高效液相色谱分析法-资料
高效液相色谱法
第八章高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatograph)第一节概述（Generalization）以高压液体为流动相的液相色谱分析法称高效液相色谱法（HPLC）。
HPLC是20世纪70年代初发展起来的一种新的色谱分离分析技术。
具有分离效能高、选择性好、灵敏度高、分析速度快、适用范围广（样品不需气化，只需制成溶液即可）的特点，适用于高沸点、热不稳定有机及生化试样的分离分析。
HPLC基本方法是用高压泵将具有一定极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂泵入装有填充剂的色谱柱，经进样阀注入的样品被流动相带入色谱柱内进行分离后依次进入检测器，由记录仪、或数据处理系统记录色谱信号再进行数据处理而得到分析结果。
高效液相色谱法按固定相不同可分为液－液色谱法和液－固色谱法；按色谱原理不同可分为分配色谱法（液－液色谱）和吸附色谱法（液－固色谱）等。
目前，化学键合相色谱应用最为广泛，它是在液－液色谱法的基础上发展起来的。
将固定液的官能团键合在载体上，形成的固定相称为化学键合相，具有固定液不易流失的特点，一般认为有分配与吸附两种功能，常以分配作用为主。
C18（ODS）是最常使用的化学键合相。
根据固定相与流动相极性的不同，液-液色谱法又可分为正相色谱法和反相色谱法，当流动相的极性小于固定相的极性时称正相色谱法，主要用于极性物质的分离分析；当流动相的极性大于固定相的极性时称反相色谱法，主要用于非极性物质或中等极性物质的分离分析。
《中国药典》中有50种中成药的定量分析采用HPLC法，在中药制剂分析中，大多采用反相键合相色谱法。
一、高效液相色谱法的特点目前经典LC主要用于制备，若用于分析则采用脱机或非连续检测。
经典LC填料缺陷，通常是填料粒度大、范围宽、不规则，不易填充均匀，扩散和传质阻力大，谱带展宽加大。
它存在致命弱点：速度慢、效率低和灵敏度低。
HPLC填料（高效固定相）颗粒细、直径范围窄、能承受高压。
仪器分析 高效液相色谱法
第17章HPLC法17.1 内容提要17.1.1 基本概念高效液相色谱法──在经典液相色谱法的基础上，引入了气相色谱(GC)的理论，在技术上采用了高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器，使之发展成为高分离速率、高分离效率、高检测灵敏度的高效液相色谱法，易称为现代液相色谱法。
高效液相色谱仪──采用了高压输液泵、高效固定相和高灵敏度检测器等装置的液相色谱仪称为高效液相色谱仪。
梯度洗脱──用两种(或多种)不同极性的溶剂，在分离过程中按一定程序连续的改变流动相的浓度、配比和极性，使样品中各组分能在最佳的分配比下出峰的操作技术。
也称为梯度淋洗。
低压梯度──又称外梯度，特点是先混合后加压。
它是采用在常压下预先按一定的程序将溶剂混合后再用泵输入色谱柱系统，易称为泵前混合。
高压梯度──又称内梯度，特点是先加压后混合。
它有两台高压输液泵、梯度程序器(或计算机及接口板控制)、混合器等部件组成。
两台泵分别将两种极性不同的溶剂输入混合器，经充分混合后进入色谱柱系统，是一种泵后高压混合形式。
柱外效应──由色谱柱以外的因素引起的色谱峰形扩展的效应。
柱外因素常指从进样口到检测器之间，除色谱柱以外的所有死时间，如进样器、连接管、检测器等的死体积，都会导致色谱峰形加宽、柱效下降。
液固吸附色谱法──以固体吸附剂为固定相，吸附剂表面的活性中心具有吸附能力，样品分子被流动相带入柱内，它将与流动相溶剂分子在吸附剂表面发生竞争吸附性。
K值大的强极性组分易被吸附，K值小的弱极性组分难被吸附，样品组分因此被分离。
液液分配色谱法──根据物质在两种互不相溶(或部分互溶)的液体中溶解度的不同，有不同的分配，从而实现分离的方法。
分配系数较大的组分保留值也较大。
正相分配色谱法──流动相极性低而固定相极性高的称为正相分配色谱法。
反相分配色谱法──流动相极性高而固定相极性低的称为反相分配色谱法。
化学键合相──利用化学反应将有机分子键合到载体表面上，形成均一、牢固的单分子薄层而形成的各种性能的固定相。
高效液相色谱分析法概述
高效液相色谱分析技术及其新的发展与应用余建军(陕西科技大学生命科学与工程学院，西安710021)1 高效液相色谱法概述高效液相色谱法（high performanc，liquid chromatography，HPLC）是在经典液相色谱法基础上发展起来的一种新型分离、分析技术。
经典液相色谱法由于使用粗颗粒的固定相，填充不均匀，依靠重力使流动相流动，因此分析速度慢，分离效率低。
新型高效的固定相、高压输液泵、梯度洗脱技术以及各种高灵敏度的检测器相继发明，高效液相色谱法迅速发展起来[1]。
高效液相色谱法与经典液相色谱法比较，具有下列主要特点：（1）高效由于使用了细颗粒、高效率的固定相和均匀填充技术，高效液相色谱法分离效率极高，柱效一般可达每米104理论塔板。
近几年来出现的微型填充柱（内径lmm）和毛细管液相色谱柱（内径0.05umm），理论塔板数超过每米105，能实现高效的分离。
（2）高速由于使用高压泵输送流动相，采用梯度洗脱装置，用检测器在柱后直接检测洗脱组分等，HPLC完成一次分离分析一般只需几分钟到几十分钟，比经典液相色谱快得多。
（3）高灵敏度紫外、荧光、电化学、质谱等高灵敏度检测器的使用，使HPLC 的最小检测量可达10-9～10-11g（4）高度自动化计算机的应用，使HPLC 不仅能自动处理数据、绘图和打印分析结果，而且还可以自动控制色谱条件，使色谱系统自始至终都在最佳状态下工作，成为全自动化的仪器。
（5）应用范围广（与气相色谱法相比）HPLC 可用于高沸点、相对分子质量大、热稳定性差的有机化合物及各种离子的分离分析。
如氨基酸、蛋白质、生物碱、核酸、甾体、维生素、抗生素等。
（6）流动相可选择范围广它可用多种溶剂作流动相，通过改变流动相组成来改善分离效果，因此对于性质和结构类似的物质分离的可能性比气相色谱法更大。
（7）馏分容易收集更有利于制备2 色谱法分类高效液相色谱法按固定相不同可分为液-液色谱法和液-固色谱法；按色谱原理不同可分为分配色谱法（液-液色谱）和吸附色谱法（液-固色谱）等[2]。
仪器分析-高效液相色谱法
流动相的选择与制备
选择合适的流动相
根据被分析化合物的性质， 选择适当的流动相，如有 机溶剂、缓冲液等。
流动相的配制
按照实验要求，准确称量 流动相组分，混合均匀， 并进行过滤和脱气处理。
流动相的梯度洗脱
对于多组分分离，可以采 用梯度洗脱技术，以提高 分离效果。
仪器的开机与平衡
开机
按照仪器说明书，打开仪器电源， 启动仪器操作系统。
药物制剂质量控制
高效液相色谱法可以用于药物制剂的质量控制， 检测制剂中药物的含量、纯度和稳定性等指标。
环境样品分析中的应用
污染物检测
高效液相色谱法可以用 于检测环境中的有机污 染物，如农药、多环芳 烃等，为环境污染控制 和治理提供依据。
饮用水质量检测
通过高效液相色谱法可 以检测饮用水中的有害 物质，如消毒副产物、 微量有机物等，保障公 众的饮用水安全。
粒径
色谱柱的粒径影响分离效 果和分离时间。粒径越小， 分离效果越好，但分离时 间越长。
长度
色谱柱的长度影响分离效 果和载样量。长度越长， 分离效果越好，但载样量 越小。
检测器
类型
常用的检测器有紫外-可见光检测器、荧 光检测器、电导检测器等，根据被测物质 的性质和检测需求选择合适的检测器。
响应速度
线性范围
质。
测定水体、土壤、空气 中的污染物和有害物质。
用于蛋白质、核酸、细 胞等生物大分子的分离
和检测。
高效液相色谱法的优势与局限性
优势
高分离效能、高灵敏度、高选择 性、应用范围广。
局限性
需要专业操作人员、仪器昂贵、 样品前处理复杂、耗时长。
02 高效液相色谱法的仪器构成
CHAPTER
【大学课程】分析化学第20章 高效液相色谱法
梯度洗脱装置
外梯度（高压梯度）: 利用两台高压输液泵，
将两种不同极性的溶剂按 一定的比例送入梯度混合 室，混合后进入色谱柱。
内梯度（低压梯度）: 一台高压泵, 通过比
例调节阀,将两种或多种 不同极性的溶剂按一定 的比例抽入高压泵中混 合。
2021/11/1
（2）进样装置
流路中为高压力工作状态， 通常使用耐高压的六通阀进样装置， 其结构如图所示：
3 L2
L2
0.75cm
2021/11/1
2021/11/1
液相色谱仪（3）
Agilent 1200 LC Systems
安捷伦1200 液相色谱系统
2021/11/1
液相色谱仪（4）
2021/11/1
二、流程及主要部件
1.流程
2021/11/1
2.主要部件
（1）高压输液泵：
主要部件之一，压力：150～350×105 Pa。 为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（<10μm），液 体的流动相高速通过时，将产生很高的压力，因此高压、高 速是高效液相色谱的特点之一。 应具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可调、耐腐蚀等特性
以固体吸附剂为固定相，如硅胶、氧化铝等，较常使用的 是5～10μm的硅胶吸附剂。流动相可以是各种不同极性的 一元或多元溶剂。
（二）液-液分配色谱：LLC
有正相色谱和反相色谱之分
正相色谱（NPC)
反相色谱(RPC)
固定相极性
大
小
流动相极性
小
大
流动顺序 流动相极性↑，
极性小的组分先
流出 k↓，tR↓
极性大的组分先
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小结
• 掌握Van Deemter 方程在HPLC中的表现形式； • 掌握正相色谱和反相色谱的区别； • 掌握化学键合相色谱，特别是反相键合相色谱
环境仪器分析 第七章 高效液相色谱法
主要区别：固定相差别，输液设备和检测手段
柱内径1~3cm，固定相粒径>100μm 且不均匀 常压输送流动相 柱效低（H↑，n↓） 分析周期长 无法在线检测
1．经典LC：仅做为一种分离手段
2．HPLC：分离和分析
柱内径2~6mm，固定相粒径<10μm（球形，匀浆装柱） 高压输送流动相 柱效高（H↓，n↑） 分析时间大大缩短 可以在线检测
A 2 dp
next
A dp
， dp A H ， n 柱效
图示
续前
3）传质阻抗项及其影响
C C m C sm C s C m C sm （忽略固定相传质阻抗 ）
注：只考虑流动相和静态流动相的传质阻抗 忽略固定相传质阻抗
A dp
B 2 D m 2 D g
B t R ，B D g
T T D g 或D g M df 2 C Cm C s C g Cl Cl Cl Dl
DL T
续前
2. HPLC ： H A C u
B 2 D m
第七章
高效液相色谱法
High Pressure Liquid Chromatography
第一节
概述
高效液相色谱法：以气相色谱为基础，在经典液相 色谱实验和技术基础上建立的一种液相色谱法
一、HPLC与经典LC区别 二、HPLC与GC差别
三、高效液相色谱的特点
四、高效液相色谱的局限性
一、HPLC与经典LC区别
•
•
• • •
液-液分配色谱技术的关键是相体系选择。 可通过调节流动相的极性，来获得良好的柱 效和缩短分析时间。 液-液分配色谱可用于几乎所有类型化台物， 极性的或非极性的、有机物或无机物、大分 于或小分于物质的分离，只要官能团不同、 或者官能团数目不同、或者是分子量不同均 可获得满意的分离。
仪器分析第4讲 高效液相色谱法
经典液相色谱法 75-600 0.01-1.0 1-20 50-200 2-50 1-10
高效液相色谱法 3-50（常用5-10）
20-300 0.05-1.0
2-30 104-105 10-6-10-2
2．高效液相色谱法与气相色谱法
（l）气相色谱法分析对象只限于分析气体和 沸点较低的化合物，它们仅占有机物总数 的20％．对于占有机物总数近80％的那些高 沸点、热稳定性差、摩尔质量大的物质， 目前主要采用高效液相色谱法进行分离和 分析．
3. 柱外效应
由于色谱柱之外的因 素引起的色谱峰的展 宽，例如进样系统、 连接管路及检测器的 死体积等。
3-3 高效液相色谱的类型及其分离原理
液—液分配色谱及化学键合相色谱 液—固吸附色谱 离子交换色谱 离子色谱 空间排阻色谱
1、 液-液分配色谱
liquid- liquid partition chromatography
4、 离子色谱
ion chromatography
离子色谱法是由离子交换色谱法派生出来的一种 分离方法。由于离子交换色谱法在无机离子的分 析和应用受到限制。例如，对于那些不能采用紫 外检测器的被测离子，如采用电导检测器，由于 被测离子的电导信号被强电解质流动相的高背景 电导信号掩没而无法检测。
2、 液-固吸附色谱
liquid-solid adsorption chromatography
流动相为液体，固定相为固体吸附剂
分离原理：利用溶质分子占据固定相表面吸附 活性中心能力的差异
分离前提：K不等或k不等
液—固吸附色谱
固体吸附剂主要类型： 极性的硅胶（应用最广） 氧化铝 分子筛 非极性的活性炭
1971年科克兰等人出版了《液相色谱的现代实践》一 书，标志着高效液相色谱法（HPLC）正式建立。
《环境仪器分析》第九章 高效液相色谱法
2019/10/31
东华大学Hale Waihona Puke 相表面存在的某种特异性亲和
力，进行选择性分离。
先在载体表面键合上一种
具有一般反应性能的所谓间隔
臂(环氧、联胺等)，再连接上配
基(酶、抗原等)，这种固载化的
配基将只能和具有亲和力特性
吸附的生物大分子作用而被保
留，没有这种作用的分子不被保留。
2019/10/31
东华大学
六、亲和色谱（Affinitychromatograph）
定相上的吸附作用不同来进行分离。 固 定 相：固体吸附剂如硅胶、氧化铝、活性炭、聚酰胺、硅
-镁吸附剂等，较常使用的是5～10μ m的硅胶吸附剂。 在高效液相色谱法中，表面多孔型或全多孔型都可作吸附色谱
中的固定相，它们具有填料均匀、粒度小、孔穴浅等优点，能极 大提高柱效。
但表面多孔型由于试样容量较小，目前最广泛使用的还是全多 孔型微粒填料。
• 选择溶剂还必须与检测器相匹配。常用的流动相有四氢呋喃、 甲苯、氯仿、二甲基酰胺和水等。
• 分离对象：以水溶液为流动相的凝胶色谱适用于水溶性样品， 以有机溶剂为流动相的凝胶色谱适用于非水溶性样品。
2019/10/31
东华大学
六、亲和色谱（Affinity chromatograph）
原理：利用生物大分子和固定
（2）气相色谱采用流动相是惰性气体，它对组分没有亲和力， 即不产生作用力，仅起到载气作用。而HPLC流动相可选用不 同极性的液体，对组分产生作用力，流动相对分离起很大作用。
仪器分析高效液相色谱法
仪器分析高效液相色谱法高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography，简称HPLC）是目前广泛应用于仪器分析领域的一种重要分析方法。
它通过利用柱子中流动的流动相和样品的物理化学性质的相互作用，使样品组分在柱子中发生分离，再通过检测器对各组分进行定量或定性分析。
仪器分析高效液相色谱法主要由流动相供给系统、进样器、柱子、检测器和数据处理系统等组成。
流动相供给系统通过恒压或恒流的方式将流动相送入进样器中，进样器将样品注入柱子中，柱子根据物理化学性质的差异，使不同组分发生分离，之后检测器检测进入检测器的各组分的浓度，并通过数据处理系统对数据进行分析和整理。
高效液相色谱法具有分离效率高、分离时间短、适用范围广等特点。
与传统的液相色谱法相比，高效液相色谱法的流动相的流速更高，柱子填充物颗粒更小，从而大大提高了分离效率。
同时，高效液相色谱法对样品的需求量较小，具有较好的分析灵敏度。
因此，高效液相色谱法被广泛应用于生物、环境、食品、药物、化工等领域的组分分析和质量控制。
在生物领域中，高效液相色谱法常用于生物样品中代谢产物和药物的分析。
通过绑定柱子、手性柱子以及使用不同的检测器，可以对复杂的生物样品中的不同组分进行准确的分析和定量测试。
例如，对尿液中的代谢产物进行分析可以帮助人们了解人体健康状态，对药物的残留物进行分析可以保证食品和水的安全等。
在环境领域中，高效液相色谱法常用于水质、大气和土壤等环境样品中有机污染物的分析。
通过连接各种不同相的柱子，可以对复杂的环境样品中的有机污染物进行有效的分离，使用紫外-可见光检测器或质谱检测器可以对分离后的各组分进行检测和定量。
在食品领域中，高效液相色谱法常用于食品中添加剂、农药残留物和食品中的有害物质的分析。
通过选择合适的柱子和检测器，可以对复杂的食品样品进行分离和检测，以保证食品的安全性和质量。
在药物领域中，高效液相色谱法常用于药品中活性成分和杂质的分析。
分析化学 高效液相色谱法
'
2
W
H eff
L neff
2、 分离度
R 2(tr2 tr1 ) neff • 1 (W1 W2 ) 4
3、 速率方程
H A B Cu u
B 2DM
溶质在液相流动相 中的扩散系数，约 为气相中扩散系数
的万分之一
在大多数情况下， B 0 u
修正的速率方程： H A Cu
柱径：0.9 cm
F：30 mL/h
t分离: >20 h
高效液相色谱仪
经典液相色谱 HPLC
150-200 μm 3-10 μm 重力或低压泵 高压泵
HPL C
t分离：1 h
很慢
快(1-10mL/min)
与经典液相色谱法相比
颗粒极细（一般为10m以下）、规则均匀的固定相，(键合相) 传质阻抗小，柱效高，分离效率高；
注意：
流动相的pH一般应在3-8，否则会引起硅胶溶解；(也有适用宽pH 范围的键合相)。
固定相
固体吸附剂
硅胶－强极性 氧化铝－弱极性 活性炭－非极性 分子筛－强极性 高分子多孔微球(GDX)
硅胶表面结构
硅胶表面结构经热处理发生的变化
二、化学键合相色谱法的流动相
对流动相的要求：
与固定相不发生化学反应。
2、固定相
键合烷基的疏水性随碳链的延长而增 加，溶质的k也增大。 硅胶表面键合烷基的浓度越大，则溶 质的k越大。
3、流动相
极性越强，洗脱能力越弱，使溶质的k越大
溶剂种类：水为弱溶剂，醇为强溶剂
溶剂比例：水的比例增加，使k增大 中性盐的加入：使中性溶质的k增大
pH：影响弱酸、弱减的离解
流动相的pH降低，弱酸k增大，tR增大； 弱碱k变小。
仪器分析 第7章 高效液相色谱法
由非极性固定相和极性流动相所组成的 液相色谱体系，与正相 HPLC 体系正好相反。 其代表性的固定相是十八烷基键合硅胶 (ODS 柱），代表性的流动相是甲醇和乙腈。 是当今液相色谱的最主要分离模式。
液-液分配色谱固定相的液体往往容易溶解到流 动相中去，所以重现性很差，不大为人们所采用。 后来发展起来的键合固定相以化学键合的方法 将功能分子结合到惰性载体上，固定相就不会溶解 到流动相中去了。
(3)工作温度： 气相色谱一般都在较高温度下进行的，而 高效液相色谱法则经常可在室温条件下工作。
高效液相色谱法主要类型
类 型 液固吸附色谱 主要分离机理 吸附能，氢键 主要分析对象或应用领域 异构体分离、族分离，制备
液液分配色谱 凝胶色谱 离子交换色谱
手性色谱 亲和色谱
疏水分配作用 溶质分子大小 库仑力
由于离子对化合物A-B+具有疏水性，因而 被非极性固定相（有机相）提取。组分离 子的性质不同，它与反离子形成离子对的 能力大小不同以及形成的离子对疏水性质 不同，导致各组分离子在固定相中滞留时 间不同，因而出峰先后不同。
B. 键合相反相离子对色谱法
离子对色谱法类型很多，根据流动相和 固定相的极性可分为反相离子对和正相离子 对色谱法。其中以键合相离子对色谱法最重 要。这种色谱法的固定相采用非极性的疏水 键合相［如十八烷基键合相（ ODS ）等］， 流动相为加有平衡离子（反离子）的极性溶 液（如甲醇—水或乙睛—水）。
抑制柱离子色谱的原理：
以阴离子分析为例：
分析柱反应：
R—Cl + NaOH R—OH + NaCl
抑制柱反应： + NaOH
R—Na + H2O
以阳离子分析为例：
《仪器分析》4-高效液相色谱法
(4) 示差折光检测器： 是一种中等灵敏度(10–6 g/mL)的通用型检测器。
是利用纯流动相和含有待测组分的流动相之间折射率的 差别进行检测的。
可分为三类：反射式；折射式（偏振式）和干涉式。常 用前两种。
优点：灵敏度适宜，操作简便是一种通用型的检测器； 缺点：对温度变化敏感，不能用于梯度洗脱。 应用范围：聚合物、糖。还用于分析以紫外检测和荧光
精选课件
药典中的液相色谱检测器
精选课件
常用的检测器:
(1) 紫外光度检测器：是一种选择性浓度检测器，仅 对那些在紫外波长有吸收的物质有响应。
作用原理：基于待测试样对特定波长的紫外光有选择 性的吸收，试样浓度与吸光度的关系服从比尔定律。
结构：
1－低压汞灯 2－透镜 3－遮光板 4－测量池 5－参比池 6－紫外滤光片 7－双紫外光敏电阻
精选课件
⑶ 色谱柱 GC柱很长，特别是毛细管柱可长至几十米至上百米，柱效
很高(理论塔板数N = 104~106)。HPLC柱较短，一般为15~25 cm，柱效(理论塔板数N = 103~104)，低于GC柱。 ⑷ 检测器
与GC相比，HPLC检测器种类较多。 ⑸ 制备色谱
GC难以制备样品，因为进样量小，难以收集或被破坏。 HPLC可进行制备，即制备色谱。
精选课件
2. 进样系统
在高效液相色谱中，常用的进样方式： 高压阀进样：优点是能用于高压，适于大体积进样，重现性
好；缺点是进样阀进样时需排掉一部分试样，不同的进样 量需用不同的定量管，同时峰的扩展也比注射进样大。 微量注射器进样：也可由微量注射器注入取样环少量样品， 即采用较大体积取样环而进少量试样，进样量由注射器控 制，试样不充满取样环，只填充一部分体积。
高效液相色谱法HPLC-精品文档
3、离子交换色谱
基本原理：组分在固定相上发生的反复离子交换反应；组分 与离子交换树脂（固定相）之间亲和力的大小与离子半径、 电荷、存在形式等有关。亲和力大，保留时间长； 阳离子交换：R—SO3H +M+ = R—SO3 M + H +
阴离子交换：R—NR4OH +X- = R—NR4 X + OH固定相：阴离子离子交换树脂或阳离子离子交换树脂；
2、液-固吸附色谱
基本原理：各组分在固定相吸附剂上竞争性吸附与解吸 固定相：固体吸附剂为，如硅胶、氧化铝等，较常使用的 是5～10μm的硅胶吸附剂； 流动相：各种不同极性的一元或多元溶剂。
特点：适用于分离相对分子质量中等的油溶性试样，对具 有官能团的化合物和异构体有较高选择性；
缺点：非线形等温吸附，常引起峰的拖尾
目 录
一、液相色谱分析法的发展 二、液相色谱分析法的特点 三、液相色谱仪 四、液相色谱分析法的原理 五、高效液相色谱法的主要类型及原理 六、高效液相色谱分析法的应用 七、分离数据的处理方法 八、参考文献
一、液相色谱分析法的发展
• 20世纪初： 俄国植物学家茨维特提出经典液相色谱法 。经典液相色谱法包括柱色谱、薄层色谱、纸 色谱。 • 20世纪60年代末： 随着色谱理论的发展、高效细微固定相的 开发、高压恒流泵及高灵敏度检测器的应用， 高效液相色谱法得到了突破性的发展。
举例：
苯乙胺类药物中重酒石酸去甲肾上腺素注射液 的高效液相色谱测定法。
色谱条件与系统适应性试验：十八烷基硅烷键 合硅胶为填充剂；以0.14%更烷基磺酸钠溶液— —甲醇(65:35)，用磷酸调节PH值至3.0作为流动 相；流速为每分钟1ml；检测波长为280nm。理论 板数按重酒石酸去甲肾上腺素峰值计算应不低于 3000。
高效液相色谱法(HPLC)简介
高效液相色谱法分离过程
主要在于固定相的性质、形状及粒度，其次 差别： 是检测手段和输液设备。
经典液相色谱 固定相： 粒度：60~600μｍ（多孔） 柱长：10~200cm（d=10~50mm） n 约为 2~50/m
流动相：靠重力输送
经典液相色谱无在线检测器
缺点：
①粒度范围宽、不规则，不易填充均匀，扩散和传质阻 力大。 ②无检测设备，分析速度慢、效率低。 只能作为分离手段
（3）不能完全替代气相色谱
（4）不适于分析受压分解、变性的具有生物活性的
Hale Waihona Puke 生化样品。高效液相色谱法与其他分析方法一样，
不是尽善尽美的。
第二节 高效液相色谱法的基本理论
一、高效液相色谱参数 1.定性参数 tR 、 t 0 、 t’ R t’R= tR- t0 2.柱效参数 σ、 W1/2 、W W=4 σ 或 w=1.699W1/2 n=（ tR / σ）2 H=L/n
四、高效液相色谱法的应用范围和局限性
1.应用范围 高效液相色谱法适于分析高沸点、受热不稳定易 分解、分子量大、不同极性的有机化合物；生物活性 物质和多种天然产物；合成和天然高分子化合物。 涉及石油化工产品、食品、药品、生物化工产品 及环境污染物。约占全部有机物的80%。 2.方法的局限性
（1）使用多种溶剂为流动相，成本高，污染环境 （2）缺少通用检测器
美国药典委员会（USPC）成立于1820年，至今近200 年。出版发行了25版药典。 75年（19版）将HPLC载入药典 20版-62项；21版-363项；22版-871项；23版-1188项； 24版-含量测定法：1386项 鉴别：519项 杂质检查：206项
如今：在评价世界各国药典水平时，HPLC法成为 反映各国药典先进性的重要指标之一。
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疏溶剂理论
在键合相反相色谱法中溶质的保留主要不是 由于溶质分子与键合相间的色散力，而是溶质分 子与极性溶剂分子得的排斥力，促使溶质分子与 键合相的烃基发生疏水缔合，且缔合反应是可逆 的。容量因子k与自由能变化ΔG的关系如下式：
lnk=lnVs/Vm — ΔG/RT ΔG越大，被分离组分的k越小，保留时间越 短。
• 分离酸(RCOOH)：流动相pH=7.5
K=[RCOO--PICA+]S／[RCOO-·PICB+]m RPIC的出柱顺序与RHPLC一致，分配系数 k除与RHPLC有同样的影响规律外，还与PIC试 剂的碳链长度有关。碳链长度增加，k相应增 大，在足够生成离子对的前捉下，保留时间与
PIC的浓度关系不大。
• 固定相——氰基与氨基化学极性键合相
– 氰基化学键合相的分离选择性与硅胶相似，但 极性小于硅胶，即用相同的流动相及其它条件 相同时，同一组分的保留时间将小于硅胶。
– 氨基键合相与硅胶的性质有较大差异，前者为 碱性；后者为酸性。氨基键合相色谱柱是分析 糖类最重要的色谱柱也称为碳水化合物柱。
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2．HPLC：分离和分析
柱内径2~6mm，固定相粒径<10μm（球形，匀浆装柱） 高压输送流动相 柱效高（H↓，n↑） 分析时间大大缩短 可以在线检测
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高效液相色谱法与经典液相色谱法对比
经典LC HPLC
固定相,
一般规格 特殊规格
固定相粒度（μm） 75-500 3-20
固定相粒度分布（RSD）20％-30％ ＜5％
按分离机 制分类
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二、化学键合相色谱法
（一）反相键合相色谱法：
• 典型的反相键合色谱法是用非极性固定 相和极性流动相组成的色谱体系。
– 固定相：常用十八烷基（octadecylsily，缩 写ODS或C18）键合相；
– 流动相：常用甲醇-水或乙腈-水。
• 非典型反相色谱系统，用弱极性或中等 极性的键合相和极性大于固定相的流动 相组成 。
– 在作正相洗脱时，流动相的极性增大，洗脱 能力增加，k减小，tR减小；反之k与fR增大。
– 分离结构相近的组分时，极性大的组分后出 柱。
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续前
流动相极性与k的关系： 流动相极性↑，洗脱能力↑，组分tR↓，k↓
出柱顺序：结构相近组分，极性小的组分先出柱 极性大的组分后出柱
适用： • 氰基键合相与硅胶的柱选择性相似（极性稍小）
B + H BH+
+
RSO3Na (PICB)
RSO3－+Na+
[BH+·RSO3－]
固定相（s） [BH+•RSO3－]
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分配系数
• 反相离子对色谱法的分配系数与液·液色谱中的 K的含义类似：
• 分离碱(RNH2)：流动相pH＝3—3.5， K=[RNH3+•PICB-]S／[RNH3+·PICB-]M
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续前
2．流动相差别 GC：流动相为惰性气体 • 组分与流动相无亲合作用力，只与固定相作用 HPLC：流动相为液体 • 流动相与组分间有亲合作用力，为提高柱的选择性、
改善分离度增加了因素，对分离起很大作用
• 流动相种类较多，选择余地广 • 流动相极性和pH值的选择也对分离起到重要作用
毫摩尔/克干树脂。 非抑制型: 当进一步降低分离柱中树脂的交换容量 (0.007～0.07毫摩尔/克干树脂),使用低浓度、低电离度 的有机弱酸及弱酸盐作淋洗液，如苯甲酸、苯甲酸盐等。 检测器可直接与分离柱相连，不需抑制柱。
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离子色谱连续抑制装置图
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离子色谱连续抑制原理图
第二十章 高效液相色谱分析法
high performance liquid chromatograph
一、高效液相色谱法的主要类型 和原理 二、高效液相色谱法的固定相和 流动相及其选择 三、高效液相色谱仪
四、高效液相色谱分析方法
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一、液相色谱仪器
high performance liquid chromatograph
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2、流动相的极性与容量因子的关系
• 流动相的极性增大，洗脱能力降低，溶质 的k 增大，tR增大；
• 流动相的极性减小，洗脱能力加强，溶质 的k与tR减小。
• 分离结构相近的组分时，极性大的组分先 出柱。适用：非极性~中等极性组分 （HPLC80%问题）
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（二）正相键合相色谱法
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常用离子对试剂
• 分析碱类成分
– 用烷基磷酸盐为离子对试剂。常用正戊 (PIC-B5)、正己（PIC-B6)、正庚(PIC-B7) 及正辛磺酸钠(PIC-B8)。
• 分析酸类成分
– 常用四丁基季铵盐（PIC-A），如四丁 基胺磷酸盐(TBA)等：
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分离机制
流动相（m）
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二、高效液相色谱法的特点
feature of HPLC
特点：高压、高效、高速 高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效分离分析方法。
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一、HPLC与经典LC区别
经典LC 与HPLC的主要区别：固定相差别，输液设备和检测手段
1．经典LC：仅做为一种分离手段
柱内径1~3cm，固定相粒径>100μm 且不均匀 常压输送流动相 柱效低（H↑，n↓） 分析周期长 无法在线检测
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1.离子色谱具有以下优点
（1）分析速度快
可在数分钟内完成一 个试样的分析； （2）分离能力高
在适宜的条件下，可使 常见的各种阴离子混合物 分离；例：使用双柱法， 在十几分钟内，可使七种 阴离子完全分离。
（3）分离混合阴离子的最有效方法 （4）耐腐蚀，仪器流路采用全塑件，玻璃柱
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概述
• 高效液相色谱法（high performance liquid chromatography；HPLC）是在60年代分 析方法。
• 它与经典液相色谱法的主要区别是：
– 流动相改为高压输送、 – 采用高效固定相、 – 具有在线检测器、 – 仪器化。
离子色谱法
• 色谱柱： 阴离子交换树脂柱
• 抑制柱： 阳离子交换树脂柱
• 被分离组分： 硫酸盐、硝酸盐
• 流动相：碳酸钠 • 检测器：电导检测器
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2、离子色谱装置类型
suppressed apparatus of IC
抑制型：抑制柱型、连续抑制型 分离柱中离子交换树脂的交换容量通常在0.01～0.05
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高压液相色谱法特点：
“三高” “一快” “一广” 高柱效——n=104片/米，柱效高（远高于一般LC） 高灵敏度 高选择性 分析速度快 应用范围广泛（可分析80%有机化合物）
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第一节 高效液相色谱法的
主要类型和原理
一、高效液相色谱仪的 主要类型
二、化学键合相色谱法
方法。
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一).离子色谱法原理
离子交换原理，与传统离子交 换的不同点： 采用交换容量非常低的特制离子 交换树脂为固定相； 细颗粒柱填料，高柱效；采用高 压输液泵； 低浓度淋洗液或本底电导抑制（在分离柱后，采用抑制柱 来消除淋洗液的高本底电导）； 可采用电导检测器，快速分离分析微量无机离子混合物； 各种抑制装置及无抑制方法的出现，发展迅速。
相同：兼具分离和分析功能，均可以在线检测 主要差别：分析对象的差别和流动相的差别
1．分析对象 GC：能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品， 高沸点、挥发性差、热稳定性差、离子型及 高聚物的样品不可检测 占有机物的20% HPLC：溶解后能制成溶液的样品， 不受样品挥发性和热稳定性的限制 分子量大、难气化、热稳定性差及高分子 和离子型样品均可检测 用途广泛，占有机物的80%
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三 其他高效液相色谱法
一)离子色谱法(Ion Chromatography,简称IC)
以无机、特别是无机阴离子混合物为主要分析 对象, 在七十年代出现、八十年代迅速发展。
• 传统离子交换色谱存在着两个难于解决的问 题：
• (1)需要高浓度淋洗液洗脱且洗脱时间很长； • (2)洗脱后的组分缺乏灵敏、快速的在线检测
选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相
可以增大分离选择性 3．操作条件差别
GC：加温操作 HPLC：室温；高压（液体粘度大，峰展宽小）
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三、高效液相色谱仪流程图
1．贮液罐（滤棒，可滤去颗粒状物质） 2．高压泵（输液泵） 3．进样装置 4．色谱柱——分离 5．检测器——分析 6．废液出口或组分收集器 7．记录装置
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优缺点与用途
• 避免用普通的HPLC仪器长期进行IEC时，流 动相(酸、碱)对泵与慌路的腐蚀。
• 使反相色谱法得以用于有机酸、碱、盐的分 离，如生物碱、有机酸、磺胺类药物、某些 抗生素与维生素等。
• 在测定人体内碱性药物的血药浓度时，有利 于与其代谢产物和内源性酸性杂质分离。
• PIC试剂的价格较贵
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3、离子色谱的应用
application of IC
阴离子分析: 双柱；薄壳型阴离子交换树脂分离柱(3×250mm), 流 动 相 ： 0 . 0 0 3 mol·L-1 NaHCO3 / 0.0024 mol·L-1 Na2CO3，流量138 mL/hr。 七种阴离子在20分钟内基本上得到完全分离，各组 分含量在3～50 ppm。