GST-Pull-Down原理

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GST-pull-down实验技术原理和实验流程

3. 体外蛋白的结合
➢ 5、3000 rpm/min，4℃离心3min，弃上清（注意不要扰动底层的Sepharose）；
➢ 6、重复步骤5三次; ➢ 7、吸干Sepharose上面的液体后，加入20~30微升1 ×蛋白电泳
上样缓冲液，沸水浴4min，冻存于-20℃备用； ➢ 8、做SDS-PAGE和Western blot检测另一个蛋白。
加DTT至终浓度1mmol/L。
Western Blot
➢ 1.1.2 (His)-B融合蛋白的纯化
➢ 1、在新鲜制备的裂解液上清中加入适量体积的Ni-NTA珠子， 4℃缓慢摇动，反应30~60min；
➢ 2、 3000 rpm/min，4℃离心5min，弃上清。该Ni-NTA珠子上结合了His-B融合蛋白。
B蛋白的来源： ➢ 1.1 (His)-B融合蛋白的原核表达与纯化 ➢ 1.2 (HA/Myc/Flag)-B融合蛋白的真核表达
Western Blot
➢ 1.1.1 (His)-B融合蛋白的原核表达
➢ 1、活化冻存菌种His和His-B：按1: 50比例将表达蛋白的冻存菌液加入5ml LB(Amp＋)，37℃，200 rpm培养过夜；
加DTT至终浓度1mmol/L。
Western Blot
➢ 1.2 GST-A融合蛋白的纯化
➢ 1、在新鲜制备的裂解液上清中加入适量体积的50%Glutathione Sepharose 4B，4℃缓慢摇动，反应30~60min；
➢ 2、 3000 rpm/min，4℃离心3min，弃上清。该Sepharose上结合了GST-A融合蛋白。
Western Blot
GST pull-down原理：
基本原理：

GST pulldown实验技术

➢ 2、将过夜培养物按1:100比例接入200ml LB(Amp＋) ，220rpm， 30℃培养至OD600=0.4-0.6;
➢ 3、以预实验确定的最佳IPTG浓度、时间和温度诱导表达靶蛋白（IPTG 0.5mM，28℃，200 rpm培养10~16小时）;
➢ 4、诱导适当时间后，4℃，5000 rpm/min离心10min后弃上清（如需要该步沉淀能保存在-80℃）；
GST pull-downFra bibliotek示意图Western Blot
GST pull-down应用
Western Blot
用于验证两个已知蛋白的相互作用筛选与已知蛋白相互作用的未知蛋白
GST pull-down流程
GST-A融合蛋白的制备 • B蛋白的制备 • 体外蛋白的结合 • Western blot检测
Western Blot
➢ 1.1 GST-A融合蛋白的表达
➢ 5、重悬沉淀：按10ml菌液沉淀用1ml PBS重悬，并加入PMSF； ➢ 6、冰上超声沉淀重悬液：5S 间隔5S 至悬液透明（一般可容性
蛋白：10ml菌液沉淀用1ml PBS重悬液超声6~9min可透明）; ➢ 7、12000 rpm/min，4℃离心10min，将上清转移至新的离心管，
B蛋白的来源： ➢ 1.1 (His)-B融合蛋白的原核表达与纯化 ➢ 1.2 (HA/Myc/Flag)-B融合蛋白的真核表达
Western Blot
➢ 1.1.1 (His)-B融合蛋白的原核表达
➢ 1、活化冻存菌种His和His-B：按1: 50比例将表达蛋白的冻存菌液加入5ml LB(Amp＋)，37℃，200 rpm培养过夜；
Western Blot
1. GST-A融合蛋白的制备

GST-Pull-Down原理

分子克隆第三版有详细介绍，结合其中的示意图很容易理解GST融合蛋白沉降技术利用了GST对谷胧甘肤偶联球珠的亲和性，从非相互作用蛋白的溶液中纯化相互作用蛋白。

GST融合的探针蛋白从细菌中表达和纯化，并平行制备细胞裂解液(可被35S标记或非标记)，再将GST融合蛋白探针和细胞裂解液在谷胧甘肤琼脂糖球珠存在下混合并孵育，以使蛋白结合。

GST融合探针蛋白和任何结合分子被离心收集，获得的混合物经洗涤后，用过量游离的谷胧甘肤洗脱或直接在SDS-PAGE上样缓冲液中煮沸。

蛋白质经SDS-PAGE分离后进行下一步的western印迹、放射自显影及蛋白质染色分析。

GST沉降技术对探测蛋白在溶液中的相互作用特别有用，而这种相互作用在膜的分析中可能是检测不到的。

GST沉降实验通常有两种应用:确定融合(或探针)蛋白与未知(或靶)蛋白间新的相互作用(Kaelin et al. 1991, Grlinick and Chao 1996),以及证实探针蛋白与已知蛋白质间可疑的相互作用(例子请见Posern et al. 199$, Grgureaich et al. 1999, Hunteret al. 1999, Sun et al. 1999)。

这两种实验的设计和实施都有所不同。

1 / 2GST pull down 是一种在体外研究蛋白质相互作用的方法，基本原理是这样的：假定A蛋白和B 蛋白可能有相互作用，我们就将其中一个蛋白比如A蛋白融合GST标签，然后将GST-A和B以及能特异结合GST的Sephrose 4B beads 孵育一定时间，然后充分洗涤未结合的蛋白，煮沸beads 进行SDS-PAGE电泳，然后进行放射自显影（如果两个蛋白通过体外翻译并且S35标记的话），就可以看见GST-A和B分别对应的条带，表明GST-A和B因相互作用而被GST-A pull down，如果没有相互作用，就只有GST-A相对应的一条带。

GST pull-down实验技术

Western Blot
1. GST-A融合蛋白的制备
1.1 GST-A融合蛋白的表达 1.2 GST-A融合蛋白的纯化
Western Blot
Western Blot
1.1 GST-A融合蛋白的表达
1、活化冻存菌种GST和GST-A：按1: 50比例将表达蛋白的冻存菌液加入5ml LB(Amp＋)，37℃，200 rpm培养过夜；
GST pull-down 示意图
Western Blot
GST pull-down应用
Western Blot
用于验证两个已知蛋白的相互作用筛选与已知蛋白相互作用的未知蛋白
GST pull-down流程
GST-A融合蛋白的制备 • B蛋白的制备 • 体外蛋白的结合 • Western blot检测
3、在管中加入预冷的200微升PBS（沿壁加入，小心勿剧烈，以免打断珠子与蛋白的连接），轻晃悬浮珠子，将Sepharose洗涤一次， 3000 rpm/min，4℃离心3min，弃上清;
4、重复步骤3三次（最后一次以小枪头吸净珠子表面液体，吸净但不吸走珠子），即获得结合有GST-A融合蛋白的Sepharose；
1.2 GST-A融合蛋白的纯化
Western Blot
5、如果用于检测，在Sepharose 加入15~20微升1×蛋白电泳上样缓冲液，于沸水中煮5~10min。
6、12000 rpm/min离心5min，取上清做SDS-PAGE和WB检测。
2. B蛋白的制备
Western Blot
Western Blot
1.1 GST-A融合蛋白的表达
5、重悬沉淀：按10ml菌液沉淀用1ml PBS重悬，并加入PMSF； 6、冰上超声沉淀重悬液：5S 间隔5S 至悬液透明（一般可容性

GST融合蛋白Pull-down技术结合质谱联用的蛋白互作分析

百泰派克生物科技
GST融合蛋白Pull-down技术结合质谱联用的蛋
白互作分析
GST融合蛋白Pull-down技术也称GST pull-down或GST pull-down融合蛋白沉降
技术，是在GST融合蛋白以及Pull Down技术的基础上发展起来的研究体外蛋白质与蛋白质相互作用的技术，实质上是一种利用谷胱甘肽S-转移酶（GST）作为亲和
标签进行的Pull-down实验。

该技术利用基因重组技术得到GST标记的融合蛋白，再利用GST对谷胱甘肽（GSH）偶联磁珠的亲和性将带GST标记的融合蛋白与谷胱甘肽偶联磁珠结合，当与融合蛋白有相互作用的靶蛋白通过载有该磁珠的层析柱或与该磁珠混合时，靶蛋白就会与融合蛋白产生吸附而从蛋白混合液中分离出来，通过纯化洗脱就可以得到与融合蛋白相互作用的靶蛋白。

被GST拉下的靶蛋白利用质谱技术进行进一步分析，即GST pull-down结合质谱分析技术，可以实现靶蛋白的定性鉴定和确认，该蛋白可以是已知的也可以是未知的，因此，可以用于验证两种已知蛋白之间可能存在的相互作用以及寻找能与已知的融合蛋白发生相互作用的未知蛋白分子。

百泰派克生物科技基于先进MALDI-TOF质谱系统与LC-MS/MS质谱系统提供专业准
确的GST融合蛋白Pull-down技术结合质谱联用的蛋白互作分析服务技术包裹研究体外强烈或者稳定的蛋白质间相互作用，鉴定两种已知的感兴趣蛋白质可能存在的直接相互作用，寻找可能与目标蛋白存在相互作用关系的未知蛋白，还可用于表征蛋白相互作用的条件，欢迎免费咨询。

gst pull down原理

gst pull down原理Gst Pull Down原理Gst Pull Down是一种视频处理技术，用于将24帧/秒的电影转换为30帧/秒的视频。

这种技术可以提高视频的平滑度和流畅度，使观看体验更佳。

本文将详细介绍Gst Pull Down的原理。

一、什么是Gst Pull Down？Gst Pull Down是一种视频处理技术，用于将24帧/秒的电影转换为30帧/秒的视频。

在电影制作中，通常使用24帧/秒来拍摄和编辑电影。

但是，在播放时，大多数电视和显示器都以30帧/秒的速度播放视频。

因此，如果直接播放24帧/秒的电影，则会出现画面抖动或不流畅等问题。

二、为什么需要Gst Pull Down？在播放24帧/秒的电影时，由于每个画面之间存在较长时间间隔，因此画面会出现抖动或不流畅等问题。

而将24帧/秒转换为30帧/秒，则可以使画面更加平滑流畅，提高观看体验。

三、Gst Pull Down原理1. 3:2 Pulldown在进行Gst Pull Down时，通常采用3:2 Pulldown方法。

这种方法利用了电影制作中使用的24fps（frames per second）与NTSC （National Television System Committee）制定的30fps之间的差异。

具体来说，将24帧/秒的电影转换为30帧/秒的视频，需要将每个电影画面分成两个半画面，然后再将其转换为三个NTSC画面。

2. 操作步骤具体来说，Gst Pull Down的操作步骤如下：（1）将24fps的电影分成两个半画面（Odd Field和Even Field）；（2）将Odd Field插入到第一帧和第二帧之间，形成一个新的NTSC 画面；（3）将Even Field插入到第三帧和第四帧之间，形成另一个新的NTSC画面；（4）重复以上步骤，直到所有24fps电影画面都被转换为30fps视频。

3. 效果通过Gst Pull Down处理后，原本24fps的电影就可以以30fps的速度播放，并且画面更加平滑流畅。

蛋白相互作用Pull-Down实验

蛋白相互作用Pull-Down实验实验原理：Pull-Down技术是通过蛋白相互作用来研究细胞通路的有力工具。

是确定两种或更多蛋白之间相互作用的体外方法。

Pull-Down实验可用来检测已知实验仪器：谷胱甘肽琼脂糖凝胶（镍离子琼脂糖凝胶）、离心机、实验材料：表达的含标签的纯化蛋白、细胞裂解液实验试剂：Binding Buffer/Washing Buffer: 4.2mM Na 2HPO 4、2mM KH 2PO 4、140mM NaCl 、10mM KClSDS loading Buffer: 50mM Tris-Cl(pH6.8)、2%SDS、0.1%溴酚蓝、10%甘油、10mM DTT裂解缓冲液：20mM Tris-Cl(pH8.0)、 200mM NaCl、 1mM EDTA（pH8.0）、3、4、探测细胞裂解液两个含等量预清除细胞裂解液及50ul谷胱甘肽琼脂糖球珠的微量离心管。

在一管中加约10ug的GST蛋白，另一管中加约10ug的GST融合探针蛋白。

两个反应中加入的探针和对照蛋白质的量应该是等摩尔的。

将离心管在4℃翻转混合孵育2h。

最大速度在4℃离心样品2min。

在新的微量离心管中收集上清。

用1ml冰冷的裂解液洗球珠。

在离心机上以最大速度离心1ml。

弃去上清。

4℃孵育结合30min。

2、结合GST融合探针蛋白的谷胱甘肽琼脂糖凝胶球珠与100ul细胞裂解液结合在4℃作用4h。

3、3000rpm在4℃离心5min，除去上清。

4、用洗涤缓冲液重悬谷胱甘肽琼脂糖凝胶球珠，3000rpm在4℃离心5min，除去上清，重复5次。

5、取谷胱甘肽琼脂糖凝胶球珠进行SDS-PAGE电泳分析。

将谷胱甘肽琼脂糖凝胶颠倒混匀后取20ul到1.5ml离心管中，小心去除上清，加250ul Binding Buffer或wash Buffer到凝胶中，混匀。

重复洗3次以上。

平衡好的凝胶用100ul Binding Buffer或wash Buffer重悬。

GST亲和层析和GST Pull-down方法

GST亲和层析和GST Pull-down方法
此方法的基本原理是：利用重组技术将探针蛋
白与GST（Glutathione S transferase）融合，融合蛋白通过GST与固相化在载体上的GTH（Glutathione）亲和结合。

因此，当与融合蛋白有相互作用的蛋白
通过层析柱时或与此固相复合物混合时就可被吸
附而分离。

在病毒受体研究中，融合蛋白通常设计
为病毒吸附蛋白（VAP）。

这方面成功的例子有
HBV[28]。

具体做法如下：将GST-融合探针蛋白（VAP）和GTH-Sepharose制成亲和层析柱，然后待分析的蛋白质混合液流经亲和层析柱，梯度洗脱，
分离、收集各蛋白组分，这称为GST亲和柱层析（GST affinity column chromatography）。

如果一开始待检蛋白就和GST- 融合探针蛋白与
GTH-Sepharose一起共同孵育，经离心收集洗脱复
合物和洗涤后，再加入过量GTH获得相互作用蛋白
的复合物，那么这种方法则称为GST pull down。

GST亲和层析及相应的GST Pull-down方法的
优点是敏感，对混合物中的所有蛋白均“一视同仁”，
也可用于受体功能的鉴定。

缺点是GST有可能影响
融合蛋白的空间结构，另外，蛋白质浓度对实验也
有一定影响。

蛋白检测-GST-pulldown

主题：GST-pulldown概述：GST pull-down实验是一个行之有效的验证酵母双杂交系统的体外试验技术，近年来越来越受到广大学者的青睐。

其基本原理是将靶蛋白-GST（Glutathione-S-transferase谷胱苷肽巯基转移酶）融合蛋白亲和固化在谷胱甘肽亲和树脂上,作为与目的蛋白亲和的支撑物，充当一种“诱饵蛋白”，目的蛋白溶液过柱，可从中捕获与之相互作用的“捕获蛋白”(目的蛋白)，洗脱结合物后通过SDS-PAGE电泳分析，从而证实两种蛋白间的相互作用或筛选相应的目的蛋白，“诱饵蛋白”和“捕获蛋白”均可通过细胞裂解物、纯化蛋白、表达系统以及体外转录翻译系统等方法获得。

目的：体外检测蛋白质与蛋白质之间相互作用，用于验证两个已知蛋白的相互作用，或者筛选与已知蛋白相互作用的未知蛋白。

原理：利用重组技术将探针蛋白与GST（Glutathione S transferase）融合，融合蛋白通过GST与固相化在载体上的GTH（Glutathione）亲和结合。

因此，当与融合蛋白有相互作用的蛋白通过层析柱时或与此固相复合物混合时就可被吸附而分离。

步骤：１.Glutathione琼脂糖珠预处理；２.GST融合蛋白挂柱：取适GST-融合蛋白与已经处理过的beads置于管中，4℃，摇床孵育过夜；３.孵育过夜的蛋白质与beads的混合液于4℃，离心,上清收集，观察融合蛋白是否饱和地挂在beads上；４.把转染目的基因的细胞裂解在细胞裂解液里（含蛋白酶抑制剂），最大转速4℃离心，收集上清液；５.将细胞裂解液上清加入beads；６.加上SDS上样缓冲液；７.SDS-PAGE，Western Blot或者质谱仪分析。

流程图：。

GSTpulldown的原理以及具体操作流程

实验目的：体外检测蛋白质与蛋白质之间相互作用。

用于验证两个已知蛋白的相互作用，或者筛选与已知蛋白相互作用的未知蛋白。

实验原理：利用重组技术将探针蛋白与GST (Glutathione S transferase)融合，融合蛋白通过GST与固相化在载体上的GTH( Glutathione )亲和结合。

因此，当与融合蛋白有相互作用的蛋白通过层析柱时或与此固相复合物混合时就可被吸附而分离试齐U： NaCl，KCl，Na2HPO4，KH2PO4，Trit on-100 , IPTG(Merck 分装)，PMSF( Amersco)，Cocktaier ( Merck 539134 ), Immobilized Glutathione ( PIERCE 15160 )实验操作程序：材料及试剂探针蛋白与GST融合的原核蛋白，裂解的细胞蛋白，或者组织蛋白提取物细胞蛋白裂解液，洗脱液：PBS 及PBS+1%Triton-100PBS (1L)NaCl : 8gKCl : 0.2gNa2HPO4: 1.44gKH2PO4 : 0.24g加入800ml蒸馏水，用HCI调节溶液的pH值至7.4,最后加蒸馏水定容至1L即可，高温高压灭菌！ 4 C保存备用！PMSF(苯甲基磺酰氟)MW:174.19工作浓度0.1-1mM，这里使用1mM，储存浓度100mM , 将0.174g PMSF溶于10ml无水乙醇混匀即可！保持于-20 C或者4C(以下流程仅供研究已知原核蛋白A和真核过表达蛋白B相互作用)1:原核融合蛋白A的获得1.1 :将编码蛋白A与GST的重组质粒化转BL21(DE3)菌株1.2：挑取单个克隆到含有5mlLB(+100ug/mlAmp)的10ml试管里，37C培养过夜1.3:将培养菌液转移到含有500ml LB(+100ug/mlAmp)的1L锥形瓶中，37C, 225rpm培养至OD60B 1.0-1.5左右，加入适当浓度的IPTG，在适当温度下培养适当时间(诱导条件需要根据不同的蛋白做调整).6000g, 10分钟，4C离心收集细菌，去尽上清，将菌体至于-20 C 放置O/N1.4 :室温冻融菌体，马上置于冰上，每500ml培养液加入10-20ml细菌裂解液 (PBS+1%Triton-100+PMSF ),吹打混匀1.5:冰上超声破碎，开2秒，停9秒，总40-60分钟。

gstpull down实验原理

gstpull down实验原理GSTP（Global Software Test Platform）是一种基于客户端-服务器架构的软件测试平台，它可以实现分布式测试、自动化测试以及测试工具的集成。

GSTP的核心技术之一就是GSTPull Down实验原理。

GSTPull Down实验原理是GSTP中的一种测试方法，用于模拟客户端请求与服务器响应的交互过程。

通过这种方法，可以对服务器的性能、稳定性和负载能力进行评估和验证。

在GSTP中，GSTPull Down实验原理的主要步骤包括：构建测试用例、模拟客户端请求、发送请求到服务器、接收服务器响应、分析响应结果。

下面将对这些步骤进行详细描述。

构建测试用例是GSTPull Down实验原理的第一步。

测试用例是为了模拟真实的客户端请求，通常包括请求的类型、参数、路径等信息。

测试用例的设计要尽可能地贴近真实的使用场景，以保证测试结果的准确性。

接下来，通过模拟客户端请求，将测试用例发送到服务器。

在GSTP中，可以使用自定义的脚本或工具来实现请求的发送。

这些工具可以模拟不同的网络环境、请求频率和负载情况，从而对服务器的性能和稳定性进行全面测试。

服务器接收到客户端的请求后，会进行相应的处理，并生成相应的响应结果。

GSTP会将服务器的响应结果返回给测试者，以方便对响应结果进行分析和评估。

在分析响应结果时，可以根据预先设定的评估指标对服务器的性能进行评估。

评估指标可以包括响应时间、并发数、吞吐量等。

通过分析这些指标，可以了解服务器在不同负载下的性能表现，并找出潜在的性能瓶颈。

通过GSTPull Down实验原理，测试者可以对服务器的性能和稳定性进行全面的评估。

它可以帮助测试者发现服务器的性能瓶颈，优化服务器的配置和性能，提高服务器的负载能力。

GSTPull Down实验原理是GSTP中的一种测试方法，通过模拟客户端请求和服务器响应的交互过程，对服务器的性能和稳定性进行评估和验证。

GST pull-down原理及方法

看他是不是没有你不行, 还是可能有其他的新伙伴.
不做对照, 一厢情愿的希望, 并相信蛋白间的关系是幼稚的.
生物实验中, 单一的证据都是薄弱的, 无论他貌似多么正确, 要通过对照和多方取证才能确定真实的事实.
大家交朋友, 搞对象也类似于此. 关乎终身快乐, 幸福, 不可不察.
Coimmunoprecipitatio的自由恋爱问题. 一个蛋白在本性上可以同时喜欢很多其他的蛋白, 但是最终还是会有个最喜欢的, 而在Co-ip中就能发现他的喜好. 这种关系可能是直接的, 也可能是间接的, 是更接近于东方的.
两个蛋白可能在生物体内素昧平生, 一个在头上, 一个在脚上. 也许两者之间或许很合辙, 生来却天各一方. 在GST pull down 的环境中, 他们可能相遇, 吸引在一起. 但在现实生活中, 这样的浪漫关系可能是不现实的. 脚上的蛋白若是跑到头上与情人幽会, 人就要出大问题. 还有的情况是, 两个蛋白即使独处在一起在其他蛋白, 各种因素适当的辅助下, 却有可能形成稳定的搭档关系.
白溶液过柱,可从中捕获与之相互作用的“捕获蛋白”(目的蛋白),洗脱结合物后通过SDS-PAGE电泳分析,从而证实两种蛋白间的相互作用或筛选相应的目的蛋白,“诱饵蛋白”和“捕获蛋白”均可通过细胞裂解物、纯化的蛋白、表达系统以及体外转录翻译系统等方法获得。此方法简单易行,操作方便。
GST：谷胱甘肽巯基转移酶(glutathione S-transferase)
所以, 随缘, 就是像蛋白一样单纯, 却不简单.
有关Control和多方取证.
我们做试验, 都要有实验组, 阴性对照, 阳性对照. 即使体外生化实验都达成了, 还要通过多方取证来确定两个蛋白之间确定的生理关系.

gstpulldown实验技术

安全防护
gstpulldown实验涉及一些危险性因素，如化学试剂的使用、高温高压操作等，因此需要进行相应的安全防护措施。例如，穿戴实验室外套、戴手套、避免直接接触化学试剂等。此外，应定期检查实验室安全设施和应急处理设备，确保实验过程的安全性。
04
gstpulldown实验数据分析
数据收集与整理
详细描述
gstpulldown实验技术与基因芯片等技术结合使用，可以用于检测特定条件下细胞中基因表达的变化。这种方法有助于揭示基因表达的调控机制和分子网络，为研究生物发育、疾病发生发展等方面提供重要信息。
应用案例五：其他领域应用介绍
总结词
gstpulldown技术在其他领域也有广泛的应用，如病毒致病机制研究、免疫学研究等。
详细描述
gstpulldown实验技术在病毒致病机制研究中可用于分析病毒与宿主细胞的相互作用；在免疫学研究中可用于研究免疫细胞的活化和信号转导。此外，它还可用于研究细胞凋
亡、自噬等生物学过程。
THANKS FOR WATCHING
感谢您的观看
对得到的实验结果进行验证，如通过重复实验或使用不同的蛋白质和DNA探针进行验证。
实验注意事项
1. 选择合适的蛋白质和DNA探针
01
选择的蛋白质和DNA探针应具有代表性，能够反映所研究的问
题的本质。
2. 注意实验条件的一致性
02
为了保证实验结果的可靠性，需要在相同的条件下进行重复实
验。
3. 注意数据的分析和解读
未来发展趋势与展望
发展自动化和智能化技术
随着技术的发展，自动化和智能化将成为未来实验室技术的重要发展方向。通过开发自动化和智能化的Gstpull-down实验技术，进一步提高实验效率和结果的稳定性。

gstpulldown实验技术

gstpulldown实验技术汇报人：2023-12-25•实验简介•材料准备•实验操作目录•结果分析•实验结论01实验简介验证已知的蛋白质相互作用gstpulldown实验可以用于验证已知的蛋白质相互作用，例如验证某个蛋白质是否与特定的结合蛋白相互作用。

发现新的蛋白质相互作用通过gstpulldown实验可以发现新的蛋白质相互作用，从而为研究新的生物学过程和疾病机制提供线索。

确定蛋白质之间的相互作用通过gstpulldown实验可以检测到与特定蛋白质结合的其他蛋白质，从而确定蛋白质之间的相互作用。

蛋白质相互作用gstpulldown实验利用GST（谷胱甘肽巯基转移酶）融合蛋白作为诱饵，与细胞或组织提取物中的目标蛋白质进行结合，从而检测到与诱饵蛋白结合的目标蛋白。

分离和纯化通过将GST融合蛋白与谷胱甘肽结合的琼脂糖珠结合，可以分离和纯化与目标蛋白结合的复合物。

检测目标蛋白通过Western blot等技术对分离和纯化的复合物进行检测，从而确定与诱饵蛋白结合的目标蛋白。

实验步骤准备GST融合蛋白和谷胱甘肽结合的琼脂糖珠将GST融合蛋白与琼脂糖珠结合，形成用于捕获目标蛋白的诱饵。

细胞或组织提取从感兴趣的细胞或组织中提取蛋白质混合物。

孵育将细胞或组织提取物与GST融合蛋白结合的琼脂糖珠孵育，使目标蛋白与诱饵蛋白结合。

洗脱和检测洗脱与诱饵蛋白结合的目标蛋白，并利用Western blot等技术进行检测和分析。

02材料准备GST琼脂糖珠磷酸化激酶洗涤液抗体01020304用于绑定目的蛋白，是实验的关键试剂。

用于磷酸化目的蛋白，确保实验的准确性。

用于清洗实验中使用的各种仪器和试剂。

用于检测目的蛋白的表达和磷酸化状态。

离心机用于分离和纯化目的蛋白。

摇床用于孵育实验中的各种反应。

超声波破碎仪用于破碎细胞，释放细胞内的目的蛋白。

凝胶电泳仪和电泳槽用于检测目的蛋白的表达和磷酸化状态。

所需样本细胞或组织样本实验所需的生物样本，需确保其质量和活性。

gst pull down原理

GST Pull Down原理1. 什么是GST Pull DownGST拉伸消除（Pull Down）是一种视频处理技术，常见于旧电影转换为数字格式时使用。

它的目的是将常见的24帧每秒（FPS）的电影转换为更高的电视标准（例如30 FPS）。

Pull Down可以实现补偿和时序调整，以确保电影在更高的帧率下播放时没有抖动或重复帧。

2. Pull Down标准在了解GST Pull Down的原理之前，我们先来了解一下电影和电视的帧率标准。

2.1 电影帧率电影一般采用每秒24帧的拍摄速度进行录制。

这种帧率被广泛接受为电影的标准，因为它能够提供良好的视觉效果，并且在大屏幕上播放时不会引起观看者的不适。

2.2 电视帧率电视的帧率标准因地区不同而略有差异。

常见的帧率标准有30 FPS和60 FPS。

30 FPS被广泛应用于美国和其他一些国家的电视系统，而60 FPS则较常见于游戏和高清电视等应用中。

3. Pull Down原理为了将24 FPS的电影转换为电视标准的30 FPS或60 FPS，Pull Down技术通过在电影的每一帧之间插入额外的帧来实现。

这样可以在不改变原始影像的前提下，将电影平滑地转换为电视标准。

3.1 3:2 Pull Down3:2 Pull Down是最常用的Pull Down技术。

它使用一个3帧和一个2帧的模式来转换电影帧。

1.首先，将电影的第一帧复制两次，形成一个3帧序列（AAA）；2.然后，将电影的下一帧复制两次，形成一个2帧序列（BB）；3.重复以上步骤，直到整部电影被转换完毕。

这样，24 FPS的电影就可以按照30 FPS的标准进行播放。

可以按照相同的原理，将电影转换为60 FPS，只需要重复每一帧的处理即可。

3.2 2:2 Pull Down2:2 Pull Down是另一种常见的Pull Down技术，用于将24 FPS的电影转换为60 FPS。

1.首先，将电影的第一帧复制两次，形成一个2帧序列（AA）；2.然后，将电影的下一帧复制两次，形成另一个2帧序列（BB）；3.交替播放AA和BB序列，每秒播放60帧。

GST-pull-down试验方法(自己总结)

12.GST蛋白的表达和纯化12.1 GST蛋白的表达（1) 将表达GST融合蛋白的质粒转入BL21大肠杆菌菌株中。

（2) 挑单克隆于3ml LA(LB+Amp)培养基中，37℃摇菌过夜，获得种子液。

（3) 将种子液稀释于50ml2XYTA(YTG+Amp)培养基中，使起始OD600为0.1。

（4) 28℃,220rpm摇菌培养2小时。

（5) 加入50μl 100mM IPTG,16～27℃摇菌培养1～8小时。

（6) 收菌，将菌液倒入大离心管，2管/50ml菌液，4℃ 5krpmx5min离心，弃上清。

（7) 加入10ml PBS/管，重悬细胞,5krpm离心5min，弃上清。

（8) 加入2ml PBS/管，重悬细胞。

转移至5ml离心管。

（9) 超声破壁破壁前，在细胞悬液中加20μl 10mg/ml PMSF,80μl蛋白酶抑制剂(100x)。

破壁参数：Frequency:100～200w 60s， pause 20s run 40s,5cycles破至菌体由浑浊变为澄清。

加100μl 20% TritonX－100，冰上放置30min。

（10) 将裂解液分入1.5ml离心管中，4℃离心12krpm×10min，取上清。

（11) 吸取少量上清，加入蛋白电泳上样缓冲液，在沸水中煮3min。

离心（12krpm,1min），取上清作SDS-PAGE电泳，检测表达情况。

12.2 准备50%GST Sepharose 4Bslurry（1) 将原75%Glutathione Sepharose 4B的slurry弹至混匀。

（2) 取677μl原液/管，3krpm离心5min，弃上清。

（3) 加500μl PBS，颠倒混匀，3krpm离心5min，弃上清。

反复5次。

（4) 加500μl PBS，颠倒混匀，配成50%Glutathione Sepharose 4B备用。

12.3 GST融合蛋白的纯化（1) 在新鲜制备的细胞裂解液上清中加入20μl 50%Glutathione Sepharose 4B，4℃，摇床上摇，反应30min～60min。

GST-pull down

一、实验步骤1. 重组蛋白表达与纯化1）将将编码蛋白A的GST标签重组质粒转化到BL21或者Rosetta DE3感受态细胞中。

2）向高压灭菌的锥形瓶中倒入150 ml LB培养基，按照1:1000加入氨苄青霉素储液（工作浓度为50 μg/ml）。

用高压灭菌过的10 μl枪头挑取平板上的单克隆菌落，37℃条件下以200 rpm转速振荡培养约6 h，使OD600为0.6-0.8。

3）每管加入按照1:200-1:500加入IPTG（工作浓度为0.2-0.5 mmol/L），20-25℃条件下200 rpm继续振荡培养过夜。

4）4℃条件下4,000 rpm离心15 min，收集细菌沉淀。

a)尽量倒净上清，每管加入10 ml PBS缓冲液重悬细菌，置于冰上超声。

5）4℃，12,000 rpm离心30 min，留取上清并分装后（混匀）于-80℃保存，即为纯化的原核融合蛋白A。

2. GST-pull down实验1）将编码B蛋白的重组质粒转染入HEK293细胞中，48 h后提取细胞总蛋白。

2）留取50 µl蛋白加入2×蛋白样品缓冲液，混匀后100℃金属浴加热10 min使蛋白变性，室温12,000 rpm离心15 s，-20℃保存，作为Input。

3）用预冷PBS缓冲液洗涤Glutathione Sepharose 4B珠子，然后然后按照1:1的比例向Glutathione Sepharose 4B珠子中加入PBS缓冲液并混合均匀。

吸取珠子时应减掉枪尖部分，避免破坏珠子。

4）取适量纯化的原核融合蛋白A（SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色调整各个融合蛋白的蛋白量，如果有验证多个蛋白，比如截短蛋白，保证加到另一个蛋白里的蛋白量一样），加入30-40 µl预处理过的Glutathione Sepharose 4B珠子，4℃颠倒混匀4-6 h。

5）于4℃条件下12,000 rpm离心15 s，弃上清。

GSTpulldown实验技术ppt

详细描述
通过运用gstpulldown技术，科学家们可以研究特定蛋白质在药物作用过程中的变化情况，进而发现新的药物作用靶点。同时，该技术还可用于研究特定疾病过程中蛋白质的变化情况，为疾病的治疗提供理论依据。
gstpulldown技术在生物医药领域的应用
该技术在其他领域也有着广泛的应用，如环境保护、农业科学等。
总结词
通过运用gstpulldown技术，科学家们可以研究特定蛋白质与其他蛋白质之间的相互作用，进而揭示细胞生命活动的内在机制，为研究疾病的发生机制、药物作用靶点等提供了重要支撑。
详细描述
gstpulldown技术在基础研究中的应用
总结词
该技术在生物医药领域具有广泛的应用前景，为药物研发、疾病治疗等提供了新的思路。
数据分析的挑战
GST Pulldown实验产生的数据量庞大且复杂，需要专门的数据分析技术和工具进行处理。然而，目前数据分析的难度较大，限制了该技术的应用和发展。
随着生物学和医学研究的不断发展，GST Pulldown技术正在不断拓展应用领域。例如，该技术在研究疾病发生机制、药物筛选和生物技术等领域的应用正在不断增加。
加样
将蛋白样品加入到含有GST标签蛋白和Glutathione beads的试管中。
洗涤
将沉淀用水洗涤多次，以去除未结合的蛋白。
孵育
将加样后的试管在室温下孵育1hr左右。
裂解
向沉淀中加入适量的裂解液，将结合的蛋白从beads上解离下来。
离心
将孵育后的试管进行离心处理，分离出沉淀和上清液。
检测
对裂解后的蛋白进行Western blot检测。
总结词
通过运用gstpulldown技术，科学家们可以研究环境中特定蛋白质的变化情况，进而探讨环境污染对人类健康的影响。此外，该技术还可用于研究植物耐受逆境胁迫的机制，为提高作物抗逆性提供理论支持。