提取酵母质粒

合集下载

酵母双杂方法(改)

培养基（1）细菌培养基LB培养基（1 L）：5 g酵母提取物，10 g氯化钠，10 g胰蛋白胨，pH 7.0；SOB培养基（1 L）：5 g酵母提取物，0.5 g氯化钠，20 g胰蛋白胨，2.5 mL 1 M氯化钾，pH 7.0，高压灭菌后在每100 mL的小份中加1 mL 1 M氯化镁。

（2）酵母生长培养基100 mL YPD培养基：1 g酵母提取物，2 g胰蛋白胨，0.02 mL 10 M NaOH，双蒸水95 mL，固体加2 g琼脂粉。

高压后加入5 mL 40%葡萄糖；100 mL YPDA培养基：基本配方同上。

高压后加入0.8 mL 100×Ade和5 mL 40%葡萄糖；100 mL SD/-Leu培养基：0.7 g无氨基酵母氮源，0.07 g四缺物, 0.02 mL 10 M NaOH，双蒸水95 mL，固体加2 g琼脂粉。

高压后加入0.8 mL 100×Ade，5 mL 40%葡萄糖，0.2 mL 500×Trp和0.2 mL 500×His。

100 mL SD/-Trp培养基：0.7 g无氨基酵母氮源，0.07 g四缺物, 0.02 mL 10 M NaOH，双蒸水95 mL，固体加2 g琼脂粉。

高压后加入0.8 mL 100×Ade，5 mL 40%葡萄糖，1 mL 100×Leu和0.2 mL 500×His；100 mL SD/-Trp/-Ade培养基：基本成分同上。

高压后加入5 mL 40%葡萄糖，1 mL 100×Leu和0.2 mL 500×His；100 mL SD/-Trp/-His培养基：基本成分同上。

高压后加入0.8 mL 100×Ade，5 mL 40%葡萄糖和1 mL 100×Leu；100 mL SD/-Trp/-Leu培养基：基本成分同上。

高压后加入0.8 mL 100×Ade，5 mL 40%葡萄糖和0.2 mL 500×His；100 mL SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade培养基：基本成分同上。

质粒抽提原理和详细操作步骤

质粒抽提,实验室必备技能之一质粒质粒存在于许多细菌以及酵母菌等生物中，是细胞染色体外能够自主复制的很小的环状DNA 分子。

质粒抽提从细菌中分离质粒DNA的方法包括3个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细菌；分离和纯化质粒DNA。

采用强碱液、加热或溶菌酶（主要针对革兰氏阳性细菌）可以破坏菌体细胞壁，十二烷基磺酸钠（SDS）和 TritonX-100（一般很少使用）可使细胞膜裂解。

经溶菌酶和SDS或 Triton X-100处理后，细菌染色体DNA会缠绕附着在细胞碎片上，同时由于细菌染色体DNA比质粒大得多，易受机械力和核酸酶等的作用而被切断成不同大小的线性片段。

当用强热或酸、碱处理时，细菌的线性染色体DNA变性，而共价闭合环状DNA(Covalently closed circular DNA，简称cccDNA）的两条链不会相互分开。

当外界条件恢复正常时，线状染色体DNA片段难以复性，而是与变性的蛋白质和细胞碎片缠绕在一起，而质粒DNA双链又恢复原状，重新形成天然的超螺旋分子，并以溶解状态存在于液相中。

质粒抽提最常用的方法是碱裂解法，它具有得率高、适用面广、快速和纯度高等特点。

当然，碱裂解法也有缺陷：容易导致不可逆的变性。

要降低不可逆的变性，就要控制好碱裂解的时间。

碱裂解法抽提质粒需要用到以下三种溶液溶液Ⅰ50 mmol/L 葡萄糖，25 mmol/L Tris-Cl（pH 8.0），10 mmol/L EDTA（pH 8.0），在15 psi 压力下蒸汽灭菌15 min，4℃保存。

溶液Ⅱ0.2 mmol/L NaOH（从10 mmol/L 贮存液中现用现稀释），10 g/L SDS（室温保存）。

溶液Ⅲ5 mol/L乙酸钾 60.0 mL，冰乙酸 11.5 mL，无菌水28.5 mL，4℃保存，使用时置于冰浴中。

下面介绍一下碱裂解法小提质粒的具体操作：01柱平衡：向吸附柱中加入500 μl平衡Buffer，12000 rpm离心30-60 s，倒掉收集管中的废液；注意：吸附柱平衡后可最大限度激活硅基质膜，提高质粒的得率；吸附柱平衡后应立即使用，长时间放置会影响其吸附效果。

vazyme质粒提取原理

vazyme质粒提取原理
Vazyme质粒提取原理
质粒提取是分子生物学实验中常用的一项技术，用于从细菌或酵母等生物体中提取质粒DNA。

Vazyme质粒提取试剂盒是一种高效的质粒提取方法，采用纯化酶和离心柱的组合，能够快速、简便地提取高质量的质粒DNA。

Vazyme质粒提取试剂盒的原理基于离心柱纯化技术。

首先，将待提取的细菌培养物经离心分离得到菌落，然后用缓冲液洗涤去除细胞外DNA和细胞壁碎片等杂质。

接下来，加入裂解液将细菌细胞裂解，释放出质粒DNA。

裂解液中的蛋白酶A能够迅速降解细菌蛋白质，同时蛋白酶K能够去除DNA酶活性，保护质粒DNA的完整性。

在裂解液中加入乙酰酸钠，能够使DNA与蛋白质发生离解，从而使DNA在裂解液中保持可溶性。

此时，加入乙酸酰胺使DNA重新沉淀，然后用洗涤缓冲液洗涤沉淀，除去杂质。

接下来，使用洗涤缓冲液进行洗涤，去除残留的盐离子和污染物。

最后，用纯化缓冲液溶解DNA沉淀，得到高质量的质粒DNA。

Vazyme质粒提取试剂盒具有操作简单、纯化效果好、提取质粒DNA 纯度高等特点。

通过这种方法提取的质粒DNA可用于后续的克隆、测序、PCR等分子生物学实验。

与传统的提取方法相比，Vazyme质粒提取试剂盒能够更快速、更高效地提取质粒DNA，节省实验时间，
提高实验效率。

Vazyme质粒提取试剂盒是一种高效、简便的质粒提取方法，能够快速提取高质量的质粒DNA。

通过这种方法，科研人员可以更方便地进行后续的分子生物学实验，为科学研究提供有力支持。

提取质粒的原理

提取质粒的原理质粒是一种环状的DNA分子，存在于细菌、酵母等微生物细胞中，具有自主复制和传递的能力。

质粒在基因工程中扮演着重要的角色，可以被用来携带外源基因并在宿主细胞中表达。

因此，提取质粒是基因工程实验中必不可少的步骤之一。

本文将介绍提取质粒的原理及其相关技术。

提取质粒的原理提取质粒的原理基于细胞裂解和质粒分离的过程。

一般来说，提取质粒的步骤包括以下几个方面：1. 细胞裂解首先需要将含有质粒的细胞进行裂解，使质粒从细胞内部释放出来。

细胞裂解的方法有多种，包括机械破碎、超声波破碎、化学裂解等。

其中，化学裂解是最常用的方法之一，其原理是利用化学试剂破坏细胞壁和细胞膜，使细胞内部的物质释放出来。

常用的化学试剂包括SDS、EDTA、蛋白酶K等。

2. 分离质粒细胞裂解后，需要将质粒从其他细胞组分中分离出来。

质粒的分离方法有多种，包括离心、柱层析、电泳等。

其中，离心是最常用的方法之一，其原理是利用离心力将不同密度的物质分离开来。

在离心过程中，质粒会沉积到离心管底部形成沉淀，其他细胞组分则会在上层形成上清液。

此时，可以将上清液倒掉，留下质粒沉淀。

3. 纯化质粒分离出的质粒可能会受到其他杂质的污染，因此需要进行纯化。

质粒的纯化方法有多种，包括酚-氯仿法、硅胶柱层析法、离子交换柱层析法等。

其中，酚-氯仿法是最常用的方法之一，其原理是利用酚和氯仿的不同溶解度将DNA、RNA和蛋白质分离开来。

在酚-氯仿法中，质粒会在上层形成一个白色的粘稠物质，其他杂质则会在下层形成。

提取质粒的技术提取质粒的技术有多种，包括常规提取法、快速提取法、自动提取法等。

其中，常规提取法是最常用的方法之一，其步骤如下：1. 细胞裂解将含有质粒的细胞进行裂解，使质粒从细胞内部释放出来。

常用的化学试剂包括SDS、EDTA、蛋白酶K等。

2. 分离质粒将裂解后的细胞进行离心，分离出质粒沉淀。

3. 纯化质粒将分离出的质粒进行酚-氯仿法纯化。

4. 洗涤质粒将纯化后的质粒进行洗涤，去除残留的酚和氯仿。

酵母质粒的提取注意事项

酵母质粒的提取注意事项1. 实验前准备在进行酵母质粒提取实验之前，需要准备好所需材料和试剂。

常用的材料包括酵母培养物、细胞裂解液、酶切酶、离心管、离心机等。

试剂方面，需要注意购买高质量的试剂，并按照说明书的要求保存和使用。

2. 细胞培养与处理在进行酵母质粒提取实验之前，需要进行酵母菌的培养和处理。

首先，将酵母菌接种到含有所需培养基的琼脂糖平板上，培养一夜，然后挑取单个菌落转移到液体培养基中，继续培养至所需菌量。

此外，在进行酵母菌细胞处理时，需要注意细胞浓度的控制，避免浓度过高或过低对实验结果产生影响。

3. 细胞裂解与质粒提取酵母菌细胞裂解是酵母质粒提取的重要步骤。

一般情况下，细胞裂解可通过化学方法、机械方法或酶解方法实现。

其中，酶解方法常用于酵母菌质粒提取，具有操作简单、效果较好的特点。

在进行细胞裂解时，需要注意裂解液的选择和浓度，以及裂解时间和温度的控制，以确保细胞完全裂解，质粒DNA充分释放。

4. 质粒DNA纯化与保存在进行质粒提取后，需要对提取得到的质粒DNA进行纯化和保存。

纯化可以通过酚/氯仿法、硅胶柱纯化法或商用质粒纯化试剂盒等方法实现。

在选择纯化方法时，需要根据实验要求和样品特点进行选择，并根据说明书的要求进行操作。

纯化后的质粒DNA应及时保存，可以用TE缓冲液稀释保存在-20°C或-80°C的冰箱中，以避免质粒DNA的降解和损失。

5. 实验操作注意事项在进行酵母质粒提取实验时，还需要注意以下几点操作事项：- 实验室操作要严格遵守无菌操作的要求，以避免外源性DNA的污染。

- 实验过程中注意个人防护，佩戴手套、口罩和实验服，避免实验中的化学品对身体造成伤害。

- 实验前应仔细阅读所用试剂的说明书，了解其性质和使用方法，按照要求准确称取和调配试剂。

- 实验中的离心操作要注意离心管的放置位置和离心速度的选择，以避免样品的溢出和离心管的破裂。

- 实验后要及时清洗实验台面和相关器材，保持实验环境的整洁和无菌。

抽取质粒的基本原理

抽取质粒的基本原理
抽取质粒的基本原理是利用纯化和分离的方法从细胞中提取质粒DNA。

质粒是细菌或酵母等微生物细胞内自主复制的环状DNA分子。

抽取质粒的基本步骤如下：
1. 培养细胞：首先，需要培养含有目标质粒的细菌或酵母菌株。

这可以通过选择性培养基以及加入适当浓度的抗生素来实现，使只有含有目标质粒的细胞能够生长和存活。

2. 收获细胞：将培养好的细胞离心，以去除培养基和细胞代谢产物。

3. 细胞裂解：将细胞用适当的裂解剂（如SDS、尿素等）处理，以破坏细胞壁和细胞膜，使细胞内容物释放出来。

此时，目标质粒DNA也被释放出来。

4. 质粒分离：通过高速离心，将裂解后的细胞内容物离心分离，将含有目标质粒DNA的上清液分离。

5. DNA纯化：将分离得到的上清液经过一系列的纯化步骤，如酚/氯仿提取、等渗乙醇沉淀等，将目标质粒DNA纯化。

6. 检测和测定：最后，对纯化得到的质粒DNA进行质量和浓度的检测和测定，
以便后续实验的使用。

需要注意的是，抽取质粒的详细步骤可能因实验目的和使用的技术方法而有所不同，但上述基本原理是大致相同的。

6分钟提取质粒

6分钟提取质粒
"6分钟提取质粒" 通常指的是在分子生物学实验中，从细菌中提取质粒的过程，该过程可以在相对较短的时间内完成。

提取质粒是为了获取质粒中的目标基因、DNA片段或其他重要的遗传物质。

以下是一般的质粒提取步骤，这个过程可以在大约6分钟内完成：
1. 培养菌株：
- 开始前，先在培养基中培养含有目标质粒的大肠杆菌（E. coli）菌株。

2. 离心：
- 将培养好的菌液进行离心，将菌体沉淀。

3. 去除培养基：
- 弃去上清液，保留含有大肠杆菌的菌体沉淀。

4. 溶解：
- 使用缓冲液溶解菌体，使DNA释放。

5. 加入溶解剂：
- 加入一些溶解剂，如碱性SDS（十二烷基硫酸钠），破坏膜脂，释放DNA。

6. 快速离心：
- 进行瞬时离心，将膜脂等杂质快速沉淀。

7. 取上清：
- 取上清液中含有的质粒DNA。

8. 沉淀：
- 加入醋酸等溶液，使DNA沉淀。

9. 洗涤：
- 对DNA沉淀进行洗涤，去除残余的盐和其他污染物。

10. 溶解：
- 最后，用适当的缓冲液溶解沉淀的质粒DNA。

这样的质粒提取方法通常使用快速、高效的离心和溶解步骤，使得整个过程可以在相对较短的时间内完成。

实际提取时间可能因具体实验方案和使用的提取试剂盒而有所不同。

酵母高纯度质粒大量快速提取试剂盒(离心柱型)操作方法及步骤说明书

酵母高纯度质粒大量快速提取试剂盒（离心柱型）目录号：PL19目录编号包装单位PL1901 10次适用范围：适用于大规模高纯度酵母质粒制备试剂盒组成、储存、稳定性：试剂盒组成保存10次（PL1901）RNaseA（10mg/ml）－20℃750µl破壁酶4℃1g（常温运输）溶液YP1 4℃75 ml溶液YP2 室温75 ml溶液YP3 室温110 ml去蛋白液PD 室温100 ml漂洗液WB 室温25 ml x 2第一次使用前按说明加指定量乙醇洗脱缓冲液EB 室温20 ml吸附柱DC 室温10个收集管（50ml）室温10个本试剂盒在室温储存12个月不影响使用效果。

储存事项:1.第一次使用时，将试剂盒所带的全部RNase A加入溶液YP1（终浓度100µg/ml）置于4℃保存。

如果溶液YP1中RNase A失活，提取的质粒可能会有微量RNA残留，在溶液YP1中补加RNase A即可。

2.环境温度低时溶液YP2中SDS可能会析出浑浊或者沉淀，可在37℃水浴加热几分钟，即可恢复澄清，不要剧烈摇晃，以免形成过量的泡沫。

3.避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、pH值变化，各溶液使用后应及时盖紧盖子。

产品介绍：本试剂盒采用改进SDS-碱裂解法裂解细胞并结合破壁酶特异消化酵母细胞壁，能在1小时内从酵母培养液中分离出高纯度质粒DNA。

酵母收集后,加入破壁酶去除细胞壁后,然后碱裂法裂解细胞，离心吸附柱内的硅基质膜在高盐、低PH值状态下选择性地结合溶液中的质粒DNA，再通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除，最后低盐、高PH值的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅基质膜上洗脱。

产品特点：1.离心吸附柱内硅基质膜全部采用进口世界著名公司特制吸附膜，柱与柱之间吸附量差异极小，可重复性好。

克服了国产试剂盒膜质量不稳定的弊端。

2.快速、方便，不需要使用有毒的苯酚、氯仿等试剂，也不需要乙醇沉淀。

获得的质粒产量高、纯度好，可以直接用于酶切、转化、PCR、体外转录、测序等各种分子生物学实验。

酵母双杂交实验

酵母双杂交相关实验方法1、酵母总DNA的提取方法（蜗牛酶法）1、酵母质粒提取试剂Buffer I 0.9 mol/L Sorbitol0.1mol/L EDTABuffer II 50mM/L Tris20mM/L EDTABuffer III 10mM/L Tris1Mm/L EDTA2、操作步骤：(1) 收集新鲜菌体重加入150μl buffer I，25μl 蜗牛酶（30mg/ml）。

.(2) 37℃水浴1h。

(3) 10000rpm离心10min，去上清，沉淀中加入250μl buffer II。

(4) 加入25μl 10% SDS，65℃水浴30min，每间隔5min中震荡一次。

(5) 加入25μl 5mol/L 醋酸钾，冰浴60min。

(6) 4℃12000rpm离心15min，取上清。

(7) 在上清中加入2-3倍体积的无水乙醇，混匀静置于-20℃，1小时以上。

(8) 取出，4℃12000rpm离心15min ，弃上清。

(9) 加入150μl buffer III 溶解沉淀，用等体积苯酚/氯仿/异戊醇抽提。

(10) 12000rpm离心15min。

(11) 将上清转入新的离心管中，加入6μl(10U/μl)RNA酶 37℃放置30min。

(12) 取上清，加入等体积的异丙醇。

(13) 4℃静置10min，1小时以上或过夜。

(14) 4℃10000rpm 离心5min。

(15) 弃上清，并把沉淀溶于10μl buffer III 中。

2、小规模酵母转化1、酵母转化试剂：转化用试剂除PEG采用过滤灭菌外，其它试剂均需高温高压灭菌，条件同普通培养基灭菌。

(1) M 醋酸锂（Lithium Acetate）(2) 聚乙二醇（Polyethylene glycol，PEG）分子量3350，浓度 50%（w/v）(3) PEG/LiAc 溶液的配制（现用现配）800μl 50%PEG100μl 10×TE100μl 10×LiAc1ml 总体积(4) 1.1×TE/LiAc溶液（现用现配） 11ml 10×TE(5) 11ml 10×LiAc(6) 78ml ddH202、操作步骤：(1) 第一天下午3点将酵母接种于5ml YPDA中，30℃摇菌。

(完整版)酵母质粒提取

酵母质粒抽提方法点击次数：247作者：ydniu发表于：2008-06-18 11:44 转载请注明来自丁香园来源：丁香园问：想从酵母提取质粒，转化大肠杆菌，按分子克隆的方法，可能都线性化了，转化率为0,请问有什么好的办法？答：以下是我的方法，曾提过数百个，好像转化效率还可以，基本上都提岀来了。

个人体会是Lyticase的活性要好，而且涡流混匀这一步好像要尽量充分吧，u see，酵母质粒所以不好提，就是因为酵母细胞有很厚的细胞壁，再加上酵母质粒拷贝数目多少的问题，所以破壁一定要充分。

其次吗？感受态细胞的状态也会有很大的影响……再有，如果担心酵母细胞的活性问题，也可以活化一下再提，不过好象我的实验中这项不是问题…….哈哈….详细步骤：1、挑10mm2的酵母溶于含50 gl的TE ( pH7.0)的1.5ml离心管中2、每管加10 g 1的裂解液(Lyticase 5 unit/ g Sjgma避光保存)，涡流混匀3、37 °C，200-250r/m，30-60min4、每管加10 g l 20 % SDS，涡流1min5、E0C冻存过夜6、室温下融解后，涡流混匀质粒提取。

1.5ml 离心管加 TE Buf 至 200 gl 的（pH7.0 ） 200g l 酚，涡流 5min 后，4°C, 14000r/m 离心 10min 。

取上清至干净的 1.5ml Eppendorf 管中。

等体积酚氯仿，涡流 5min 。

4C ， 14000r/m 离心 10min 。

取上清至一干净的 1.5ml Eppendorf 管后加等体积氯仿，涡流混匀4C ， 14000r/m 离心 10min 。

取上清至一干净的 1.5ml Eppendorf 管中。

8g l 10M NH4Ac 和 500g l 95%〜100 %的乙醇。

-70 C, 1h 。

4C ， 14000r/m 离心 10min 。

一种快速高效提取酵母质粒的方法

产率、纯度和对后续实验的影响等方面进行了比较。结果表明，与另外两种方法比较．玻璃珠液
氮法提取酵母质粒具有效率高、质量好、成本低、时间短、操作简单的优点。可作为实验室规模化
提取酵母质粒的常用方法
ＺＨＡＮＧＹｉ，ＬＩＵＫｕｎ，ＣＡ０Ｐｅｎｇ，ＷＥＩＳｅｎ，ＷＥｌＤａｎ－ｄａｎ，ＤＵＪｉａｎ，ＬＩＰｅｎｇ－ｋｕｎ，ＬＩＣｈｅｎｇ－ｗｅｉ｜
（ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＰｌａｎｔＧｅｎｅｔｉｃｓａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｒｅｅｄｉｎｇ，ＺｈｏｕｋｏｕＮｏｒｍａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｚｈｏｕｋｏｕ４６６００１，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｐｌａｓｍｉｄｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｉｓａｎｉｍｐｏｒｔａｎｔｂｕｔｄｉｆｆｉｃｕｌｔｓｔｅｐｏｆｔｈｅｇｅｎｅｔｉｃｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇｏｐｅｒａｔｉｏｎｓ，ｂｅｃａｕｓｅｏｆｔｈｅｙｅａｓｔｓｃｅｌｌｓｗｉｔｈｔｏｕｇｈａｎｄｕｎｂｒｅａｋａｂｌｅｃｅｌｌｗａｌ１．Ｆｏｒｇｅｔｔｉｎｇｏｎｅｆａｓｔ，ｓｉｍｐｌｅ，ｅｉｃｆｉｅｎｔａｎｄｓｔａｂｌｅｍｅｔｈｏｄｏｆｐｌａｓｍｉｄｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｆｒｏｍｙｅａｓｔｓ，ｗｅｅｍｐｌｏｙｅｄｔｈｅｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓｏｆａｇａｒｏｓｅｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒａｎｄＰＣＲａｍｐｌｉｉｃｆａｔｉｏｎ，ａｎｄｃｏｍｐａｒｅｄｔｈｅｙｉｅｌｄ，ｐｕｒｉｔｙｏｆｐｌａｓｍｉｄｓｗｈｉｃｈｗｅｒｅｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍｙｅａｓｔｓｗｉｔｈｔｈｅｍｅｔｈｏｄｓｏｆｇｌａｓｓｂｅａｄｓ－ｌｉｑｕｉｄｎｉｔｒｏｇｅｎ，ｓｎａｉｌａｓｅａｎｄｋｉｔ．Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｍｅｔｈｏｄｏｆｇｌａｓｓｂｅａｄｓ－ｌｉｑｕｉｄｎｉｔｒｏｇｅｎｈａｄｔｈｅａｄｖａｎｔａｇｅｓｏｆｈｉｇｈｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ，ｇｏｏｄｑｕａｌｉｔｙ，ｌｏｗｃｏｓｔ，ｓｉｍｐｌｅｏｐｅｒａｔｉｏｎｉｎｃｏｎｔｒａｓｔｔｏｔｈｅｏｔｈｅｒｔｗｏ

酵母质粒提取试剂盒操作步骤及注意事项

酵母质粒提取试剂盒操作步骤及注意事项货号：D1160规格：50T/100T保存：室温（15℃-25℃）干燥保存，复检期为12个月。

2℃-8℃保存时间更长。

试剂盒组成D1160-50T D1160-100TRNase A300ul500ul酵母破壁酶 1.25ml 1.25ml×2山梨醇Buffer25ml50mlβ-巯基乙醇300ul600ul溶液YP115ml30ml溶液YP215ml30ml溶液YP320ml40ml漂洗液15ml15ml×2洗脱液15ml30ml吸附柱50个100个收集管50个100个说明书1份1份注意：使用前请先在漂洗液中加入无水乙醇，加入体积请参照瓶体上的标签。

YP1在使用前先加入RNaseA（将试剂盒中提供的RNaseA全部加入），混匀，置于2-8℃保存。

如非指明，所有离心步骤均为使用台式离心机在室温下离心。

产品简介：酵母质粒提取试剂盒采用酶法破碎酵母细胞壁和碱裂解法裂解酵母细胞来提取酵母质粒DNA。

所采用的酵母破壁酶能有效地破坏酵母细胞壁，提高酵母质粒DNA的产量。

吸附柱中采用的硅基质材料能高效、专一地吸附DNA，可最大限度去除杂质蛋白质及细胞中其他有机化合物。

使用酵母质粒提取试剂盒提取的酵母质粒DNA可适用于各种常规的分子生物学实验，包括酶切、PCR、测序、连接和转化等试验。

本试剂盒无需使用酚、氯仿等有毒试剂，操作安全。

操作步骤：1、取1-5ml酵母培养物（不超过5×107cells），12000rpm离心1min，尽量吸除上清（菌液较多时可以通过多次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中）。

2、酵母细胞壁的破除：A、酶法：向酵母菌体中加入470ul山梨醇Buffer，充分悬浮菌体，加入25ul酵母破壁酶和5ulβ-巯基乙醇，充分混匀，30℃处理1-2h，期间可颠倒离心管混匀数次。

12000rpm 离心1min，弃上清，收集沉淀。

向沉淀中加入250ulYP1（请先检查是否已加入RNaseA），充分悬浮沉淀。

一种简便的适用于酵母双杂交系统的酵母质粒提取方法

［ｂｔａｔＯｂｅｔｅｏｅｔｂｉａｔｔｌｎｃｎｍｃｌｉｌｔｎｍｅｏｆＤａｍｄｆｍｙａｔｆＴｔｅＡｓｃ］ｊｃｖ：Ｔｓｌｈａｆｓａｅａｄｅｏｏｉａｓａｏｔｄｏｌｓｉｒｅｓｎｈｒｉａｓ，ｓｂｏｉｈｏ
ｓｏｄｔａｈｕｌｙｏｈｘｒｃｅｐａｍｉｎｔｅｒｄｅｓｐａｍｉＤＮＡｗａｎｕｈｆｒＰＲｆｃｎｉｈｗｅｈｔｔｅｑａｉｆｔｅｅｔｔｄｌｓｄｉｈｃｕｅｙａｔｌｓｄｔａｓｅｏｇ用于酵母双杂交系统的酵母质粒提取方法
苑丽娜 ¨ 王定和，永杰。郭佳，，王，单卫星Ｉ２ｂ，
１．西北农林科技大学ａ．生命科学学院；ｂ．植物保护学院；西杨凌７２０；陕１１０２．陕西省农业分子生物学重点实验室，西杨凌７２０；３陕１１０．河南省郸城县第一高级中学，南郸城４７５河７１０
［中图分类号］Ｑ８７
［文献标识码］Ａ
［文章编号］１０ — ０２２１）６０６ — ３０９００（１ — ８４０００
ＡＳｍｐｅｉｌＭｅｈｄｏＩｏａｉｎｆｔｏｆｒｓｌｔｏｏＹｅｓＰａｍｉＵｓｄｏｒａｔｌｓｄｅｆＹｅｓａｔＴｗｏＨｙｒｄＳｓｅ－ｂｉｙｔｍ
ｙａｔｔｏｈｂｄｌｓｅｄ－ａｅｉｌｔｏｏｓｌｔｎｏｌｓｄＤＮＡｆｍｅｓａｃａｏｃｓｃｒ — ｅｓｗ — ｙｒ．ａｇａｓｂａｓｂｓｄｓｍｐｅｍｅｈｄｆｒｉｏａｉｆｐａｍｉｉｏｒｏｙａｔＳｃｈｒｍｙｅｅｅｖｓａｓｄｖｌｐｄｉｅｗａｅｅｏｅ．Ｍｅｈｄ：Ｙｅｓｃｌｒｘｄｗｔｌｓｅｄｎｈａｇｔｐａｍｉｓｒｌａｅｙｖｒｉｔｏｓａｔｅｌｗｅｅｍｉｅｉｇａｓｂａｓａｄｔｅｔｒｅｌｓｄｅｅｓｄｂｏ — ｓｈｔｘｎ，ｐｅｅｐｔｔｄａｄｒｎｆｒｄｉｔｃｌＤＨＩＢｂｌｃｒｐｒｔｎＲｅｕｔ：ＡｇｒｓｇｌｅｅｔｏｈｒｓｅｉｇｒｃｉｉｅｎｔｓｏｍｅｎｏＥ．ｏｉａａＯｙｅｅｔｏａｉ．ｏｏｓｌｓａｏｅｅｌｃｒｐｏｅｉｓ

质粒提取操作技巧

质粒提取实验材料：1.5ml EP管，枪头，高速离心机，恒温摇床，15/50 ml无菌离心管，水浴锅试剂：ddH2O，质粒小提试剂盒（天根），LB培养基，氨苄霉素，卡那霉素，感受态细菌，琼脂糖培养板实验步骤：1.LB固体培养基及琼脂糖培养板的制备：a)用双蒸水配制100mg/ml氨苄霉素、50mg/ml卡那霉素溶液，0.22μm滤器过滤，1.5ml EP管分装于-20保存；b)配制并高压灭菌LB固体培养基(自然冷却后4℃保存)：1L培养基含Tryptone(胰蛋白胨) 10g、Yeast Extract(酵母提取物) 5g、Nacl10g、再加入15g Agrose，定容到1L (玻璃瓶，此时不加Amp/Kana等抗生素)c)高压灭菌，待培养基自然冷却至50-60℃（温度高于75℃会导致Amp/Kana失效，但也不能太低，否则会使培养基提前凝固），取干净50ml离心管或高压灭菌过的小玻璃瓶，在无菌工作台中倒入冷却的LB培养基，并在按比例（配抗生素时的比例）加入氨苄/卡那霉素，摇匀。

小心倾倒至无菌10cm细菌培养皿中（不宜过多，一般8ml左右轻轻晃动能铺满整个皿底），待培养基自然冷却凝固。

培养板按照抗生素分类标记，继续在超净台（开风机）中倒置放置0.5~1h小时左右，使水分蒸发。

最后封口膜封口，装袋于4℃冰箱保存（注：一般平板应该按照实验需要多倒2~3个培养板，可能有培养板倒过程中产生气泡而不能正常使用）；2.质粒转化：a)在冰上缓慢融解感受态细菌，取30-50μl加入1ul浓度至少200~500ng/ul的质粒。

如果转化连接产物，每50微升感受态细菌加入2-10微升连接产物；（此步骤应严格在冰上操作）b)轻轻用手指弹动离心管，以混匀细菌和质粒或连接产物。

冰浴或冰水浴放置30分钟；c)42ºC水浴，热休克90sec；d)热休克后立即置于冰浴中，5分钟；e)加入500微升LB，37ºC 200rpm培养30-60min，并按比例加入相应的抗生素；f)在此期间准备清洗过的玻璃棒，喷酒精在超菌台紫外照射30min备用；g)将摇床上带培养基的EP管取出，室温2000rbp离心3min，此时应看到底部有白色沉淀；h)用枪吸去上清，剩下50-100ul，用枪将EP管底部的沉淀吹打混匀，在酒精灯旁，涂到含有相应抗生素的LB平板上，玻璃棒涂匀，37ºC恒温箱培养过夜不超过16h。

酵母双杂基础知识总结

酵母双杂基础知识总结酵母双杂原理：酵母双杂交系统由Fields和Song等首先在研究真核基因转录调控中建立。

典型的真核生长转录因子，如GAL4、GCN4、等都含有二个不同的结构域: DNA结合结构域(DNA-binding domain)和转录激活结构域(transcription-activating domain)。

前者可识别DNA上的特异序列，并使转录激活结构域定位于所调节的基因的上游，转录激活结构域可同转录复合体的其他成分作用，启动它所调节的基因的转录。

二个结构域不但可在其连接区适当部位打开，仍具有各自的功能。

而且不同两结构域可重建发挥转录激活作用。

酵母双杂交系统利用杂交基因通过激活报道基因的表达探测蛋白－蛋白的相互作用。

主要有二类载体: a 含DNA -binding domain的载体; b 含DNA-activating domain的载体。

上述二类载体在构建融合基因时，测试蛋白基因与结构域基因必须在阅读框内融合。

融合基因在报告株中表达，其表达产物只有定位于核内才能驱动报告基因的转录。

例如GAL4-bd具有核定位序列(nuclear-localization sequence)，而GAL4-ad没有。

因此，在GAL4-ad氨基端或羧基端应克隆来自SV40的T-抗原的一段序列作为核定位的序列。

目前研究中常用binding-domain基因有：GAL4(1-147); LexA (E coli转录抑制因子)的DNA-bd编码序列。

常用的activating-domain基因有：GAL4(768-881)和疱疹病毒VP16的编码序列等。

双杂交系统的另一个重要的元件是报道株。

报道株指经改造的、含报道基因(reporter gene)的重组质粒的宿主细胞。

最常用的是酵母细胞，酵母细胞作为报道株的酵母双杂交系统具有许多优点: 〈1〉易于转化、便于回收扩增质粒。

〈2〉具有可直接进行选择的标记基因和特征性报道基因。

质粒提取方法及原理

质粒提取方法及原理质粒是染色体外能够进行自主复制的遗传单位，当前通常用其来特指细菌、真菌、酵母菌和放线菌等生物中染色体以外的 DNA分子。

在基因工程领域，质粒常常被当做基因的载体使用。

在分子生物学中，质粒 DNA被当做基因运载工具具有非常广泛的应用。

在质粒DNA的应用过程中，其纯度对于酶切、PCR扩增等实验结果有着比较大的影响，因此需要保证质粒DNA提取的纯度和效率。

在细菌中提取质粒DNA通常按照以下步骤进行:第一步，培养细菌，使质粒扩增;第二步，进行细菌的收集和裂解;第三步，质粒 DNA的分离和纯化。

在质粒DNA的提取过程中，其提取效果和其大小呈现出正比例关系，越小越容易进行提取，这主要是由于，如果质粒DNA比较大的话，其特性机会和染色体DNA比较接近，这样想要将二者分离开来难度就会变大。

在进行质粒DNA的分离时，适宜的条件是非常重要的，主要包括pH值、SDS浓度、时间和溶菌温度等，在适宜的条件下质粒DNA和染色体DNA 才能够更好的分离开来。

细菌浓度对于质粒 DNA的提取也是非常重要的，如果细菌的浓度比较高，那么在溶菌时，溶菌液很难和细菌液充分混合，导致溶菌不彻底的问题，这样会造成质粒的回收率比较低；而如果细菌溶度比较低，溶菌液和菌液均分混合，会造成溶液中含有较多的蛋白质、染色体以及菌体碎片，在这样的情况下，沉淀时质粒回合这些物质共沉，进而导致质粒的回收率也会比较低。

在生物学的相关研究之中，细菌质粒DNA的提取是比较常规的技术和操作，主要的方法有碱裂解法、煮沸法以及SDS裂解法等，下面对碱裂解法进行介绍。

碱裂解法碱裂解法是当前应用比较广泛的质粒 DNA提取方法，这种方法的优点在于提取的质粒DNA纯度高，操作便捷，缺点是需要较长的提纯时间。

研究人员在缩短这一方法的提纯时间方面做了大量的研究，但是没有得到理想的效果，当前这一方法提取 DNA 的时间都在1.5h 以上。

碱裂解法提取质粒DNA的基本原理:首选，在菌液中加入溶液Ⅰ，细菌细胞悬浮，同时其中的EDTA会和Ca2+以及Mg2+鳌合，起到抑制DNase活性的作用；然后，加入溶液Ⅱ，将细胞裂解，在这个过程中蛋白质和少量质粒将会变质；再次，加入溶液Ⅲ，使多数蛋白质以及染色体DNA被沉淀，并使得质粒DNA复性。

酵母菌表面展示操作步骤之酵母转化与筛选

酵母菌表面展示操作步骤之酵母转化与筛选酵母菌表面展示技术是一种利用酵母菌作为生物载体，展示外源蛋白质或肽段的方法。

这种技术在生物医学研究、药物发现和工业生物催化等领域具有广泛的应用潜力。

其中，酵母转化与筛选是该技术的关键步骤之一。

本文将介绍酵母转化与筛选的详细操作步骤。

酵母转化是将外源的DNA导入到酵母细胞内的过程。

在酵母表面展示系统中，酵母细胞的表面会显示被选择的外源蛋白质或肽段。

以下是酵母转化与筛选的详细步骤：1. 提取酵母菌：从酵母培养物中提取酵母细胞，可使用离心、滤纸按压等方法。

2. 酵母细胞处理：洗涤酵母细胞以去除不需要的培养基和杂质。

3. 转化质粒DNA的制备：提取和纯化质粒DNA，这些质粒DNA会被导入酵母细胞中。

4. 酵母转化：将转化质粒DNA与酵母细胞一起处理，使质粒DNA转化进入酵母细胞。

5. 细胞恢复：将转化后的酵母细胞在适当的培养基上进行恢复，使其正常生长。

6. 选择性培养基筛选：为了筛选具有转化质粒的酵母细胞，使用含有适当抗生素的选择性培养基进行培养。

7. 验证转化：通过PCR、南方杂交等分子生物学方法，验证酵母细胞是否成功转化。

8. 单克隆的选择：从转化成功的酵母细胞中挑选出单个克隆并进行培养。

9. 酵母细胞培养：将筛选并验证过的酵母单克隆进行大规模培养，以获得足够的蛋白质或肽段。

10. 表面展示鉴定：使用适当的方法，如流式细胞术或免疫印迹，鉴定酵母细胞表面是否成功展示目标蛋白质或肽段。

11. 功能验证：对表面展示成功的酵母细胞进行功能验证，例如与配体的结合能力或酶活性等。

在酵母转化与筛选过程中，需要特别注意以下事项：1. 操作无菌：确保实验室操作环境和培养器具的无菌。

2. 培养基配制：准确配制培养基，包括选择性培养基和适宜的温度、pH值等。

3. 转化质粒DNA的质量和纯度：确保转化质粒DNA的质量和纯度，以提高酵母转化效率和筛选准确性。

4. 酵母细胞的培养和处理：定期检查和保存酵母细胞，适时进行酵母细胞培养和处理。

质粒)∶一个在酵母中发现的质粒

1、2 µm plasmid （2 µm 质粒）：一个在酵母中发现的质粒，被用作一系列克隆载体的基础。

3、auxotroph（营养缺陷型）：指的是一种突变了的微生物，必须对它提供一些对野生型而言并不必需的营养成分才能生长。

4、bioinformatics（生物信息学）：通过计算机的使用进行研究基因组、后基因组的方法。

5、cell-free translation system（无细胞翻译系统）：包含蛋白质合成所需所有成分的细胞抽提物，能够使加入的mRNA分子被翻译。

6、chromosome walking（染色体步查）：通过检测被克隆的DNA的重叠片段而构建一个克隆图谱的技术。

10、cosmid（黏端质粒，黏粒）：通过把λ噬菌体的cos位点插入质粒构成的克隆载体，用来克隆长度超过40kb的DNA片段。

11、disarmed plasmid（解除武装的质粒）：一个去掉部分或所有的T-DNA基因的Ti质粒，不在具有使植物细胞癌变的能力。

12、DNA chip（DNA芯片）：一块硅质薄片，携带高密度的寡核苷酸矩阵，用于转录组或其他研究中。

13、fluorescence in situ hybridization（FISH）(荧光原位杂交)：一种杂交技术，用不同颜色的荧光染料标出两个或更多个基因在由单个原位试验制备的染色体上的位置。

14、footprinting（足迹法）：使用DNase I 降解DNA，通过检测被保护的磷酸二酯键，来鉴定蛋白质结合在DNA上的位点。

15、gel retardation（凝胶阻滞）：根据结合了蛋白质的DNA在凝胶电泳中行进较慢的特点，来检出它们的技术。

17、genomic library（基因组文库）：大量的克隆的集合，包含了某个生物体的所有基因。

18、heterologous probing（异种探针技术）：通过使用标记了的核酸分子探针检测相关分子的方法。