DNA指纹图技术分析微生物肥料菌种组成稳定性
生物工艺学课件 基因工程菌的稳定性问题
第七章基因工程菌发酵第二节工程菌的稳定性问题近年来，重组DNA技术（基因工程）已开始由实验室走向工业生产。
现在，由工程菌产生的珍稀药物如：胰岛素、干扰素、人生长激素、乙肝表面抗原等等都已先后供应市场，基因工程不仅保证了这些药物的来源，而且可使成本大大下降，但是从许多研究中发现，工程菌的保存过程中及发酵生产过程中表现出不稳定性，因而工程菌的稳定性的解决已日益受到重视并成为基因工程这一高技术的成就转变为生产力的关键之一。
一、工程菌不稳定性的表现（倾向）工程菌的不稳定实际上包括质粒的不稳定及其表达产物的不稳定两个方面。
具体表现为下列三种形式：质粒的丢失；重组质粒发生DNA片段脱落；表达产物不稳定。
由于某种环境因素或生理、遗传学上的原因，质粒从某些宿主细胞中丢失（消除curing），丢失率因环境、宿主、质粒结构而有不同。
由于质粒的丢失，工程菌的发酵过程实际上是两种菌的混合物。
在非选择性条件下，含有重组质粒的工程菌的比生长速率（μ+）往往小于不含重组质粒的比生长速率（μ-）。
宿主细胞的生长优势对工程菌的发酵极为不利。
有时质粒不稳定并非由于质粒丢失的缘故，而是重组质粒上一部分片段脱落，表现为质粒变小或某些遗传信息发生变化甚至丧失。
表达产物不稳定也是一个很重要的问题。
发现人干扰素工程菌在表达干扰素时，随着培养时间的延长，干扰素活性反而下降。
这种情况在别的工程菌培养过程中也有发现。
二、引起工程菌不稳定性的一些因素及对策组建成的工程菌的稳定与否，取决于重组质粒本身的分子组成、宿主细胞生理和遗传性及环境条件等三个方面。
就质粒本身的分子结构而言，引起工程菌不稳定常常是由于稳定区受到影响。
某些质粒如PSC101、R1、F等的分配系统在质粒上的位置已经确定，质粒col DF13有两个DNA序列part A, part B对它的稳定起着不可缺少的作用。
枯草杆菌质粒pUB110上几个与膜结合的蛋白基因对稳定性有关。
如质粒在重组过程中影响到这些序列的完整性，则其稳定性也受影响，另外可能由于重组质粒上有重复序列，或与宿主染色体有部分同源等等都会造成质粒的不稳定。
4DNA fingerprinting实验4 DNA指纹图谱分析
实验4 DNA 指纹图谱分析4.1 相 关 基 础 知 识1984年英国莱斯特大学的遗传学家Jefferys 及其合作者首次将分离的人源小卫星DNA 用作基因探针，同人体核DNA 的酶切片段杂交，获得了由多个位点上的等位基因组成的长度不等的杂交带图纹，这种图纹极少有两个人完全相同，故称为"DNA 指纹"，意思是它同人的指纹一样是每个人所特有的。
DNA 指纹的图像在X 光胶片中呈一系列条纹，很像商品上的条形码。
DNA 指纹图谱，开创了检测DNA 多态性（生物的不同个体或不同种群在DNA结构上存在着差异）的多种多样的手段，如RFLP （限制性内切酶酶切片段长度多态性）分析、串联重复序列分析、RAPD（随机扩增多态性DNA ）分析等等。
各种分析方法均以DNA 的多态性为基础，产生具有高度个体特异性的DNA 指纹图谱，由于DNA 指纹图谱具有高度的变异性和稳定的遗传性，且仍按简单的孟德尔方式遗传，成为目前最具吸引力的遗传标记。
DNA 指纹具有下述特点：1．高度的特异性：研究表明，两个随机个体具有相同DNA 图形的概率仅3×10－11；如果同时用两种探针进行比较，两个个体完全相同的概率小于5×10－19。
全世界人口约50亿，即5×109。
因此，除非是同卵双生子女，否则几乎不可能有两个人的DNA 指纹的图形完全相同。
2．稳定的遗传性：DNA 是人的遗传物质，其特征是由父母遗传的。
分析发现， DNA 指纹图谱中几乎每一条带纹都能在其双亲之一的图谱中找到，这种带纹符合经典的孟德尔遗传规律，即双方的特征平均传递50％给子代。
3．体细胞稳定性：即同图1. DNA 指纹图谱的孟德尔方式遗传图 2 传统指纹鉴定技术(a)和DNA 指纹图谱鉴定技术(b)一个人的不同组织如血液、肌肉、毛发、精液等产生的DNA指纹图形完全一致。
1985年Jefferys博士首先将DNA指纹技术应用于法医鉴定。
微生物群落基因指纹分析
RFLP 和 ARDRA
限制性片段长度多态性和扩增rRNA片段限制 性分析都能用于微生物群落的特征分析。将 16S rDNA 片短用通用引物进行PCR扩增，再 用限制性酶消化，然后通过琼脂糖或聚丙烯酰 胺胶电泳，最后进行显色，即可进行分析。
Martinez-Murcia 等用RFLP分析16S rDNA 片 段的PCR扩增产物来评估多盐池塘的原核生物 的多态性。
RAPD和DAF
随机扩增多态性DNA（RAPD）被用于跟踪不同土壤 微生物群落对2，4—D的反应。Breen et等用一个相似 的方法，名字叫做DNA扩增指纹法（DAF） ，来比 较不同生物反应器中的微生物群落，以及一个生物反 应器中的群落变化。这两种方法都用来5-10碱基的随 机引物，这些随机引物在基因组DNA的不同部位复性， 使PCR产物分生出不同的长度。产物在琼脂糖胶或聚 丙烯酰胺凝胶中进行分离，然后用EB染色或银染显示 出条带。
SSCP
单链构象多态性技术通过特异引物扩增DNA 片段，将PCR产物变性后直接在非变性胶中电 泳。
分离基于单链DNA的不同的折叠构象，因此 影响电泳迁移率。
Lee 和 coworkers用此技术来研究天然细菌群 落的结构和多样性。 Schwieger 和 Tebbe 用 PCR-SSCP来分析不同植物根际的微生物群落。
无法获得种系发生信息; 重复性差
Bb-PEG 简单；不需要昂的设 备
RFLP/ARD 直接；不需要昂的设
RA
备
低分辨率；Bb-PEG 染料比较难获 得
很多条带与群落成员无关
TRFLP
高分辨率;泳道内标 记;直接定量分析片 段
无法获得种系发生信息，设备昂贵
讨论
基因指纹技术用于研究不同微生物群体的遗传 差异、环境变化之后对细菌群落的变化的监视 既简便又快速。这些技术都能用于描述性技术 分析，而且只有几种方法，如LMW RNA指纹、 DGGE、SSCP，能通过杂交分析或分离条带的 序列分析对群落成员进行进一步的鉴定。基因 指纹技术的发展将使的越来越多多工作在微生 物生态方面的科学家产生浓厚的兴趣。
DNA指纹的遗传分析实验报告
DNA指纹的遗传分析实验报告一、实验材料和方法1.实验材料聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖、TAE缓冲液、DNA分子量标准品、对照DNA样品、不同个体DNA样品等。
2.实验步骤（1）样本提取：将不同个体组织或细胞样本加入含有蛋白酶K的裂解缓冲液中，室温摇晃10min后，在65℃水浴中处理1h。
（2）PCR扩增：选取用于DNA指纹的多态性基因座，按照实验方案设计引物，将扩增产物放入PCR酶切反应体系中，在相应酶切后产生DNA片段。
（3）凝胶电泳：将PCR扩增产物注入聚丙烯酰胺凝胶槽中，在电泳仪中进行离子运移和染色等步骤，观察和比对不同样品DNA的图像，得出遗传信息。
二、实验结果和分析实验结果如表1所示：表1 PCR扩增产物长度和样品DNA中的差异不同样品间的PCR扩增产物长度基本相同无明显差异，样品2的信号较弱，可能是样品不纯或程序操作失误导致扩增效率较低。
结果表明PCR扩增产物长度仅与多态性基因座的碱基序列有关，不同个体的产物长度并不一定相同，只有相同个体的PCR扩增产物长度相同。
图1 DNA指纹凝胶图由图1可知，A1、B1、C1三个个体样品所在的条带位置相同；A2、B2、C2三个个体样品所在的条带位置也基本相同。
但A1、A2间、B1、B2间、C1、C2间的PCR扩增产物长度存在明显差异，因此可以对这些个体进行有效的分类。
不同个体之间的差异源于其DNA序列不同，表现为PCR扩增的产物长度不同，电泳分离的条带位置不同。
图中的分子量标准品可以用来判断不同PCR产物的分子量大小，从而得出其绝对或相对分子量大小。
三、实验结论通过实验可知，DNA指纹分析是一种高效、准确、敏感、可靠的遗传分析方法，具有独特的特征与广泛的应用价值。
在亲缘鉴定、犯罪侦查、动物分类等领域均有重要的应用。
本实验通过PCR扩增和凝胶电泳等技术方法，成功地提取、扩增和分离了不同个体样品中的DNA分子，得到了对不同个体DNA序列的可视化展示，并验证了其在鉴定、分类、比对等领域的实用价值。
dna指纹名词解释
DNA指纹名词解释1. 引言DNA指纹是一种针对个体的特定DNA序列进行分析的技术，可用于识别个人身份、确定亲子关系、破解罪案等。
本文将详细解释DNA指纹的定义、原理、应用以及优缺点等相关内容。
2. DNA指纹的定义DNA指纹是DNA序列的一种特征模式，通过分析DNA的多态性位点来进行识别和比对。
DNA指纹是个体间DNA序列的差异性，与人类每个个体具有唯一的DNA序列一样。
DNA指纹通常由DNA分析技术得出，其结果以特定的字符串表示，被称为DNA 指纹图谱。
3. DNA指纹的原理DNA指纹的原理基于DNA的两个特征：遗传稳定性和多态性。
遗传稳定性指的是个体DNA序列在遗传传递过程中基本保持不变，因此DNA指纹可用于确定亲子关系。
多态性指的是DNA序列中存在大量变异位点，这些位点的差异可以用于个体识别。
DNA指纹分析的步骤主要包括DNA提取、DNA扩增、PCR产物分析和电泳分析。
首先，从样本中提取DNA，通常使用血液、唾液或者毛发等。
然后，使用聚合酶链反应（PCR）技术对DNA进行扩增，选择特定的位点进行扩增。
接下来，通过电泳技术将扩增产物进行分离，并通过染色剂对不同长度的DNA片段进行染色。
最后，通过与基因座库中的DNA指纹图谱进行比对，确定个体的DNA指纹。
4. DNA指纹的应用4.1 个体识别DNA指纹是一种有效的个体识别方式，可用于刑事调查、人员鉴定等领域。
通过与数据库中的DNA指纹图谱进行比对，可以确定个体的身份，从而为司法系统提供准确的证据。
4.2 亲子鉴定DNA指纹在亲子鉴定中发挥着重要作用。
通过比对儿童与父母的DNA指纹，可以确定亲子关系。
这对于解决争议的亲子鉴定案件、调解家庭纠纷等具有重要意义。
4.3 疾病诊断和预测DNA指纹也可用于疾病的诊断和预测。
某些遗传病和病态突变与特定的DNA序列有关，通过分析DNA指纹，可以帮助医生确定疾病的患病风险，提供个性化的治疗方案。
4.4 品种鉴定和物种鉴别DNA指纹不仅可以用于个体识别，还可以用于品种鉴定和物种鉴别。
利用DGGE指纹图谱技术考察不同营养条件下土壤微生物群落结构的变化
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Ｄｉｃ ｓ ｉ ｎ ｏ ｓ ｕ ｓ ｏ ｎ Ｃｈａ ｇ ｓ ｏ ｏ ｌＭ ｉ ｒ ｂ ａ ｍ ｍ ｕ ｔ ｎ ｅ ｆＳ ｉ ｃ ｏ ｉ ｌＣｏ ｎ ｎｉｙ ｇ
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ｂ ｉ ｙ Ｕｓｎｇ ＤＧＧＥ ｎ ｅ ｆ ｅ ｅ ｔ ｉｉ ｎ ｌＣｏ ｄ ｔｏ ｕ ｄ ｒ Ｄｉｆ ｒ ｎｔＮｕ ｒ ｔｏ ａ ｇ ｎ ｉｉ ｎ
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ＸＩ ＡＮＧ ａ ｇ ｍｉｇ，Ｗ ＡＮＧ ｈ ｎ ｌ Ｉ Ｈｏ ｇ ｔｏ，Ｊ ＡＮＧ ｎ — ｎ Ｇｕ ｎ — ｎ Ｃ ｕ —ｉ Ａ ｎ —ａ ，Ｊ Ｉ Ｕ Ｐｉｇ ａ
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物 群落 的基 因多 样 性 。经 过 直 接从 土壤 中抽 提 总 ＤＮ 并 对 总 ＤＮ 中 １ Ｓｒ Ａ 及 其 中 ｍ ～ Ｖｓ 变 区 序 列 作 Ａ， Ａ ６ ＤＮ Ｖｅ 可
Ｐ Ｒ扩 增 、 性 梯 度 凝 胶 电 泳 （ ＧＧ ） 析 等 ， 现 不 同处 理条 件 下 的 土 壤 微 生 物 的 基 因 多 样 性 变 化 与 土 壤 微 生 Ｃ 变 Ｄ Ｅ分 发 物 量 的波 动 并 不 一 致 ， 明微 生物 群 落 多 样 性 与 微 生 物 量 的关 系并 非 线 形 。 同时 发 现 秸 秆Ｓ 添 加 更 有 利 于 土 壤 微 说 的
DNA指纹图谱技术在土壤微生物多样性研究中的应用
DNA指纹图谱技术在土壤微生物多样性研究中的应用摘要：基因指纹图谱技术是基于基因在长度、成分和结构上的多态性，利用电泳方法将复杂的PCR扩增片断分离成简单的基因条带图谱，然后根据条带信息进行基因分析的技术，能比较精确地揭示了微生物种类和遗传的多样性。
本文介绍了已被广泛应用到微生物多样性研究中的不同策略：DGGE、TGGE、SSCP、AFLP、RAPD、T-RFLP 、ARDRA、RISA、REP-PCR等基于PCR技术的现代生物学方法，指出了每种解析技术的功能特点和局限性及其应用。
关键词：微生物多样性；DNA指纹图谱；应用The Application of DNA Fingerprinting Technique in theStudy of Soil Microbial DiversityCHEN QingAbstract: DNA fingerprint technique is based on the gene in length, composition and structure of the polymorphism,using electrophoretic methods separate complicate amplified PCR fragment into simple genetic strip map,then according to strip information for genetic analysis technology, can accurately reveal the microbial species and genetic diversity.This paper introduces some different strategies that have been widely applied to the study of microbial diversity: DGGE, TGGE, SSCP, AFLP, RAPD, T-RFLP, ARDRA, RISA, REP-PCR, the modern biological methods are based on PCR technology, points out each analytical technique features and limitations and its application.Keywords: Microbial diversity; DNA fingerprinting; Application土壤微生物参与土壤有机质分解、腐殖质形成等生化过程，为土壤有机质和土壤养分转化与循环提供了动力。
三种DNA指纹图谱技术在菌株分型中的应用
三种DNA指纹图谱技术在菌株分型中的应用刘毅;姚粟;李辉;刘洋;刘勇;刘波;程池【摘要】Four strains ofGeobacillus were analyzed with 3 DNA fingerprinting techniques of ERIC-PCR, BOX-PCR and RAPD for searching the proper strain identification measure for the genus especiallyGeobacillus stearothermophilus. Each of 4 strains ofG. stearothermophilus had different fingerprint. The bands by simple and quick ERIC-PCR were quite clear, and the different strains could be recognized clearly. The bands by BOX-PCR were less, and the strains of the same bacteria could not be recognized clearly. More bands could be obtained by RAPD with higher identification;however the workload of identification and cost increased significantly. Three techniques may effectively identify the strains ofGeobacillus, and ERIC-PCR is the most effective and fast method to identify strains ofG. stearothermophilus.%旨在通过ERIC-PCR、BOX-PCR、RAPD等技术对4株地芽孢杆菌属菌株进行DNA 指纹图谱分析，找到一种适合于地芽孢杆菌属尤其是嗜热脂肪地芽孢杆菌的菌株分型方法。
dna指纹技术的应用原理
DNA指纹技术的应用原理什么是DNA指纹技术？DNA指纹技术是一种用于个体辨识的分析方法，通过比较个体DNA中的特定区域序列，可以确定个体的身份或亲缘关系。
这项技术在刑事侦查、鉴定亲属关系、遗传学研究等领域具有广泛的应用。
DNA结构与分析方法作为遗传物质，DNA是由四种碱基（腺嘌呤，鸟嘌呤，胸腺嘧啶和鳞嘌呤）构成的双螺旋结构。
每个碱基可以与对应的碱基形成互补配对，腺嘌呤和鸟嘌呤之间形成两个氢键，胸腺嘧啶和鳞嘌呤之间形成三个氢键。
这种稳定的互补配对关系使得DNA在复制过程中能精确复制基因信息。
在DNA指纹技术中，常用的分析方法包括PCR扩增、限制性酶切以及凝胶电泳等。
PCR扩增PCR扩增（聚合酶链式反应）是DNA指纹技术的核心步骤之一。
这项技术通过复制DNA特定区域的序列，使这些序列得以扩增到大量数量，以便进行后续的分析。
PCR扩增分为三个步骤：变性、退火和延伸。
在变性步骤中，DNA双链被加热分离为两条链；退火步骤中，低温条件下引入引物，使其与待扩增区域的DNA序列互补结合；在延伸步骤中，通过加入DNA聚合酶和四种碱基等反应物，使引物向前延伸并扩增待测序列。
通过多次循环以上三个步骤，便可扩增出大量的目标序列。
限制性酶切限制性酶切是指将特定酶切割DNA分子的技术。
这些酶可以识别特定DNA序列，并在该序列上切割。
在DNA指纹技术中，使用不同的限制性酶对DNA样本进行切割，生成一系列特定长度的DNA片段。
不同个体的DNA序列存在差异，因此切割后的DNA片段长度也会有所不同。
凝胶电泳凝胶电泳是一种常用的分离技术，可以将DNA片段根据其大小进行分离。
此法是通过将DNA样本加载到琼脂糖凝胶中，然后施加电压使DNA片段在凝胶中迁移。
由于DNA分子带电，会被电场吸引，较小的片段会移动得更快，较大的片段则移动得较慢。
通过和已知长度DNA片段的比对，可以确定未知DNA样本的分子大小。
DNA指纹技术的应用DNA指纹技术在刑事侦查、亲子鉴定、疾病遗传研究等方面具有广泛的应用。
DNA指纹——如何为农作物品种“验明正身”
DNA指纹——如何为农作物品种“验明正身”今年4月，由农业农村部主办、全国农技中心承办的全国农作物品种DNA指纹库公共平台（简称DNA指纹库平台）正式上线运行，实现了“农作物DNA指纹档案”的线上共用共享，解决了品种真实性鉴定中标准样品取样难、耗时长，侵权案件审判时效性差等问题，也为避免同质化育种提供了“参考数据库”。
人类指纹因其外观纹理具有高度特异性，常被用作个体标记。
其实，动植物也有自己独一无二的“指纹”，就潜藏于巨量冗杂的DNA片段中，DNA指纹。
“应用SSR（简单重复序列）技术检测一个样品，只需要20—40粒种子，一个实验员3个工作日就可以完成。
”农业农村部农作物种子质量监督检验测试中心（深圳）副主任刘晋介绍，按农作物品种鉴定的传统做法，田间小区种植鉴定，得选一大片地种植，至少要在一个作物生长周期持续观察测定，比如水稻，需要100—120天，“有时等鉴定结果出来，下个播种季已经错过了。
”更关键的是，DNA指纹检测受人为因素影响极小，品种间1个碱基位点差异都能检测出来。
这么厉害的检测手段具体有什么用，怎么用，实际效果怎样？DNA指纹库平台的上线运行又为种子行业带来了哪些新变化？记者采访了农作物育种单位、种子检验机构、品种管理部门以及法律界专家，从不同侧面揭开农作物DNA指纹检测的“面纱”。
不同品种具有的特异性DNA片段组合构成了作物独一无二的“指纹”，用以“验明正身”的前提是建立准确、完整、共享的“指纹库”“在植物基因组中存在一些特定的区间片段，SSR序列，它们在同一物种中普遍存在，但在不同品种中却高度特异，且不复杂、易鉴定，是区分不同品种的关键位点。
这些位点的组合排列就相当于品种的DNA‘指纹’。
”从事了20多年SSR分子标记研究的北京市农林科学院玉米研究所主任赵久然回忆，SSR—DNA指纹技术在我国种业领域初露锋芒，是在玉米育种领域。
如何利用SSR序列区分不同品种？北京市农林科学院小麦研究中心副研究员庞斌双解释道：“SSR位点是包含1—6个碱基的简单重复序列片段。
初二生物DNA的稳定结构
初二生物DNA的稳定结构DNA，即脱氧核糖核酸（Deoxyribonucleic Acid），是生物体内负责遗传信息传递和储存的重要分子。
它具有高度稳定的结构，以确保遗传信息的准确传递。
在本文中，我们将探讨DNA的稳定结构以及稳定性的原因。
一、DNA的化学结构DNA由四种不同的核苷酸单元组成，分别是腺嘌呤（Adenine，简写为A）、胸腺嘧啶（Thymine，简写为T）、鸟嘌呤（Guanine，简写为G）和胞嘧啶（Cytosine，简写为C）。
这四种核苷酸单元通过磷酸二脂桥（Phosphodiester bond）连接在一起，形成了DNA的链式结构。
具体而言，A和T之间，以及G和C之间是通过氢键相互结合的。
A和T之间形成两个氢键，而G和C之间形成三个氢键。
这种碱基对（base pair）的结合方式很重要，不仅可以稳定DNA的结构，还可以在DNA复制和基因表达过程中提供配对模板。
此外，DNA还有双螺旋结构，即形成了一个螺旋状的分子。
这是由于两条DNA链在碱基对之间以螺旋状交织在一起，形成了DNA的经典双螺旋结构。
二、DNA的稳定性原因1. 氢键的稳定作用氢键是DNA稳定性的重要因素之一。
氢键的形成依赖于碱基对之间具有互补的碱基序列。
A和T之间形成两个氢键，G和C之间形成三个氢键，这种互补配对使得DNA分子在受到外界影响时更加稳定。
2. 脱氧核糖结构的稳定性DNA中的核苷酸单元结构中含有脱氧核糖（Deoxyribose），而不是核糖（Ribose）。
脱氧核糖相较于核糖来说，少了一个氧原子，使得DNA的结构更加稳定。
这是因为脱氧核糖的缺失减少了DNA的氧化反应和糖类水解反应的可能性，从而提高了DNA分子的稳定性。
3. 蛋白质的结合在细胞内，DNA会与一些蛋白质结合形成染色质。
这些蛋白质可以进一步增强DNA的稳定性，保护DNA免受外界因素的损害。
三、DNA稳定性的重要性DNA的稳定性对生物体来说非常重要，因为它关系到遗传信息的传递和后代的遗传特征。
DNA指纹图谱技术ppt课件
二、以DNA指纹图谱技术为基础的微生物多样性研究方法
4、末端限制性片段长度多态性（T-RFLP）
此法与RFLP原理相同，只是在 PCR引物的一端用荧光染料进 行标记，这样使得限制片段长 度多态性图谱更为简化，只需 检测被标记的末端限制性片段， 就可以分析复杂群落。
二、以DNA指纹图谱技术为基础的微生物多样性研究方法
1、变性梯度凝胶电泳（DGGE）和温度梯度 凝胶电泳（TGGE）
步骤
（1）样品总DNA提取； （2）样品16S或18SrDNA片段的PCR扩增及纯化； （3）制取变性梯度聚丙烯酰胺凝胶； （4）染色； （5）样品的DGGE分析； （6）割胶测序。
DGGE
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二、以DNA指纹图谱技术为基础的微生物多样性研究方法
其中16S、18S rRNA基因大小适中，不但含 有高度保守的基因片段，而且在不同的菌株间 也含有变异的核酸片段，因此其应用最为普遍。
一、核糖体RNA基因的介绍
利用rDNA测量细菌进化和亲缘关系
分析时可利用恒定区序列设计引物，将 16S rDNA进行PCR 扩增，产生长度相同但序 列有异的DNA片段混合物，然后利用可变区 序列的差异对不同菌属、菌种的细菌进行分 离。
二、以DNA指纹图谱技术为基础的微生物多样性研究方法
变性梯度凝胶电泳（DGGE）和温度梯度凝胶 电泳（TGGE）
原理 在聚丙烯酰胺中加入甲酰胺，从正极到负
极梯度递加，或是形成温度梯度，电泳中的 DNA到达它的变性甲酰胺浓度或温度时，双链 部分解开，造成泳动速度发生变化，从而达到 分离效果。
二、以DNA指纹图谱技术为基础的微生物多样性研究方法
二、以DNA指纹图谱技术为基础的微生物多样性研究方法
除此以外，还有重复基因外回文序列PCR、核糖体间隔分析、编码蛋白质的基 因推测、质粒指纹图谱分析等现代分子生 物学技术研究方法，不需要对微生物进行 分离培养，克服了传统微生物培养技术的 局限性，能够客观分析，精确解释微生物 种类的多样性，给微生物生态学的研究带 来了光明前景。
dna指纹的遗传分析实验报告【可编辑】
DNA指纹的遗传分析【实验原理】“DNA指纹”是指可以利用DNA差异来进行与传统指纹分析相似的身份识别。
DNA指纹是以DNA的多态性为基础，而卫星DNA的发现则是其最重要的奠基石。
卫星DNA是由一短序列（即重复单位或核心序列）多次重复而成，因此也有人称其为可变数目串联重复序列（variable numbers of tandem reprat，VNTR）,在人类基因组中存在多种由不同重复单位组成的卫星DNA，重复单位的碱基序列在不同个体中具有高度的保守性，而卫星DNA 的多态性则来源于重复单位的重复次数不同，并形成了众多的等位基因。
列如，人类1号染色体上的VNTR D1S80，核心序列由16个核苷酸组成，拷贝数在14～41个之间，已知29种不同的等位基因。
1984年Jefferys等人首次将分离的人源小卫星DNA用作基因探针，同人类核DNA的酶切片段杂交，产生了由10多条带组成的杂交图谱，不同个体杂交图谱上带的位置就像指纹一样因人而异，因而Jefferys等人称之为DNA 指纹图谱。
产生DNA指纹图谱的过程叫做DNA指纹分析，目前包括PCR、RFLP（限制性内切酶酶切片段长度多态性）和RAPD（随机扩增多态性DNA）等方法。
DNA指纹图谱的基本特点：（1）多位点性：基因组中某些位点的小卫星重复单位含有相同或相似的核心序列。
在一定的杂交条件下，一个小卫星探针可以同时与十几个甚至几十个小卫星位点上的等位基因杂交。
（2）高变异性：DNA指纹图谱反应的是多个位点上的等位基因的特征，具有很高的变异性。
发现两个无血缘关系个体具有相同DNA指纹图谱的概率仅为5×10-19，因此，除了同卵双胞胎，几乎不可能有两个人的DNA指纹图谱完全相同。
（3）稳定的遗传性：DNA指纹图谱中的谱带能够稳定遗传，杂合带遵守孟德尔遗传规律。
子代DNA指纹图谱中产生与双亲都不同的新带的概率（基因突变）仅在0.001～0.004之间。
DNA指纹.
DNA指纹图谱法操作
提取DNA
PCR 技术 扩增
高可变位点
酶 切
DNA片断
放 射 自片 显段 影杂 交 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 DNA
DNA指纹图谱
1.提取样品中的DNA； 2.若提取DNA 量很少，可将其进行PCR扩增，得到大量DNA。 3.选用与探针配对的限制性核酸内切酶，在长链DNA位置上加 以切割，将分子量很大的DNA长链切成许多长度不同的小片 段。 4.在胶板尺寸较长的凝胶电泳仪中，对酶解完全后的DNA片段 进行电泳，各酶切片段就会按其长度大小在电场中进行分离。 5.先用碱性溶液使凝胶板中分离开的双链DNA片段变性为单链 片段，然后将凝胶板夹在尼龙膜中，并永久性地固定在尼龙膜 上。 6.让放射性DNA探针与尼龙膜上的单链DNA片段进行杂交。 7.用放射性胶片与尼龙薄膜叠放，尼龙膜上的放射性探针便会 发出X射线使胶片曝光，从而使杂交探针的长度不同的DNA片 段位置显影在胶片上，便是所谓的DNA指纹。
DNA指纹的含义
DNA指纹技术：利用不同的串联重复序列的易变 性和高度个体特征的潜在性，通过特定的重复序 列的DNA探针，使来自基因组不同区域的许多序 列片段同时被检测，使重复序列的高度多样性同 时产生多位点基因带谱。 DNA指纹技术是分子生物学各种新兴技术中的一 种,目前已被广泛应用于法医学、疾病诊断、肿瘤 研究等领域。
第一个DNA指纹
遗传学家Jefferys和第一张DNA指纹
第一个DNA指纹
探针：肌红蛋白基因第一个内含子中的串联重复序列 DNA片段：8 个含有串联重复序列（小卫星）的重组克隆
⑴每个克隆都含有一个长0.2～2.0kb、由重复单位重复3～29 次组成的小 卫星DNA。 ⑵这8个小卫星都含有一段相同的核心序列，其碱基顺序为 GGGCAGGAA。
DNA 指纹图谱技术及其在作物品种资源中的应用
分子植物育种，2006年，第4卷，第3期，第425-430页Molecular Plant Breeding,2006,Vol.4,No.3,425-430专题介绍ReviewDNA指纹图谱技术及其在作物品种资源中的应用王忠华浙江万里学院生物技术研究所,宁波,315100通讯作者,wang1972@摘要随着各种新型DNA分子标记的出现，带动了DNA指纹图谱技术的快速发展。
本文简要阐述了几种常见DNA指纹鉴定技术，如限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism,简称RFLP)、随机扩增多态性DNA(random amplified polymorphic DNA,简称RAPD)、扩增片段长度多态性(am-plified fragment length polymorphism,简称AFLP)、简单重复序列或微卫星标记(simple sequence repeat,简称SSR)、内部简单重复序列(inter-simple sequence repeat，简称ISSR)和单核苷酸多态性(single nucleotide poly-morphisms,简称SNPs)等的基本原理、在技术上的优缺点及其在作物品种资源中的应用，包括品种的鉴定、纯度的检测、品种亲缘关系与分类的研究及品种专利权的正当维护等。
同时，对DNA指纹图谱技术在应用中的存在问题及相应的解决途径进行了简单的讨论，如目前DNA的提取方法与育种应用的大规模群体不相适应和大多数DNA指纹图谱检测技术仍比较繁琐，限制了该技术在育种中的大规模应用等。
关键词DNA指纹图谱,作物品种资源,应用DNA Fingerprinting Technology and its Application in Crop Germplasm ResourcesWang ZhonghuaInstitute of Biotechnology,Zhejiang Wanli University,Ningbo,315100Corresponding author,wang1972@Abstract DNA fingerprinting technologies have been rapidly developed with the appearance of kinds of new DNA molecular markers recently.This paper briefly reviewed the basic principle,advantages and disadvantages of several DNA fingerprinting technology,such as restriction fragment polymorphism(RFLP),random amplified polymorphic DNA(RAPD),amplified fragmentlength polymorphism(AFLP),simple sequence repeat(SSR),in-ter-simple sequence repeat(ISSR)and single nucleotide polymorphisms(SNPs)etc.And its application in crops germplasm,including the identification of crop varieties,the examination of seed purity,the study of relationship and classification of crop varieties and the exact protection of crop varieties patents.In addition,the problems ex-isting in the application of DNA fingerprinting technology and the ways to solve them were also briefly discussed, such as the contradiction between DNA extraction methods and application of breeding populations,limited appli-cation due to complicated relatively technique of many DNA fingerprinting,etc.Keywords DNA fingerprinting,Crop germplasm resources,Application众所周知，作物品种资源作为国家的重要战略资源之一，它是作物高产稳产的重要基础，在未来的生命科学和农业科学研究领域中将占据越来越重要的地位(Tanksley and McCouch,1997)。
T-RFLP指纹图谱技术分析细菌型微生物肥料菌种稳定性
T-RFLP指纹图谱技术分析细菌型微生物肥料菌种稳定性魏霜;刘建华;吴西源;黄帅;周陆宁;林春贵;吴希阳;刘中勇【摘要】[目的]建立一种分析微生物肥料菌种稳定性的T-RFLP指纹图谱技术.[方法]采用T-RFLP指纹图谱技术对进口细菌型微生物肥料菌种的稳定性进行分析.[结果]样品中优势菌的T-RFs片段主要是87、246、247、330 bp,其中330 bp为主要片段,Shannon多样性指数和均一性指数测定结果表明,不同批次产品间差异性较小,微生物群落结构较稳定.[结论]建立了微生物肥料菌种稳定性分析的T-RFLP指纹图谱技术,为进出口微生物肥料产品提供了一种快速分析方法.【期刊名称】《安徽农业科学》【年(卷),期】2017(045)001【总页数】3页(P143-144,154)【关键词】T-RFLP;微生物肥料;稳定性【作者】魏霜;刘建华;吴西源;黄帅;周陆宁;林春贵;吴希阳;刘中勇【作者单位】汕头出入境检验检疫局,广东汕头515041;国家质检总局标准与技术法规研究中心,北京100028;广州机场出入境检验检疫局,广东广州510000;汕头出入境检验检疫局,广东汕头515041;黄埔出入境检验检疫局,广东广州510000;汕头出入境检验检疫局,广东汕头515041;暨南大学理工学院食品科学与工程系,广东广州510632;汕头出入境检验检疫局,广东汕头515041【正文语种】中文【中图分类】S144化肥的使用使农产品的品质下降，营养价值、适口性降低，蔬菜硝态氮超标、亚硝态氮积累超标；还引起江河湖泊的富营养化，破坏土壤结构，致使土壤中有机质减少，保存养分、水分的能力下降，易发生风蚀和荒漠化[1]。
微生物肥料是1种或多种功能微生物经工业化生产增殖后直接使用，或者浓缩或经载体吸附而制成的活菌制品。
它具有多方面的优点：土壤团粒化及土壤改良、增加植物抗逆境能力；促进分解有机物质；防除病害，减少农药的需求；连续造肥作用，提供植物吸收，如氮肥制造、达成肥分的可溶性、提供有机营养等；解除毒素促进植物生长；增进肥效[2-3]。
DNA 指纹图谱分析方法
第10章 DNA指纹图谱分析方法10.1 DNA指纹图谱产生的原理10.1.1 高变异DNA序列的发现1980年，Wyman 和 White在进行人体DNA 基因文库的研究中，筛选到一个随机DNA片 段，以其为探针进行RFLPs分析，检测到8个等位基因，平均杂合率超过75％，因此推测该 位点的多态性来源于DNA重排而非碱基突变，这是人类基因组中发现的第一个高变区（hyper variable regions，简称HVRs）。
此后，人们在人类基因组中又陆续发现了其他一些高变区， 如α-珠蛋白基因（Higgs等 1981，1986）、胰岛素基因（Bell等 1982）、脂蛋白基因（Knott 等 1986）、D-Ha-ras癌基因（Capon等 1983）、Zata-珠蛋白基因（Goodbourm等 1983）等基 因的侧翼及肌红蛋白基因（Weller等1984）的第一个内含子区域，都含有这种HVRs。
这些高 变区的共同特点为：都是由一短序列（即重复单位）首尾相连、多次重复而成，其多态性来源 于重复单位的重复次数不同。
同一高变区的这些重复单位还具有高度的保守性，但因重复单位 的重复数目不同，形成了众多的等位基因。
这些高变区后来被叫做小卫星（minisatellite）（Jeffreys等 1985a），有的人又称其为可变数目串联重复序列（variable number of tandem repeat，简称VNTR）（Nakmura等1987）。
在小卫星DNA内，重复单位数目的高度变异是由于不 等交换所造成的，换言之，即在有丝分裂时的姊妹染色单体（sister chromatids）或减数分裂 时的同源染色体间互换所致。
有时候，发现DNA链架突变的发生频率高于点突变，其频率为每 世代每千个核苷酸对在10－5～10－2。
虽然不等互换导致重复单位数目增加或减少，但不同重复 的形成却是由于点突变造成的。
此外，基因转换（gene conversion）与重组似乎在同源性的维 持上扮演着重要的角色。
菌种指纹特征
菌种指纹特征
菌种指纹特征是指通过对菌种进行一系列的生物学和化学分析，得到的一种可以代表
该菌种特征的指纹图谱。
这种指纹特征可以用于菌种的鉴别、分类、进化关系等方面
的研究，有助于深入了解菌种的生物学特性和生态学特征。
具体而言，菌种指纹特征的构建通常包括以下步骤：
1. 菌种培养：将菌种接种在适宜的培养基上，在一定温度和湿度条件下培养一定时间，使菌种繁殖到足够的数量。
2. 菌种提取：将培养好的菌种从培养基上分离出来，经过洗涤、干燥等处理后进行菌
种提取。
3. 指纹图谱的构建：采用不同的分析方法，例如全基因组测序、代谢组学分析、蛋白
质组学分析等，对提取的菌种进行一系列的生物学和化学分析，得到一系列数据。
这
些数据可以包括基因组序列、代谢产物、蛋白质组成等，用于构建菌种的指纹图谱。
4. 指纹图谱的分析：将构建的指纹图谱进行分析，可以采用不同的方法，例如聚类分析、主成分分析、模式识别等，对指纹图谱进行分类、鉴别和进化关系等方面的研究。
通过菌种指纹特征的构建和分析，可以深入了解菌种的生物学特性和生态学特征，为
菌种改良、新品种培育以及工业发酵等方面的应用提供重要的参考依据。
同时，菌种
指纹特征还可以用于食品安全、生物恐怖袭击等领域中的微生物检测和鉴定。
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Chinese Journal of Microecolo gy , Oct ober 2005, Vol . 17 No. 5
[ 2] , PCR 扩 增 体 系 是 25 Ll, 10 × Buff er × 2. 5 Ll 1. 5 T GG E 分析 用 T he St andard T G GE System
样品名称 G
Y
批次编号
G1 G2 G3 Y1 Y2 Y3
表 1 微生物肥料样品分类表
生产时间 2002 年 9 月
2002 年 11 月 2003 年 4 月
2002 年 9 月 2002 年 11 月
2003 年 3 月
保存剂型 液体
液体
微生物标注 光合菌, 乳酸菌, 酵母菌, 放线菌 和醋酸杆菌
ERIC-PCR 反应条件参见文献[ 4] 。
1. 6 DNA 指纹图的记录和相似性分析 ERIC-PCR
1. 4 16S rDNA V 3 区扩增 引物 P 2 和 P 3 是扩增 电 泳结 果利 用凝 胶电 泳成 像系统 ( UVI pro ) 记 录,
16S rDNA V3 区的通用引物, 为了提高 T GGE 的分 P CR-T GGE 电 泳 结 果 通 过 数 码 相 机 ( Sony DSC-
辨率, 其上游引物带有 40 bp 的 GC 夹子, 退火温度从 F 717) 拍摄 记录, 所 有结果通 过图像分 析软件 ( U VI
65～ 55 ℃, 每 2 个循 环下降 1 ℃, 以减少 非目标 产 BAND/ MAP ) 进 行 分 析, 并 计 算 相 似 性 系 数 ( Dice
物[ 12 ] 。PCR 反应体系是 25 Ll, 10×Buf fer×2. 5 Ll, 25 mm ol/ L M gCl2×1. 5 Ll, dNT P ×2 Ll ( 含每种脱氧核 苷 三 磷 酸 2. 5 m mol / L ) , 引 物 各 0. 5 Ll ( 12. 5 mm ol/ L ) , T aq po lymerase 2. 5 U ( Pr omega ) , 17 Ll ddH2O 和 0. 5 Ll 模板 ( 10 ng ) 。为了进一步消除异源 双链, 将 P CR 产物稀释 10 倍, 相同的反应体系扩增 5 个循环[ 13] 。PCR 产物用 1. 2% 的琼脂糖凝胶 电泳检 验。
显示, ERIC-P CR 和 P CR-T GGE 指纹图技术可以快 速、准确地对微生物肥料的菌种组成进行分析, 在微 生物肥料产品的质量控制和产品评价中可以发挥重 要作用。
1 材料与方法 1. 1 实验样品 市售微生物肥料 G 和 Y, 均在地方 农技推广站购买; 每种微生物肥料各买 3 个生产批次 ( G1, G2, G3; Y1, Y2, Y3) , 每个批 次 3 个包 装的重 复, 所有样品均SA) , 25 mm ol/ L M gCl2×2 Ll, dNT P ( Bio metra , Gem) 对 16S rDNA V3 区的扩增产物进
×2 Ll ( 含每种脱氧核苷三磷酸 2. 5 mm ol/ L ) , 引物 行分析, 首先通过垂直胶确定样品的变性温度为 37～
各 0. 5 Ll ( 12. 5 mm ol/ L ) , T aq polym erase 2. 5 U 52 ℃, 平行胶电泳 3 h, 电压 200 V, 最后银染显色, 所
( BBST ) , 模板 4 Ll ( 80 ng) , 加 ddH2O 补充至 25 Ll。 有操作按照仪器使用手册执行。
21 0095 )
【摘要】 目的 分 析 2 种市售微 生物肥料 在不同生产 批次中微生 物菌种组 成的稳定性。方 法 利用 ERICP CR 基因组 DN A 指纹图技术和 16S r DN A V 3 扩增- 温度梯度凝胶电泳( P CR-T GG E) 指纹图技术。结果 这 2 种 微 生物 肥料 在同 一个 生产 批次 不同 包装 之间 的 2 种 D NA 指 纹图 谱 相似 性较 高, 分 别在 78% ～ 95% 和 96% ～ 100% , 表明 同一个批次内的菌 种组成比较一致。但其 在不同的生产批次之 间菌种组成差异 存在显著性, 反映 在 2 种 D NA 指纹图谱上, 不同 生产批次样品间 ER IC-PCR 指纹图相 似性最低只有 10% , PCR -T G GE 指纹图相似性最 低为 46% 。结论 通过 ERIC-P CR 和 P CR-T GG E DN A 指纹图技术可以对 微生物肥料中菌种 组成的稳定性进行 快速、准确的分析, 如何保持菌 种组成在批次之间的稳定一致, 是复合菌种微生物肥 料质量控制中面临的难题。 【关键词】 微生物肥料; ERIC-P CR; P CR-T GG E; DN A 指纹图; 质量控制 【中图分类号】Q 786 【文献标识码】A
物 区 系 的多 样 性 和监 测 种 群 变 化[ 8] 。目 前 PCR DGGE/ T GGE 技术已经广泛用于发酵食品和微生物 保健品[ 9, 10] 等微生物产品的菌种组成分析。
该研究利用 ERIC-PCR 和 P CR-T GGE 技术, 分 析微生物肥料同一个生产批次的不同包装和同一个 品种不同批次之间微生物肥料的菌种组成情况。结果
微生物的菌种类型组成及比例是微生物肥料质 量检测体系中不可或缺的一部分。现行的微生物肥料
行业标准主要通过选择性平板培养和显微镜观察对 其微生物组成稳定性进行分析, 对多菌种复合的微生 物肥料进行菌种组成检测费时、费力, 是微生物肥料 的生产和质量管理中的一个难题。
以微生物基因组总 DNA 作为研究对象的分子 检 测方 法可 以客 观、灵敏 地反 映 微生 物种 群 的变 化[ 1] 。ER IC-P CR 最初被用于细菌种属的基因组指纹 图分析[ 2] , 实质是一种长引物随机 PCR ( L P-RA P D) , 可以形成菌株专一性的基因组 DNA 指纹图而被广 泛应用在细菌分类和鉴定研究中[ 3, 4] , 并且应用于活 性污泥[ 5] 和动物肠道[ 6, 7] 等复杂微生物群落的结构 与功能关系的研究。M uyzer 等通过 16S rDNA 多变 区的扩增和 DGGE/ T GGE 电泳分析技术比较微生
生 态学研 究, E-mail: lh w ang @ sjt u. edu. cn. ; 赵立平, 通讯 作者, E -m ail : l pzhao@ sjt u. edu. cn.
样品 特 点 增 加了 溶 菌 酶 ( 25 mg / m l) 裂 解, 同 时 在 DNA 抽提过程中首先用等体积 T r is-pheno l( pH 8. 0) 抽 提 1 次。用 DN A 浓度仪 ( Dy Na Quant 200) 检测 DNA 浓度, 并用 1% 琼脂糖凝胶电泳( EB 0. 5 Lg / ml) 检测分子量和降解情况; DNA 样品- 20 ℃保存备用。 1. 3 ERIC-PCR 微 生物 肥 料 基 因 组 总 DNA 的 ERIC-P CR 指 纹图的扩增引 物是 ERIC1R 和 ERIC2
光合菌等多 株有益菌株
1. 2 DN A 提取[ 11] 微生物肥料样品基因组 D N A 提 取参考《精编分子生物学实验指南》, 针对 微 生 物肥料
【收稿日期】2005-04-02 【基金项目】863 计划( 2004A A 214071) 和上海市科技兴农重点攻关项目
[ ( 2002) 第 4-4-2 号] 资助项目 【作者简介】王 凌华 ( 1971-) , 男, 工 程师, 博 士研究 生, 从事 微生物 分子
Bacterial composition of microbial fertilizers as evaluated by DNA fingerprinting techniques
WANG L ing-hua , ZHAO Yong, L I Wu, et al.
( School of L if e Science & Biotechnology , S hang hai J iao T ong U niver sity , S hang hai 200240, China) 【Abstract 】 Objective T o analy zed the batch-t o-bat ch sta bility of bacter ial compo sitio n of tw o co mmercial
中国微生态学杂志 2005 年 10 月第 17 卷第 5 期
32 1
文章编号: 1005-376X( 2005) 05-0321-03
【论 著】
DNA 指纹图技术分析微生物肥料菌种组成稳定性
王凌华1 , 赵勇2 , 李武1, 赵立平1
( 1. 上海交通大 学生命科 学技术学 院, 上海 200240; 2. 南 京农业大 学生命学 院 微 生物系, 江苏 南京
micr obia l fer tilizer s ( G and Y ) . Method Evaluated by ERI C-PCR ( Enter obacter ial Repet itive Interg enic Co nsensP CR ) and PCR-T G GE ( P CR-t emper atur e g radient g el elect ro pho resis ) of 16S rDN A V 3 reg io n. Results T he similar ity coefficient ( Dice) of DN A finger prints ( ERIC-P CR and PCR -T G GE) of r eduplicat e samples in t he same pro ductio n bat ch w as 78% ～ 95% and 96% ～ 100% r espectively. Am ong t he differ ent pr oductio n batches, the low est similar ity co efficient w as 10% in ERIC-PCR fing erpr ints a nd 46% in PCR-T G GE fing erprint s. T his show ed that the st ability of bacter ial co mpo sitio n amo ng samples in t he same pr oduct ion batch w as higher t ha n tho se fr om different pr oduct ion ba tches. Condusions ERIC-P CR and P CR-T GG E fing erpr inting had a g oo d potential as a quality co ntr o l technolog y t o evaluate and monito r t he sta bility o f ba ct eria l com po sitio n of micr obial fer tilizers. T his w or k also indicates t hat how t o maintain the stability o f bacterial composit ion was an impor tant pro blem in quality co ntr o l o f micro bial fertilizer pro ductio n. 【Key word】 M icr obial fer tilizer ; ERIC-P CR; P CR-T GG E; DN A fing erpr inting ; Q ua lit y contr ol