等。在文库构建的过程中，需要对cDNA和载体进行受限酶切，然后使用DNA连接酶将其连接起来。连接后的DNA需要进行转化，将其导入到适当的宿主细胞中，形成文库。不同的文库构建方法有所差异，可以根据实验需求选择合适的方法。

基因组文库和cDNA文库的比较

01
文库构建（原核）
制备基因组DNAቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ片段化
物理学方法：机械类或超声波等生物化学方法：限制酶部分切割
筛选鉴定基因组文库
DNA片段与载体重组连接原核生物基因组较小，一般采用质粒载体或λ载体。
重组DNA导入受体菌细胞并扩增
01
文库构建（真核）
真核生物和原核生物基因组文库构建的原理和过程基本相似，方法有异（原核采用质粒载体或λ载体）。下面介绍三种方法：
假阳性概率低。基因组克隆子复杂，假阳性概率高。
真核生物克隆序列直接应用于基因工程，基因组文库不能。
以mRNA为原料，研究RNA病毒的基因组结构和基因克隆分离。
03
基因组文库优点
基因组文库含有全部基因，
cDNA文库只含有全部蛋白质编码的结构基因
且受材料影响
cDNA文库能反映 mRNA信息，但不能直接获得基因的内含子序列和基因编码区外大量的调控序列信息。需要
引导合成第一链
02
文库构建
双链
合成 D方NA 法
02
文库构建
大肠杆菌
酶降解 RNa取seH 代法
02
文库构建
Oligo
寡聚引物引导法
02
文库构建
PCR法
比较 cDNA文库优点基因组文库优点

第五章_cDNA文库的构建

产生一个大的具有特定序列的 cDNA文库
可产生大量特定基因的 cDNA文库
cDNA产物可能是小的，不具有多聚腺苷的模板也被可利用
产生的cDNA 文库应用范围有限
• 第一链合成过程 3’ 5’ 引物 3’ 5’ 引物 mRNA cDNA 反转录酶 3’ mRNA cDNA第一链碱或RNaseH 5’ 引物 cDNA第一链 5’ 5’ 3’
反转录酶mrnacdnaaaaaaaattttttt在总的rna中可作为具有mrna的特异引物文库不能完全包含基因编码序列产生一个大的具有特定序列的cdna文库cdna产物可能是小的不具有多聚腺苷的模板也被可利用可产生大量特定基因的cdna文库产生的cdna文库应用范围有限第一链合成过程mrnacdna反转录酶引物mrnacdna第一链引物cdna第一链引物或rnaseh剩下的cdna单链的3末端可能形成一个弯回来的双链发卡结构机理不明可成为合成第二条cdna链的引物
三、差示杂交
• 需要两种不同的细胞群体（目的基因正常表达、目的基因不表达），分别制备两种不同mRNA提取物，以两种总mRNA探针（或以相应的cDNA作探针)平行杂交，对有表达目的基因的细胞总mRNA构建的克隆文库进行筛选。
差别杂交的局限性： 1.杂交灵敏度低，对于低峰度的mRNA尤为明显。 2.工作量大，重复性差，两套平行滤膜之间的DNA保有量有差别，导致杂交信号不一致。

cDNA文库和基因组文库比较

cDNA文库:以mRNA为模板，经反转录酶催化,在体外反转录成cDNA，与适当的载体(常用噬菌体或质粒载体）连接后转化受体菌，则每个细菌含有一段cDNA,并能繁殖扩增，这样包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合称为该组织细胞的cDNA文库。

基因组文库: 一个生物体的基因组DNA用限制性内切酶部分酶切后，将酶切片段插入到载体DNA分子中，所有这些插入了基因组DNA片段的载体分子的集合体，将包含这个生物体的整个基因组，也就是构成了这个生物体的基因文库。

基因组DNA文库与cDNA文库的比较：

1 基因组DNA文库的优点相对于cDNA文库，基因组文库的优点：cDNA克隆只能反映着mRNA的分子结构，没有包括基因组的间隔序列，cDNA文库中，不同克隆的分布状态总是反映着mRNA的分布状态，即：高丰度mRNA的cDNA克隆，所占比例较高,分离基因容易;低丰度mRNA的cDNA克隆，所占比例较低，分离基因困难; 从cDNA克隆中，不能克隆到基因组DNA 中的非转录区段序列,不能用于研究基因编码区外侧调控序列的结构与功能.

2 cDNA文库的主要优点：

①cDNA文库以mRNA为材料，特别适用于某些RNA病毒等的基因组结构研究及有关基因的克隆分离。

②cDNA文库的筛选比较简单易行.

③每一个cDNA文库都含有一种mRNA序列，这样在目的基因的选择中出现假阳性的概率就会比较低，因此阳性杂交信号一般都是有意义的,由此选择出来的阳性克隆将会含有目的基因。

④cDNA文库可用于在细菌中能进行表达的基因的克隆,直接应用于基因工程操作.

名词解释 cdna文库

名词解释：cdna文库

cdna文库是指通过反转录将转录本（mRNA）转化为相应的DNA序列，并将其进行克隆、放大保存起来的一种DNA库。cdna文库包含了特定生物体（如人、动物、植物等）在特定条件下的大部分mRNA序列，可以用于研究基因表达、寻找新基因以及研究基因功能。

在构建cdna文库时，首先需从目标生物组织中提取总RNA。然后，利用酶逆转录将mRNA转录成相应的cDNA，并添加适配器序列。接下来，通过PCR反应进行扩增，得到了包含全部mRNA序列的cDNA文库。这些cDNA可以被克隆入载体中，形成cdna文库。

cdna文库的构建对于研究基因表达具有重要意义。通过cdna文库，研究人员可以分离出感兴趣的基因，并进一步探索其在不同组织、不同发育阶段或不同环境条件下的表达情况。此外，cdna文库还可以用于筛选新的基因、研究基因功能以及进行基因工程等领域的研究。

构建cdna文库的基本步骤

《构建cDNA文库的基本步骤》

引言：

cDNA文库的构建是基因组研究中重要的实验技术之一，它可以利用转录酶逆转录RNA为cDNA，然后将其插入适当的载体中，最终形成一个具有表达能力的基因文库。本文将介绍构

建cDNA文库的基本步骤。

一、总RNA的提取

首先，需要从细胞或组织中提取总RNA，并保证RNA的完整性和纯度。常用的提取方法包括

酚/氯仿法、硅胶柱法等。提取得到的总RNA可以用琼脂糖凝胶电泳进行分离和检测。

二、逆转录反应

逆转录反应是将RNA逆转录为cDNA的过程。在逆转录反应中，需使用逆转录酶、引物和核

苷酸等。逆转录酶能合成第一链cDNA，引物通常采用寡聚dT引物或随机引物。

三、DNA合成和连接

在逆转录反应后，需要使用DNA聚合酶和核苷酸进行第二链cDNA的合成。然后，将合成的cDNA连接到选择的载体上，常见的载体有质粒、噬菌体等。连接过程一般采用连接酶催化反应。

四、转化和筛选

将连接好的载体转化到合适的宿主细胞中，可以通过热冲击法、电穿孔法等方法进行转化。之后，将转化后的细胞涂在筛选板上，并在含有抗生素的培养基上筛选，筛选出含有目标基因的

克隆。

五、鉴定和分析

最后，对构建好的cDNA文库进行鉴定和分析。可以利用限制性内切酶等方法进行单克隆检测和鉴定，也可以通过PCR扩增目标基因进行进一步分析。

结论：

构建cDNA文库是一项关键的技术，它为基因组研究提供了丰富的资源。通过提取总RNA、

逆转录反应、DNA合成和连接、转化和筛选，最终可以得到一个具有表达能力的cDNA文库。这些步骤的顺利进行和准确操作，对于后续的基因组研究具有重要意义。

cdna文库

CDNA文库

什么是CDNA文库？

CDNA文库（Complementary DNA Library）是由转录过程中产生的mRNA反转录合成的cDNA构建而成的一系列DNA

片段的集合。CDNA文库可以用于许多生物学研究领域，包括基因表达分析、基因克隆和功能研究等。

cDNA文库的建立过程

1. 提取RNA

在构建CDNA文库之前，首先需要从目标生物（比如细胞、组织或细菌）中提取总RNA。RNA提取方法根据目标生物的

类型和样本的特点会有所不同，常见的RNA提取方法有酚/氯仿法、离心柱法和磁珠法等。

2. 反转录合成cDNA

提取到的总RNA包含了多种mRNA，而mRNA中所含的

信息即为我们所关注的基因表达信息。为了将mRNA转化为cDNA，在反转录反应中需要使用逆转录酶（reverse transcriptase）以RNA作为模板合成相应的单链cDNA。反转

录酶能够将RNA中的核苷酸逆向合成cDNA，同时还需要引物，通常使用随机引物（random primer）或寡聚dT引物（oligo(dT) primer）。

3. 第二链合成

合成的cDNA为单链结构，需要通过第二链合成（second strand synthesis）制备出双链cDNA。第二链合成的方法一般采用DNA聚合酶（DNA polymerase）和RNase H（用于降解RNA模板）的组合反应。

4. 文库构建

构建CDNA文库的关键步骤是将合成的双链cDNA插入载体DNA中。载体DNA通常选择质粒（plasmid）或噬菌体（bacteriophage）等。具体步骤如下：

关于cDNA文库

1 cDNA 文库的构建

1.1 cDNA 文库构建的基本原理与方法

cDNA 文库是指某生物某发育时期所转录的全部mRNA 经反转录形成的cDNA 片段与某种载体连接而形成的克隆的集合。经典cDNA 文库构建的基本原理是用Oligo(dT) 作逆转录引物，或者用随机引物，给所合成的cDNA 加上适当的连接接头，连接到适当的载体中获得文库。其基本步骤包括：RNA 的提取(例如异硫氰酸胍法，盐酸胍—有机溶剂法，热酚法等等，提取方法的选择主要根据不同的样品而定)，要构建一个高质量的cDNA 文库，获得高质量的mRNA 是至关重要的，所以处理mRNA 样品时必须仔细小心。由于RNA 酶存在所有的生物中，并且能抵抗诸如煮沸这样的物理环境，因此建立一个无RNA 酶的环境对于制备优质RNA 很重要。在获得高质量的mRNA 后，用反转录酶Oligo(dT) 引导下合成cDNA 第1链，cDNA 第2链的合成(用RNA 酶H 和大肠杆菌DNA 聚合酶I，同时包括使用T4 噬菌体多核苷酸酶和大肠杆菌DNA 连接酶进行的修复反应)，合成接头的加入、将双链DNA 克隆到载体中去、分析cDNA 插入片断，扩增cDNA 文库、对建立的cDNA 文库进行鉴定。这里强调的是对载体的选择，常规用的是λ 噬菌体，这是因为λ DNA 两端具有由12个核苷酸的粘性末端，可用来构建柯斯质粒，这种质粒能容纳大片段的外源DNA。

1.2 cDNA 全长文库

经典cDNA 文库的构建虽然高效、简便，但文库克隆的片段一般较小，单个克隆上的DNA 片段太短，所能提供的基因信息很少，大多需要几个克隆才能覆盖一个完整的全基因的cDNA。为了克隆到真正的cDNA 全长，建立富含全长的cDNA 文库具有重要意义。为此，必须克服仅用mRNA 的PolyA 尾合成以及由普通逆转录酶作用特点所导致的局限性。全长cDNA 文库，是指从生物体内一套完整的mRNA 分子经反转录而得到的DNA 分子群体，是mRNA 分子群的一个完整的拷贝。全长cDNA 文库不仅能提供完整的mRNA 信息，而且可以通过

cDNA文库

克隆
将合成的双链重组到质粒载体或噬菌体载体上，转化大肠杆菌寄主细胞增殖。 1．同聚物加尾法利用小牛胸腺末端转移酶在双链cDNA和质粒载体的3'-端都加上一个互补的同聚片段，通过退火使两个片段连接成重组质粒，再将重组质粒转化受体细胞。同聚物加尾法克隆双链cDNA 2．接头-衔接头法 3．mRNA-cDNA克隆法方法：在mRNA反转录合成cDNA第一链后，将dA残基加到mRNA：cDNA杂交体上，然后与带dT尾的克隆载体连接，转化受体细胞，在宿主细胞内，mRNA被降解并代之以DNA。缺点：克隆的效率低（为双链cDNA克隆的1/10）
1．Oligotex mRNA Kits（QIAGEN）法准备工作： 1．将Oligotex Suspension置于37℃水浴中，旋转混匀，溶解Oligotex，然后置于室温。 2．将OBB Buffer置于37℃水浴中，旋转混匀，重溶沉淀物，然后置于室温。 3．将OEB Buffer置于70℃水浴中，待用。试验步骤：表3：加入试剂量据此表 1．Total RNA量不要多于1mg，用移液器取出所需RNA量到1.5ml离心管中，加RNase-free water补足到 500ul。 2．根据表3加入适当体积的OBB Buffer和Oligotex Suspension，轻弹1.5ml离心管彻底混匀。 3．置于70℃水浴中3min。 4．取出置于室温（20℃－30℃）10min。

cDNA

遗传控制中最大的困难并不是DNA的克隆，而是需要被克隆的特异DNA片段的分离。如果以克隆基因为目的，特异DNA片段的分离将大大有助于获得与遗传信息同样多的相关的基因产物，一般说这些基因产物均为蛋白质多肽，因此抗该蛋白质的抗体对于测定和沉淀蛋白质及其前体有重要用途，甚至可用于了解蛋白质分子量。
制备
制备互补DNA，往往需要先分离从目的基因转录来的mRNA.如果该基因编码的蛋白质是细胞中的主要蛋白质，则此基因的产物是总mRNA的主要组成部分。就胰岛B细胞而论，此细胞含有高水平胰岛素前体mRNA，后者有时可以沉淀正在翻译的mRNA的核糖核蛋白体，如果用特异抗体结合所表达的蛋白质(抗原)，则可从沉淀的核糖体中分离出胰岛素特异的mRNA，一般特异mRNA只是细胞总mRNA中的次要成分。在这种情况下，不得不以密度梯度离心，按分子量大小把总mRNA分开，然后把分离开的mRNA直接用于试管中表达蛋白质(用家兔织细胞的溶胞产物或小麦胚芽提取物作为翻译系统的诱导物)再用免疫沉淀或聚丙烯酰胺凝胶电泳从许多表达的蛋白中测定出目的蛋白，从而确定表达该蛋白的特异mRNA。
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合成步骤
1．cDNA第一链的Βιβλιοθήκη Baidu成
所有合成cDNA第一条链的方法都要用依赖于RNA的DNA聚合酶(反转录酶)来催化反应，主要有两个关键因素，一个是mRNA模板，另一个是反转录酶。商品化反转录酶有从禽类成髓细胞瘤病毒纯化到的禽类成髓细胞病毒（AMV）逆转录酶和从表达克隆化的Moloney鼠白血病病毒反转录酶基因的大肠杆菌中分离到的鼠白血病病毒（MLV）反转录酶。AMV反转录酶包括2个具有若干种酶活性的多肽亚基，这些活性包括依赖于RNA的DNA合成，依赖于DNA的DNA合成以及对DNA-RNA杂交体的RNA部分进行内切降解（RNA酶H活性）。MLV反转录酶只有单个多肽亚基，兼备依赖于RNA和依赖于DNA的DNA合成活性，但降解DNA—RNA杂交体中的RNA的能力较弱。且其热稳定性较 AMV反转录酶差。MLV反转录酶能合成较长的eDNA（如大于2～3kb）。AMV反转录酶和MI。V反转录酶利用RNA模板合成cDNA时的最适pH、最适盐浓度和最适温度各不相同．所以合成第一链时相应调整条件是非常重要的。

cDNA文库的构建

基因文库的构建是现代生命科学研究中的一项重要技术。自70年代初首例cDNA克隆问世以来，已用构建和筛选cDNA文库的方法克隆了很多基因。通过构建cDNA文库能直接分离到生命活动过程中的一些调控基因及了解这些基因所编码的蛋白质的相互作用关系．因此cDNA文库的构建是基因克隆的重要方法之一，从cDNA文库中可以筛选到所需的目的基因，并直接用于该目的基因的表达。它是发现新基因和研究基因功能的工具。

1.cDNA文库构建的原理

真核生物基因的结构和表达控制元件与原核生物有很大的不同。真核生物的基因是断裂的，在基因最后产物中表达的编码序列（外显子）被非编码序列（内含子）分隔开，需经RNA转录后加工过程才使编码序列拼接在一起。真核生物的基因不能直接在原核生物中表达，只有将加工成熟的mRNA经逆转录合成互补的DNA（complementary DNA,cDNA）接上原核生物表达控制元件，才能在原核生物中表达。而且，真核细胞的基因通常只有一小部分进行表达，由于mRNA的不稳定性，对基因表达和有关mRNA都常通过对其cDNA来进行研究。为分离cDNA克隆或研究细胞的cDNA 谱，需要先构建cDNA文库。所谓cDNA文库是指细胞全部mRNA逆转录成cDNA并被克隆的总和。

cDNA文库应包含的克隆数目可由以下公式来计算：

N=ln(1-p)/ln(1-1/n)

式中：N－cDNA文库所包含的克隆数目；

P－低丰度cDNA存在于库中的概率，通常要求其大于99％；

1/n－每一种低丰度mRNA占总mRNA的分数。

cDNA文库

以生物细胞的总mRNA为模板，用逆转录酶合成互补的双链cDNA，然后连接到载体上，转化宿主细胞后构建的基因文库，就是cDNA文库。

真核细胞的基因组的大多数结构基因是不连续的，也就是说，真核细胞的基因一般由有编码功能的外显子和无编码功能的内含子以约1∶4的比例构成，所以在原核生物系统中表达真核生物的基因时，必须首先去掉真核生物基因中的内含子序列，再由mRNA逆转录得到的cDNA即已不再含有这种内含子序列。然后以mRNA为模板，一般先分离细胞中的总RNA，用亲和层析法分离出mRNA，再对mRNA按大小分级，使mRNA具有适当的长度。接下来对mRNA的翻译活性进行检验。检验方法一般是用麦胚或兔网织红细胞体外翻译系统，有时也用蛙卵系统。

得到有翻译活性的RNA后，以此为模板，通过逆转录酶和多聚酶的合成作用形成与mRNA互补的DNA即cDNA。逆转录酶是一种核糖核酸（RNA）依赖性的脱核糖核酸（DNA）聚合酶。把cDNA装入适当的载体，即获得目的基因的双链DNA。

例如珠蛋白基因的获得，是以ploy（A）的mRNA为模板，通过逆转录酶的作用，合成带poly（T）的cDNA，然后在DNA聚合酶的作用下，以

cDNA为模板合成双链DNA。最后用S1核酸酶把poly（T）切除，变成一个完整的珠蛋白基因（图5．5）。这是目前应用广泛的一种获得目的基因的方法。

文库构建-cDNA文库-多肽文库-抗体文库

1）简介

2）应用

3）构建流程

多肽文库

1）简介

2）应用

3）构建流程

4）案例分享

抗体文库

2）单链抗体文库

3）纳米抗体文库

cDNA 文库在研究具体某类特定细胞中基因组的表达状态及表达基因

的功能鉴定方便具有特殊的优势，从而使它在个体发育、细胞分化、

细胞周期调控、细胞衰老和死亡调控等生命现象的研究中具有更为广

泛的应用价值，是研究工作中最常使用到的基因文库。

包括动物cDNA 文库，植物cDNA 文库，逆境相关文库等。应用

将mRNA 在体外反转录成cDNA ，与适当质粒载体连接后转化受体菌，

进行繁殖扩增，最终获得包含组织或细胞全部mRNA 信息的cDNA 克

隆群体称为cDNA 文库。

简介

蛋白-蛋白互作，GPCR 配体筛选，核酸结合，药物研发，酶

底物或抑制剂筛选，信使分子研发及多肽/蛋白信号对答，抗原表位筛选，蛋白功能分析。

应用多肽文库，简称肽库，是一系列不同多肽的组合。

简介

1.随机合成6个氨

基酸片段 3.质粒转化大肠杆菌

4.文库鉴定

2.随机片段与pGADT7（lineared ）同源重组

案例分享

通过PCR的方法以酸敏感离子通道（ASICs）的选择性抑制剂PcTx1为框架，构建完成了一个库容量为3.05×10^6的随机五肽文库。随机挑选了30个单克隆进行随机文库的丰度测试，测序结果表明随机文库中90%的序列符合实验设计的初衷，且30个单克隆中没有重复序列，证明了所构建的随机文库具有较好的丰度。

参考文献：李文颖.活性小分子多肽的筛选与表达[D].国防科技大

学,2018.DOI:10.27052/ki.gzjgu.2018.000392.

CDNA文库

以mRNA为模板，经反转录酶催化，在体外反转录成cDNA，与适当的载体（常用噬菌体或质粒载体）连接后转化受体菌，则每个细菌含有一段cDNA，并能繁殖扩增，这样包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合称为该组织细胞的cDNA文库。基因组含有的基因在特定的组织细胞中只有一部分表达，而且处在不同环境条件、不同分化时期的细胞其基因表达的种类和强度也不尽相同，所以cDNA文库具有组织细胞特异性。cDNA文库显然比基因组DNA文库小得多，能够比较容易从中筛选克隆得到细胞特异表达的基因。但对真核细胞来说，从基因组DNA文库获得的基因与从cDNA文库获得的不同，基因组DNA文库所含的是带有内含子和外显子的基因组基因，而从cDNA文库中获得的是已经过剪接、去除了内含子的cDNA。真核生物基因组DNA十分庞大,其复杂程度是蛋白质和mRNA的100倍左右,而且含有大量的重复序列. 采用电泳分离和杂交的方法,都难以直接分离到目的基因.这是从染色体DNA为出发材料直接克隆目的基因的一个主要困难. 高等生物一般具有105种左右不同的基因,但在一定时间阶段的单个细胞或个体中,都尽有15%左右的基因得以表达,产生约15000种不同的mRNA分子.可见,由mRNA出发的cDNA克隆,其复杂程度要比直接从基因组克隆简单得多.编辑本段定义 (cDNA Library) 某种生物基因组转录的全部mRNA经反转录产生的cDNA片段分别与克隆载体重组，并将其引入到相应的宿主细胞中（一般为E.coli.）繁殖和扩增，理论上此群体就包含有该物种的全部mRNA信息，称该生物基因组的cDNA文库。编辑本段原理 :将带poly(A)的mRNA经酶促反应转变为双链DNA,再与原核载体连接.编辑本段制备用于克隆cDNA的mRNA 1,mRNA的制备动物细胞mRNA的制备植物细胞mRNA的制备 2,mRNA的来源选用mRNA含量高的组织材料,或通过药物等方法提高mRNA的含量 3,mRNA完整性的检测 1)mRNA在无细胞翻译体系指导合成高分子量蛋白质的能力。无细胞翻译系统(Cell-free translation system)，又叫体外转录-翻译的偶联系统,因为该系统需要制备无细胞提取物,还有人称之为"溶胞粗制品翻译系统". 无细胞提取物的制备: 用机械的,超声波的,渗透压或用适当的去污剂等方法,将细胞溶破,再高速离心出去其质膜与细胞核等.该提取液中含有RNA聚合酶,核糖体,tRNA和能量发生系统. 常见的体外无细胞翻译系统: 兔网织红细胞系统。网织红细胞无细胞核,其合成的蛋白质90%以上为珠蛋白. 缺点:已含有珠蛋白mRNA.可以在该体系中加入微球菌核酸酶和Ca2+,可很快分解,除去体系中的珠蛋白mRNA . 麦胚系统