cDNA文库

cDNA文库

以mRNA为模板，经反转录酶催化，在体外反转录成cDNA，与适当的载体（常用噬菌体或质粒载体）连接后转化受体菌，则每个细菌含有一段cDNA，并能繁殖扩增，这样包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合称为该组织细胞的c DNA文库。基因组含有的基因在特定的组织细胞中只有一部分表达，而且处在不同环境条件、不同分化时期的细胞其基因表达的种类和强度也不尽相同，所以cDNA文库具有组织细胞特异性。cDNA文库显然比基因组DNA文库小得多，能够比较容易从中筛选克隆得到细胞特异表达的基因。但对真核细胞来说，从基因组DNA文库获得的基因与从cDNA文库获得的不同，基因组DNA文库所含的是带有内含子和外显子的基因组基因，而从cDNA文库中获得的是已经过剪接、去除了内含子的cDNA。

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cDNA文库

真核生物基因组DNA十分庞大,其复杂程度是蛋白质和mRNA的100倍左右,而且含有大量的重复序列. 采用电泳分离和杂交的方法,都难以直接分离到目的基因.这是从染色体DNA为出发材料直接克隆目的基因的一个主要困难.

高等生物一般具有105种左右不同的基因,但在一定时间阶段的单个细胞或个体中,都尽有15%左右的基因得以表达,产生约15000种不同的mRNA分子.可见,由mR NA出发的cDNA克隆,其复杂程度要比直接从基因组克隆简单得多.

定义: (cDNA Library)

某种生物基因组转录的全部mRNA经反转录产生的cDNA片段分别与克隆载体重组,储存于某种受体菌中,该群体就称该生物基因组的cDNA文库.

原理

:将带poly(A)的mRNA经酶促反应转变为双链DNA,再与原核载体连接.

一,制备用于克隆cDNA的mRNA

1,mRNA的制备

动物细胞mRNA的制备

植物细胞mRNA的制备

2,mRNA的来源

选用mRNA含量高的组织材料,或通过药物等方法提高mRNA的含量

3,mRNA完整性的检测

1)mRNA在无细胞翻译体系指导合成高分子量蛋白质的能力。无细胞翻译系统(C ell-free translation system)，又叫体外转录-翻译的偶联系统,因为该系统需要制备无细胞提取物,还有人称之为"溶胞粗制品翻译系统".

无细胞提取物的制备:

用机械的,超声波的,渗透压或用适当的去污剂等方法,将细胞溶破,再高速离心出去其质膜与细胞核等.该提取液中含有RNA聚合酶,核糖体,tRNA和能量发生系统.

常见的体外无细胞翻译系统:

兔网织红细胞系统。网织红细胞无细胞核,其合成的蛋白质90%以上为珠蛋白.

缺点:已含有珠蛋白mRNA.可以在该体系中加入微球菌核酸酶和Ca2+,可很快分解,除去体系中的珠蛋白mRNA .

麦胚系统

用组织捣碎机将麦子捣碎,分离出麦胚.然后将粗制的麦胚加10倍体积的缓冲液与砂子共研磨.23000g离心所得的上清夜称为S23 ;将S23分装,保存于-20°C冰箱中.

利用麦胚系统进行蛋白质翻译合成研究时,需加的物质与网织红细胞系统相似.由于该体系无mRNA,所以必须加入mRNA.

优点:适于研究mRNA,活力强,价格低廉等.

缺点:不同制品的活性差别较大,且合成分子量较大(71X105 Dal)的蛋白质时往往提前终止.

哺乳动物mRNA在红细胞裂解液中翻译

*SDS-PAGE analysis of proteins translated by cell-free translation syste m. Lane 1: protein marker; Lane 2,without mRNA; Lane 3 to 7: translation p roducts of total mRNA from mammalian cells

2) mRNA在无细胞体系中指导合成目的多肽的能力

3)mRNA分子的大小

哺乳动物mRNA长度为500-8000bp,大部分mRNA位于1.5-2.0kb之间.

4) 总mRNA指导合成cDNA第一链长分子的能力

利用哺乳动物细胞提取的poly(A)+RNA合成cDNA

*Lane 1: -HindIII-EcoRI; Lane 2: the first chain of cDNA;

Lane 3: the second chain of cDNA; Lane 4: -HindIII

4,mRNA在细胞中的丰度

1) 高丰度mRNA

目的mRNA在细胞中的含量占细胞质总mRNA量的50-90%, 该类mRNA在合成和克隆cDNA之前不需进一步纯化特定mRNA .

2) 低丰度mRNA

目的mRNA在细胞中的含量占细胞质总mRNA量的0.5%以下.

5,mRNA的富集方法

典型的哺乳动物细胞含有10,000-30,000种不同的mRNA分子,某些mRNA分子在细胞内的拷贝数很低甚至只有一个拷贝.

mRNA的丰度与文库克隆子数的关系

ln(1-P)

N= ln(1-1/n)

N: 所需克隆数; P: 要求的概率; n:一种mRNA在总mRNA中的相对比例

1) 按大小对mRNA进行分级分离

* 通过琼脂糖凝胶电泳分离大小不同的mRNA分子,该方法的分离效果最好,但从凝胶中回收的得率较低.

* 蔗糖梯度离心:加入破坏RNA二级结构的变性剂如氢氧化甲基汞等,再进行蔗糖梯度离心以分离不同分子量的mRNA.

2) cDNA的分级分离

* mRNA通过反转录形成cDNA,在插入到克隆载体前,通过琼脂糖凝胶电泳,将不同大小的cDNA分子分离开来.

* 优点:

a)避免了分离过程中mRNA被污染的RNA酶降解

b)增加了获得全长cDNA克隆的概率

c)获得更准确的分级分离效果(分子量)

3)多聚核糖体免疫学纯化法

* 使用抗体来纯化合成目的多肽的多聚核糖体.将正在合成的新生多肽链的多聚核糖体结合到免疫亲和柱(A蛋白-Sepharose柱)上,随后用EDTA将多聚核糖体解离下来,并通过Oligo(dT)层析分离mRNA, 利用该方法可将目的mRNA纯化数千倍. 目的mRNA在细胞中的含量可为数十拷贝.

二,cDNA第一链的合成

oligo(dT)引导的DNA合成法:

利用真核mRNA分子所具有的poly(A)尾巴的特性,加入12-20个脱氧胸腺嘧啶核苷组成的oligo(dT)短片段,由反转录酶合成cDNA的第一链.

缺陷:

因为逆转录酶无法到达mRNA分子的5'-末端,必须从3'-末端开始合成cDNA.对于大分子量的较长的mRNA分子而言,特别麻烦.

随机引物引导的cDNA合成法(randomly primed cDNA synthesis) :

根据许多可能的序列,合成出6-10个核苷酸长的寡核苷酸短片段(混合物),作为合成第一链cDNA的引物.在应用这种混合引物的情况下,cDNA的合成可以从mRNA模板的许多位点同时发生,而不仅仅从3'-末端的oligo(dT)引物一处开始.

三,cDNA第二链的合成

1,自身引导合成法:

单链cDNA的3'端能够形成发夹状的结构作为引物,在大肠杆菌聚合酶I Klenow 或反转录酶的作用下,合成cDNA的第二链.

缺点:

在以S1核酸酶切割cDNA的发夹状结构时,会导致对应于mRNA 5'端的地方的序列出现缺失和重排. S1核酸酶的纯度不够时,会偶尔破坏合成的双链cDNA分子.

自身引导法合成双链cDNA

2,置换合成法

原理: