酵母质粒的提取 - 360文档中心

酵母菌表面展示操作步骤之质粒构建和转化

酵母菌表面展示操作步骤之质粒构建和转化质粒构建和转化是进行酵母菌表面展示的重要步骤之一。

在这一过程中，我们需要合成包含目标基因序列的质粒，并将其转化到酵母菌细胞中。

下面是酵母菌表面展示操作步骤之质粒构建和转化的详细描述。

1. 质粒构建质粒是一种带有自主复制序列的DNA分子。

在酵母菌表面展示中，我们需要构建一种质粒，其中包含用于表达和展示目标蛋白的基因序列。

a. 选择适合的质粒载体：选择合适的质粒载体，例如pYD1或pPICZα，这些载体在酵母菌表面展示中被广泛使用。

b. 插入目标基因：根据目标基因的序列设计引物，通过PCR扩增目标基因，并在引物的末端添加限制酶切序列，以便后续的质粒构建。

c. 酶切和连接：将PCR扩增产物与质粒载体进行酶切，并使用连接酶将两者连接起来。

此步骤需要选择合适的限制酶，并优化酶切和连接的条件。

d. 转化大肠杆菌：将连接好的质粒转化到大肠杆菌中，并通过培养和筛选获得含有目标质粒的克隆。

2. 酵母菌质粒转化在完成质粒构建之后，我们需要将质粒转化到酵母菌细胞中。

转化是指将质粒导入到细胞内，并使其在细胞内复制和表达。

a. 制备质粒：从大肠杆菌培养物中提取包含目标质粒的质粒DNA。

使用质粒提取试剂盒按照厂家说明书进行质粒提取。

b. 酵母菌预处理：用含有酵母菌培养基预处理酵母菌细胞。

这一步骤可以增加酵母菌细胞对质粒的转化效率。

c. 质粒转化：将预处理后的酵母菌细胞与质粒DNA一起孵育。

孵育温度和时间依据具体的实验要求进行设置。

质粒转化的方法包括热激冷冻法、锂乙酸法等，选择合适的方法进行转化。

d. 筛选阳性克隆：将经过转化的酵母菌细胞转移到含有适当选择压力的培养基中，并在培养基上筛选出带有目标质粒的阳性克隆。

这些步骤是进行酵母菌表面展示的质粒构建和转化的基本操作流程。

在每个步骤中，实验者需要采取严谨的操作、选择合适的试剂和工具，并根据实验要求进行优化。

通过这一步骤，可以成功构建和导入目标质粒，为后续的酵母菌表面展示实验奠定基础。

质粒三种提取方法的比较(精)

（三）小量一步提取法
1.取0.5ml细菌过夜培养物，置1.5ml的Eppendolf管中 2.加入0.5ml的氯仿：异戊醇，用振荡器最大速度振荡1min，充分混匀。 3.12000g，离心5min，取上清移至另一个Eppendolf管中，加入500µl异丙醇混匀，立即12000g，离心5min。 4.弃上清，加入500µl70%乙醇漂洗沉淀，短暂离心。 5.弃上清，室温干燥沉淀2min，然后加入20μl无菌水溶解 DNA。
材料、设备及试剂
一ห้องสมุดไป่ตู้材料
含卡那酶素的E. coli DH5α，1.5ml塑料离心管(又称 eppendorf管), 离心管架。
二、设备
微量取液器(20μl,200μl,1000μl)，台式高速离心机，恒温振荡摇床，高压蒸汽消毒器(灭菌锅)，涡旋振荡器，电泳仪，琼脂糖平板电泳装置和恒温水浴锅等。
[注意]
1. 提取过程应尽量保持低温。 2. 提取质粒DNA过程中除去蛋白很重要,采用酚/ 氯仿去除蛋白效果较单独用酚或氯仿好,要将蛋白尽量除干净需多次抽提。 3. 沉淀DNA通常使用冰乙醇,在低温条件下放置时间稍长可使DNA沉淀完全。沉淀DNA 可用异丙醇(一般使用等体积), 无水乙醇（2-2.5倍体积），区别？。
DNA双链
变性强碱中性复性 DNA单链
闭合环状的质粒DNA，在变性后不会分离，复性快；
染色体线性DNA和或有缺口的质粒 DNA变性后双链分离，难以复性而形成缠绕的结构，与蛋白质—SDS复合物结合在一起，在离心的时候沉淀下去。
变性
煮沸法：
将细菌悬浮于含Triton X-100和能消化细胞壁的溶菌酶缓冲液中，然后加热到100℃使其裂解。加热除了破坏细胞壁外，还有助于解开 DNA链的碱基配对，并使蛋白质和染色体 DNA变性。但是，闭环质粒DNA彼此不会分离，这是因为他们的磷酸二酯骨架具有互相缠绕的拓扑结构，当温度下降后，闭环DNA 的碱基又各自就位，形成超螺旋分子，离心除去变性的染色体核蛋白质，就可从上清中回收质粒DNA

提取质粒的原理

提取质粒的原理质粒是一种环状的DNA分子，存在于细菌、酵母等微生物细胞中，具有自主复制和传递的能力。

质粒在基因工程中扮演着重要的角色，可以被用来携带外源基因并在宿主细胞中表达。

因此，提取质粒是基因工程实验中必不可少的步骤之一。

本文将介绍提取质粒的原理及其相关技术。

提取质粒的原理提取质粒的原理基于细胞裂解和质粒分离的过程。

一般来说，提取质粒的步骤包括以下几个方面：1. 细胞裂解首先需要将含有质粒的细胞进行裂解，使质粒从细胞内部释放出来。

细胞裂解的方法有多种，包括机械破碎、超声波破碎、化学裂解等。

其中，化学裂解是最常用的方法之一，其原理是利用化学试剂破坏细胞壁和细胞膜，使细胞内部的物质释放出来。

常用的化学试剂包括SDS、EDTA、蛋白酶K等。

2. 分离质粒细胞裂解后，需要将质粒从其他细胞组分中分离出来。

质粒的分离方法有多种，包括离心、柱层析、电泳等。

其中，离心是最常用的方法之一，其原理是利用离心力将不同密度的物质分离开来。

在离心过程中，质粒会沉积到离心管底部形成沉淀，其他细胞组分则会在上层形成上清液。

此时，可以将上清液倒掉，留下质粒沉淀。

3. 纯化质粒分离出的质粒可能会受到其他杂质的污染，因此需要进行纯化。

质粒的纯化方法有多种，包括酚-氯仿法、硅胶柱层析法、离子交换柱层析法等。

其中，酚-氯仿法是最常用的方法之一，其原理是利用酚和氯仿的不同溶解度将DNA、RNA和蛋白质分离开来。

在酚-氯仿法中，质粒会在上层形成一个白色的粘稠物质，其他杂质则会在下层形成。

提取质粒的技术提取质粒的技术有多种，包括常规提取法、快速提取法、自动提取法等。

其中，常规提取法是最常用的方法之一，其步骤如下：1. 细胞裂解将含有质粒的细胞进行裂解，使质粒从细胞内部释放出来。

常用的化学试剂包括SDS、EDTA、蛋白酶K等。

2. 分离质粒将裂解后的细胞进行离心，分离出质粒沉淀。

3. 纯化质粒将分离出的质粒进行酚-氯仿法纯化。

4. 洗涤质粒将纯化后的质粒进行洗涤，去除残留的酚和氯仿。

提取质粒原理

提取质粒原理质粒是一种存在于细菌和酵母等微生物细胞内的可自主复制的DNA分子，是重要的基因工程载体。

提取质粒是基因工程中常见的操作步骤，其原理主要包括细菌培养、DNA提取、酶切、连接等多个环节。

首先，进行细菌培养。

在进行质粒提取前，首先需要进行细菌培养，将含有目标质粒的细菌菌落接种到含有适当抗生素的培养基中，进行培养。

培养的条件包括温度、pH值、氧气含量等，需要根据具体的细菌菌株来确定最适合的培养条件。

其次，进行DNA提取。

DNA提取是提取质粒的关键步骤，可以利用化学方法或商用DNA提取试剂盒进行提取。

在提取过程中，需要注意保护DNA不受到外界的污染和降解，以保证提取的DNA质量。

接着，进行酶切。

酶切是利用限制性内切酶对目标DNA进行特异性切割，得到所需的DNA片段。

在酶切过程中，需要根据酶切位点设计合适的引物，控制酶切反应的条件，以确保酶切的准确性和高效性。

然后，进行连接。

连接是将目标DNA片段与质粒进行连接，形成重组质粒。

连接的方法包括经典的T4 DNA连接酶法和无酶法连接等，需要根据实验的具体要求选择合适的方法。

最后，进行质粒鉴定。

鉴定提取的质粒是否包含目标DNA片段，可以通过PCR扩增、酶切鉴定、测序等方法进行验证。

鉴定结果的准确性直接影响后续的实验操作和研究结果的可靠性。

在实际操作中，提取质粒需要严格控制每个步骤的条件和操作，以确保提取的质粒具有高纯度、高浓度和高活性。

同时，需要根据实验的具体要求和目的，选择合适的提取方法和工具，以提高提取效率和成功率。

总之，提取质粒是基因工程中重要的操作步骤，其原理包括细菌培养、DNA提取、酶切、连接和鉴定等多个环节。

掌握提取质粒的原理和操作技巧，对于开展基因工程研究和应用具有重要的意义。

酵母质粒的提取注意事项

酵母质粒的提取注意事项1. 实验前准备在进行酵母质粒提取实验之前，需要准备好所需材料和试剂。

常用的材料包括酵母培养物、细胞裂解液、酶切酶、离心管、离心机等。

试剂方面，需要注意购买高质量的试剂，并按照说明书的要求保存和使用。

2. 细胞培养与处理在进行酵母质粒提取实验之前，需要进行酵母菌的培养和处理。

首先，将酵母菌接种到含有所需培养基的琼脂糖平板上，培养一夜，然后挑取单个菌落转移到液体培养基中，继续培养至所需菌量。

此外，在进行酵母菌细胞处理时，需要注意细胞浓度的控制，避免浓度过高或过低对实验结果产生影响。

3. 细胞裂解与质粒提取酵母菌细胞裂解是酵母质粒提取的重要步骤。

一般情况下，细胞裂解可通过化学方法、机械方法或酶解方法实现。

其中，酶解方法常用于酵母菌质粒提取，具有操作简单、效果较好的特点。

在进行细胞裂解时，需要注意裂解液的选择和浓度，以及裂解时间和温度的控制，以确保细胞完全裂解，质粒DNA充分释放。

4. 质粒DNA纯化与保存在进行质粒提取后，需要对提取得到的质粒DNA进行纯化和保存。

纯化可以通过酚/氯仿法、硅胶柱纯化法或商用质粒纯化试剂盒等方法实现。

在选择纯化方法时，需要根据实验要求和样品特点进行选择，并根据说明书的要求进行操作。

纯化后的质粒DNA应及时保存，可以用TE缓冲液稀释保存在-20°C或-80°C的冰箱中，以避免质粒DNA的降解和损失。

5. 实验操作注意事项在进行酵母质粒提取实验时，还需要注意以下几点操作事项：- 实验室操作要严格遵守无菌操作的要求，以避免外源性DNA的污染。

- 实验过程中注意个人防护，佩戴手套、口罩和实验服，避免实验中的化学品对身体造成伤害。

- 实验前应仔细阅读所用试剂的说明书，了解其性质和使用方法，按照要求准确称取和调配试剂。

- 实验中的离心操作要注意离心管的放置位置和离心速度的选择，以避免样品的溢出和离心管的破裂。

- 实验后要及时清洗实验台面和相关器材，保持实验环境的整洁和无菌。

质粒的制备

原理示意图
实验仪器、材料与试剂
（一）仪器 1. 恒温摇床 2. 超净工作台 3. 高压灭菌锅 4. 高速台式离心机 5. 微量取液器
（二）材料
• 含质粒的E. coli DH5a, JM109, Top10 菌株
（三）试剂
• 1. LB液体培养基（1L）胰蛋白胨 10g 酵母提取物 5 g NaCl 10 g 加去离子水至800ml 搅拌，使溶质完全溶解，用NaOH调节pH值至7.0，加入去离子水至总体积为1升，高压蒸汽灭菌20 分钟。 • LB固体培养基（1L）在上述LB液体培养基（1L）中加入琼脂粉15g。
• 2. STE • 0.1mol/L NaCl 10mmol/L Tris·Cl (pH8.0) 1mmol/L EDTA(pH8.0) 在1.034×105Pa高压灭菌20分钟。 • 3. SolutionⅠ-resuspension solution Ⅰ 50 mmol/L 葡萄糖—使大肠杆菌保持悬浮，不沉淀 25 mmol/L Tris.·Cl (pH 8.0) 10 mmol/L EDTA (pH 8.0)--抑制DNase的活性高压灭菌后，4℃保存备用。 • 4. SolutionⅡ(现用现配制) –lysis solution Ⅱ 0.2mol/L NaOH –裂解细胞 1% SDS –蛋白变性
Relaxed circle Linearized form Super-coiled form
13. 质粒定量：取1-5µl DNA样品，加水稀释至1ml，混匀后转入分光光度计的石英比色杯中(or Nanodrop)，测定 OD260 及OD280，并计算OD260/ OD280比值和DNA浓度： DNA浓度 OD260×稀释倍数×50/1000 （ µg / µl ）浓度= 稀释倍数× 浓度

质粒扩增、提取、转化和转染等操作程序

质粒扩增、提取、转化和转染等操作程序质粒扩增、提取、转化和转染等操作程序一、感受态细菌制备（CaCl2法）1. 从LB平板上挑取新活化的大肠杆菌单菌落，接种于5ml不加Amp的LB培养基中，37℃振荡培养过夜（200r/min，至OD=1.5左右）。

2. 取0.5ml上述振荡过夜的菌液，转入含50ml的LB的三角烧瓶（1%）中，37℃条件下振荡培养2~2.5小时左右（200r/min），使OD600达到0.2~0.4左右（100μl 测600nm时OD值）。

3. 将培养液50ml分装到4个10ml的离心管中，每管10ml，冰上放置10min，4. 4℃条件下，4000r/min离心10分钟，弃上清。

将离心管倒扣在吸水纸上，尽量倒尽管中的培养基。

5. 每管加入预冷的0.1mol/l CaCl2溶液2ml，用枪轻轻吹打，重悬沉淀。

转移到一个离心管中，共8ml。

6. 冰上放置10min后，4℃条件下，4000r/min离心10min。

7. 沉淀用预冷的1.6ml 含有15%甘油的0.1mol/l的CaCl2溶液悬浮。

分装成200μl 的小份，共8管（40ml变为1.6ml浓缩25倍），-70℃保存备用。

二、溶液的配置1. LB培养基：1%蛋白胨（typtone）、0.5%酵母提取物（yeast extract）、1%NaCl，即10g蛋白胨，5g酵母提取物，10g氯化钠溶解在950ml水中，用1mol/LNaOH 调PH至7.0，在补足水至1L。

高压灭菌20分钟备用。

2. 0.1mol/l的CaCl2溶液：1.1g/100ml，称取1.1g CaCl2，加入双蒸水定容至100ml，滤膜过滤或高压灭菌，分装成10ml/小份，4℃保存。

另取8.5ml+1.5ml已灭菌甘油，甘油含量为15%甘油，分装成1ml/小份（10份）4℃保存。

3. 配置液体培养基时，高压灭菌20min备用；4. 配置固体培养基时+（1.5g/100ml）琼脂糖，然后高压灭菌20min。

aidlab酵母质粒提取试剂盒

基因组 DNA 污染
质粒 DNA 缺口或者电泳时超螺旋带前出现变性质粒带 *第一次做实验时，忘记将 RNase A 加入 YP1 溶液，RNase A 失产物中含有 RNA 污染活或者起始处理量过量-建议：第一次实验前确保将 RNase A 加入了溶液 YP1； YP1 溶液超过 3 个月的，可加入一些新 RNase A；处理量不要过量；菌体重悬于 YP1 溶液后可放置几分钟让 RNase A 充分作用后再进行下一步。 *步骤 4 裂解时间过长-建议：裂解时间不要超过 5 分钟。
-20℃ -20℃ 4℃ 室温室温室温室温室温室温室温
试剂盒组成
RNaseA（10mg/ml） Lyticase 溶液 YP1 溶液 YP2 溶液 YP3 去蛋白液 PD 漂洗液 WB 洗脱缓冲液 EB 吸附柱 AC 收集管（2ml）
50 次
µl 150 150µ 0U 250 2500U 15 ml 15 ml 20 ml 25 ml 15 ml 第一次使用前按说明加指定量乙醇 15 ml 50 个 50 个
3.
13,000rpm 离心 1 分钟，尽可能吸弃上清，加入 250μl 溶液 YP1 重悬菌体沉淀，涡旋振荡至彻底悬浮。如果有未彻底混匀的菌块，会影响裂解，导致提取量和纯度偏低。
4.
加 250μl 的溶液 YP2，温和地上下翻转 4 -7 次使菌体充分裂解，室温放置 4 分钟。温和地混合，不要剧烈震荡，以免基因组 DNA 剪切断裂！所用时间不应超过 5 分钟！以免质粒受到破坏。此时菌液应变得清亮粘稠，如果菌体少，很快清亮粘 -4-
1.
取 1.5-5 毫升酵母培养物(不超过 5X10 cells)，9,000rpm 离心 30 秒，尽可能的吸弃上清，收集菌体。收集超过 1.5 毫升菌液，可以离心弃上清后，在同一个 1.5ml 管内加入更多的菌液，重复步骤 1，直到收集到足够的菌体。

抽取质粒的基本原理

抽取质粒的基本原理
抽取质粒的基本原理是利用纯化和分离的方法从细胞中提取质粒DNA。

质粒是细菌或酵母等微生物细胞内自主复制的环状DNA分子。

抽取质粒的基本步骤如下：
1. 培养细胞：首先，需要培养含有目标质粒的细菌或酵母菌株。

这可以通过选择性培养基以及加入适当浓度的抗生素来实现，使只有含有目标质粒的细胞能够生长和存活。

2. 收获细胞：将培养好的细胞离心，以去除培养基和细胞代谢产物。

3. 细胞裂解：将细胞用适当的裂解剂（如SDS、尿素等）处理，以破坏细胞壁和细胞膜，使细胞内容物释放出来。

此时，目标质粒DNA也被释放出来。

4. 质粒分离：通过高速离心，将裂解后的细胞内容物离心分离，将含有目标质粒DNA的上清液分离。

5. DNA纯化：将分离得到的上清液经过一系列的纯化步骤，如酚/氯仿提取、等渗乙醇沉淀等，将目标质粒DNA纯化。

6. 检测和测定：最后，对纯化得到的质粒DNA进行质量和浓度的检测和测定，
以便后续实验的使用。

需要注意的是，抽取质粒的详细步骤可能因实验目的和使用的技术方法而有所不同，但上述基本原理是大致相同的。

6分钟提取质粒

6分钟提取质粒
"6分钟提取质粒" 通常指的是在分子生物学实验中，从细菌中提取质粒的过程，该过程可以在相对较短的时间内完成。

提取质粒是为了获取质粒中的目标基因、DNA片段或其他重要的遗传物质。

以下是一般的质粒提取步骤，这个过程可以在大约6分钟内完成：
1. 培养菌株：
- 开始前，先在培养基中培养含有目标质粒的大肠杆菌（E. coli）菌株。

2. 离心：
- 将培养好的菌液进行离心，将菌体沉淀。

3. 去除培养基：
- 弃去上清液，保留含有大肠杆菌的菌体沉淀。

4. 溶解：
- 使用缓冲液溶解菌体，使DNA释放。

5. 加入溶解剂：
- 加入一些溶解剂，如碱性SDS（十二烷基硫酸钠），破坏膜脂，释放DNA。

6. 快速离心：
- 进行瞬时离心，将膜脂等杂质快速沉淀。

7. 取上清：
- 取上清液中含有的质粒DNA。

8. 沉淀：
- 加入醋酸等溶液，使DNA沉淀。

9. 洗涤：
- 对DNA沉淀进行洗涤，去除残余的盐和其他污染物。

10. 溶解：
- 最后，用适当的缓冲液溶解沉淀的质粒DNA。

这样的质粒提取方法通常使用快速、高效的离心和溶解步骤，使得整个过程可以在相对较短的时间内完成。

实际提取时间可能因具体实验方案和使用的提取试剂盒而有所不同。

质粒提取和纯化及质粒转染所需试剂及操作规范

二、质粒的提取和纯化所需1. 液体LB培养基（1）配方蛋白胨（TRYPONE）1%(g/ml)NaCl1%酵母粉（YEAST EXTRACT）0.5%加蒸馏水定容（2）将配好的培养基高压后，恢复室温后置于4度保存备用，使用时恢复室温（3）配液体LB培养基时，一般不加抗生素（高温会使抗生素失活，也不宜4度保存），因此若要在此培养基中加抗生素，应该在使用时根据比例添加2. 固体LB培养基（1）配方蛋白胨（TRYPONE）1%(g/ml)NaCl1%酵母粉（YEAST EXTRACT）0.5%加蒸馏水定容时（装到可以高压的瓶中），由于加入的琼脂粉有一定的体积，因此定容时，注意略微少加点水，根据要加入的琼脂粉而定（琼脂粉只有在高压后溶解）（2）直接向以上配好的LB中加入加琼脂粉1.5%，以配成固体培养基（3）高压：高压完注意保温，温度过低培养基会凝固，因此从高压锅里取出后应立即铺板（4）铺板此操作在细胞室安全柜中无菌操作，铺板前应提前开紫外灯照台子15min，点燃酒精灯。

若铺的是无抗生素的阴性平板，则在铺板时直接铺板；若铺的是含有抗生素的平板，则在铺板时，应等到高压后的培养基温度降到不烫手时（高温会使抗生素失效），根据比例加入抗生素后在铺板。

培养基铺到平板上，每个平板约25ml，注意保温，一定要在培养基凝固成固体前铺到平板上，铺板时还应不时的摇匀培养基以防止瓶底的培养基因温度过低而凝固，铺好后敞开平板的盖子，待培养基凝成固体后再盖上（约15min）（5）待LB培养基在平板中凝固后，盖上平板的盖子，并用封口膜封好后放到4℃保存备用3. 配置含有抗生素的LB培养基Amp配制时一般为100μg/μl,使用时稀释1000倍Kana配制时一般为50mg/ml，使用时稀释1000倍二、质粒转染真核细胞1、lipo2000（以6孔板转染为例，其他用量请参考说明书）（1）将覆盖率为90-95%的细胞提前用only饥饿3h，转染前换新鲜培养液。

质粒的提取与转化

所用试剂的ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ用酚和氯仿
酚和氯仿都是表面变性剂，非极性分子，可以使蛋白质失去水合状态而变性。 10%间甲酚，降低酚溶点，增加对蛋白质变性。氯仿与水不互溶,能加速有机相与液相分层，去除植物色素和蔗糖。在抽提DNA过程中，由于酚与氯仿是互溶的，所以用酚氯仿混合液效果好。
酚的质量与保存
在提取DNA过程中，酚的质量很重要。酚容易被空气氧化变成粉红色，这种酚易降解DNA，不能用。酚应该重蒸馏，并及时加入pH8.0的Tris水溶液或TE缓冲液饱和酚，酚经水饱和后在抽提DNA时，不会吸收DNA样品中水份，减少 DNA的损失。加入Tris水溶液或TE缓冲液也可以使酚隔绝空气。另外也可加入巯基乙醇和8-羟基喹啉至最终浓度为0.1%目的是抗氧化和抑制RNase酶活性。经这样处理后，将酚分装在棕色瓶中，盖紧后，-20℃保存。可使用数月。
感受态细胞的保存
新鲜感受态细胞用于质粒DNA转化最好。但新鲜感受态细胞0℃~ 4℃贮存不超过3天。长期保存，必须将细胞在70℃干冰或液氮气体部分速冻5分钟，再置于-80℃冰箱中保存，一般可保存1年。
质粒的转化
感受态细胞新鲜配制的或从-80℃冻存取出后置于冰水中融化。 ① 感受态细胞新鲜配制的或从 ℃冻存取出后置于冰水中融化。取出分装到Eppendorf管中，每管管中， ② 取出分装到管中每管100~200uL。。加入需转化的DNA溶液溶液2~5uL充分混匀充分混匀(1~5ng/uL DNA)。 ③ 加入需转化的溶液充分混匀。冰水中放置30分钟分钟。 ④ 冰水中放置分钟。热休克) ⑤ 42℃水浴秒。(热休克 ℃水浴90秒热休克冰浴2min。 ⑥ 冰浴。每管再加入1mL LB培养基，37℃振荡培养小时。培养基， ℃振荡培养1小时小时。 ⑦ 每管再加入培养基

酵母双杂交实验

酵母双杂交相关实验方法1、酵母总DNA的提取方法（蜗牛酶法）1、酵母质粒提取试剂Buffer I 0.9 mol/L Sorbitol0.1mol/L EDTABuffer II 50mM/L Tris20mM/L EDTABuffer III 10mM/L Tris1Mm/L EDTA2、操作步骤：(1) 收集新鲜菌体重加入150μl buffer I，25μl 蜗牛酶（30mg/ml）。

.(2) 37℃水浴1h。

(3) 10000rpm离心10min，去上清，沉淀中加入250μl buffer II。

(4) 加入25μl 10% SDS，65℃水浴30min，每间隔5min中震荡一次。

(5) 加入25μl 5mol/L 醋酸钾，冰浴60min。

(6) 4℃12000rpm离心15min，取上清。

(7) 在上清中加入2-3倍体积的无水乙醇，混匀静置于-20℃，1小时以上。

(8) 取出，4℃12000rpm离心15min ，弃上清。

(9) 加入150μl buffer III 溶解沉淀，用等体积苯酚/氯仿/异戊醇抽提。

(10) 12000rpm离心15min。

(11) 将上清转入新的离心管中，加入6μl(10U/μl)RNA酶 37℃放置30min。

(12) 取上清，加入等体积的异丙醇。

(13) 4℃静置10min，1小时以上或过夜。

(14) 4℃10000rpm 离心5min。

(15) 弃上清，并把沉淀溶于10μl buffer III 中。

2、小规模酵母转化1、酵母转化试剂：转化用试剂除PEG采用过滤灭菌外，其它试剂均需高温高压灭菌，条件同普通培养基灭菌。

(1) M 醋酸锂（Lithium Acetate）(2) 聚乙二醇（Polyethylene glycol，PEG）分子量3350，浓度 50%（w/v）(3) PEG/LiAc 溶液的配制（现用现配）800μl 50%PEG100μl 10×TE100μl 10×LiAc1ml 总体积(4) 1.1×TE/LiAc溶液（现用现配） 11ml 10×TE(5) 11ml 10×LiAc(6) 78ml ddH202、操作步骤：(1) 第一天下午3点将酵母接种于5ml YPDA中，30℃摇菌。

质粒提取方法及原理

质粒提取方法及原理质粒是染色体外能够进行自主复制的遗传单位，当前通常用其来特指细菌、真菌、酵母菌和放线菌等生物中染色体以外的 DNA分子。

在基因工程领域，质粒常常被当做基因的载体使用。

在分子生物学中，质粒 DNA被当做基因运载工具具有非常广泛的应用。

在质粒DNA的应用过程中，其纯度对于酶切、PCR扩增等实验结果有着比较大的影响，因此需要保证质粒DNA提取的纯度和效率。

在细菌中提取质粒DNA通常按照以下步骤进行:第一步，培养细菌，使质粒扩增;第二步，进行细菌的收集和裂解;第三步，质粒 DNA的分离和纯化。

在质粒DNA的提取过程中，其提取效果和其大小呈现出正比例关系，越小越容易进行提取，这主要是由于，如果质粒DNA比较大的话，其特性机会和染色体DNA比较接近，这样想要将二者分离开来难度就会变大。

在进行质粒DNA的分离时，适宜的条件是非常重要的，主要包括pH值、SDS浓度、时间和溶菌温度等，在适宜的条件下质粒DNA和染色体DNA 才能够更好的分离开来。

细菌浓度对于质粒 DNA的提取也是非常重要的，如果细菌的浓度比较高，那么在溶菌时，溶菌液很难和细菌液充分混合，导致溶菌不彻底的问题，这样会造成质粒的回收率比较低；而如果细菌溶度比较低，溶菌液和菌液均分混合，会造成溶液中含有较多的蛋白质、染色体以及菌体碎片，在这样的情况下，沉淀时质粒回合这些物质共沉，进而导致质粒的回收率也会比较低。

在生物学的相关研究之中，细菌质粒DNA的提取是比较常规的技术和操作，主要的方法有碱裂解法、煮沸法以及SDS裂解法等，下面对碱裂解法进行介绍。

碱裂解法碱裂解法是当前应用比较广泛的质粒 DNA提取方法，这种方法的优点在于提取的质粒DNA纯度高，操作便捷，缺点是需要较长的提纯时间。

研究人员在缩短这一方法的提纯时间方面做了大量的研究，但是没有得到理想的效果，当前这一方法提取 DNA 的时间都在1.5h 以上。

碱裂解法提取质粒DNA的基本原理:首选，在菌液中加入溶液Ⅰ，细菌细胞悬浮，同时其中的EDTA会和Ca2+以及Mg2+鳌合，起到抑制DNase活性的作用；然后，加入溶液Ⅱ，将细胞裂解，在这个过程中蛋白质和少量质粒将会变质；再次，加入溶液Ⅲ，使多数蛋白质以及染色体DNA被沉淀，并使得质粒DNA复性。

酵母菌表面展示操作步骤之载体选择与构建

酵母菌表面展示操作步骤之载体选择与构建酵母菌表面展示是一种重要的生物工程技术，在生物学研究、抗原制备和疫苗研发等领域有广泛应用。

在进行酵母菌表面展示实验前，我们需要选择适合的载体并进行构建，以实现目标蛋白的表面展示。

本文将介绍酵母菌表面展示实验的载体选择与构建步骤。

一、载体选择在酵母菌表面展示实验中，常用的载体有质粒和整合载体两类。

质粒载体是通过直接瞬时表达目标蛋白来实现表面展示的，而整合载体则是通过将目标蛋白融合到约束表面展示区域的酵母细胞膜蛋白上，以实现表面展示。

根据实验要求和目标蛋白的特性，我们可以选择适合的载体进行后续实验。

二、质粒载体构建1. 提取质粒：选择适合的质粒载体并进行提取，一般可使用常见的质粒提取试剂盒进行操作，并按照试剂盒说明书进行操作。

2. 构建质粒：将提取的载体与目标蛋白基因进行连接。

可以选择PCR扩增、酶切和连接等方法进行操作。

在连接时注意选择合适的连接酶，避免不必要的损失和错误连接。

3. 转化酵母细胞：将构建好的质粒导入酵母细胞内。

可以采用电穿孔、化学转化等方法进行转化。

转化后，将转化后的细胞分别接种于含有适当选择压力的培养基上，筛选出含有目标质粒的酵母菌株。

三、整合载体构建1. 目标蛋白选择：根据实验需要选择合适的约束表面展示区域的酵母细胞膜蛋白，并设计引物进行PCR扩增。

2. 构建整合载体：将扩增得到的目标蛋白基因与整合载体中相应的表达位点进行连接，常用的有插入杂交、连接酶法等。

连接后的整合载体经测序确认无误后，可继续进行后续实验。

3. 酵母细胞转化：通过适当的方法，将构建好的整合载体导入酵母细胞内，使其整合到酵母细胞染色体上。

4. 酵母菌培养与筛选：将转化后的酵母菌培养在选择性培养基上，筛选出能够稳定表达目标蛋白的酵母菌株。

四、确认载体构建效果1. PCR鉴定：通过PCR方法对含有目标蛋白基因的质粒或整合载体进行鉴定。

根据目标蛋白的特异性引物，可以进行PCR扩增，并通过电泳分析判断目标蛋白基因的连接情况。

一种快速高效提取酵母质粒的方法

产率、纯度和对后续实验的影响等方面进行了比较。结果表明，与另外两种方法比较．玻璃珠液
氮法提取酵母质粒具有效率高、质量好、成本低、时间短、操作简单的优点。可作为实验室规模化
提取酵母质粒的常用方法
ＺＨＡＮＧＹｉ，ＬＩＵＫｕｎ，ＣＡ０Ｐｅｎｇ，ＷＥＩＳｅｎ，ＷＥｌＤａｎ－ｄａｎ，ＤＵＪｉａｎ，ＬＩＰｅｎｇ－ｋｕｎ，ＬＩＣｈｅｎｇ－ｗｅｉ｜
（ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＰｌａｎｔＧｅｎｅｔｉｃｓａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｒｅｅｄｉｎｇ，ＺｈｏｕｋｏｕＮｏｒｍａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｚｈｏｕｋｏｕ４６６００１，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｐｌａｓｍｉｄｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｉｓａｎｉｍｐｏｒｔａｎｔｂｕｔｄｉｆｆｉｃｕｌｔｓｔｅｐｏｆｔｈｅｇｅｎｅｔｉｃｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇｏｐｅｒａｔｉｏｎｓ，ｂｅｃａｕｓｅｏｆｔｈｅｙｅａｓｔｓｃｅｌｌｓｗｉｔｈｔｏｕｇｈａｎｄｕｎｂｒｅａｋａｂｌｅｃｅｌｌｗａｌ１．Ｆｏｒｇｅｔｔｉｎｇｏｎｅｆａｓｔ，ｓｉｍｐｌｅ，ｅｉｃｆｉｅｎｔａｎｄｓｔａｂｌｅｍｅｔｈｏｄｏｆｐｌａｓｍｉｄｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｆｒｏｍｙｅａｓｔｓ，ｗｅｅｍｐｌｏｙｅｄｔｈｅｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓｏｆａｇａｒｏｓｅｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒａｎｄＰＣＲａｍｐｌｉｉｃｆａｔｉｏｎ，ａｎｄｃｏｍｐａｒｅｄｔｈｅｙｉｅｌｄ，ｐｕｒｉｔｙｏｆｐｌａｓｍｉｄｓｗｈｉｃｈｗｅｒｅｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍｙｅａｓｔｓｗｉｔｈｔｈｅｍｅｔｈｏｄｓｏｆｇｌａｓｓｂｅａｄｓ－ｌｉｑｕｉｄｎｉｔｒｏｇｅｎ，ｓｎａｉｌａｓｅａｎｄｋｉｔ．Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｍｅｔｈｏｄｏｆｇｌａｓｓｂｅａｄｓ－ｌｉｑｕｉｄｎｉｔｒｏｇｅｎｈａｄｔｈｅａｄｖａｎｔａｇｅｓｏｆｈｉｇｈｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ，ｇｏｏｄｑｕａｌｉｔｙ，ｌｏｗｃｏｓｔ，ｓｉｍｐｌｅｏｐｅｒａｔｉｏｎｉｎｃｏｎｔｒａｓｔｔｏｔｈｅｏｔｈｅｒｔｗｏ

酵母质粒提取试剂盒操作步骤及注意事项

酵母质粒提取试剂盒操作步骤及注意事项货号：D1160规格：50T/100T保存：室温（15℃-25℃）干燥保存，复检期为12个月。

2℃-8℃保存时间更长。

试剂盒组成D1160-50T D1160-100TRNase A300ul500ul酵母破壁酶 1.25ml 1.25ml×2山梨醇Buffer25ml50mlβ-巯基乙醇300ul600ul溶液YP115ml30ml溶液YP215ml30ml溶液YP320ml40ml漂洗液15ml15ml×2洗脱液15ml30ml吸附柱50个100个收集管50个100个说明书1份1份注意：使用前请先在漂洗液中加入无水乙醇，加入体积请参照瓶体上的标签。

YP1在使用前先加入RNaseA（将试剂盒中提供的RNaseA全部加入），混匀，置于2-8℃保存。

如非指明，所有离心步骤均为使用台式离心机在室温下离心。

产品简介：酵母质粒提取试剂盒采用酶法破碎酵母细胞壁和碱裂解法裂解酵母细胞来提取酵母质粒DNA。

所采用的酵母破壁酶能有效地破坏酵母细胞壁，提高酵母质粒DNA的产量。

吸附柱中采用的硅基质材料能高效、专一地吸附DNA，可最大限度去除杂质蛋白质及细胞中其他有机化合物。

使用酵母质粒提取试剂盒提取的酵母质粒DNA可适用于各种常规的分子生物学实验，包括酶切、PCR、测序、连接和转化等试验。

本试剂盒无需使用酚、氯仿等有毒试剂，操作安全。

操作步骤：1、取1-5ml酵母培养物（不超过5×107cells），12000rpm离心1min，尽量吸除上清（菌液较多时可以通过多次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中）。

2、酵母细胞壁的破除：A、酶法：向酵母菌体中加入470ul山梨醇Buffer，充分悬浮菌体，加入25ul酵母破壁酶和5ulβ-巯基乙醇，充分混匀，30℃处理1-2h，期间可颠倒离心管混匀数次。

12000rpm 离心1min，弃上清，收集沉淀。

向沉淀中加入250ulYP1（请先检查是否已加入RNaseA），充分悬浮沉淀。

质粒提取操作技巧

质粒提取实验材料：1.5ml EP管，枪头，高速离心机，恒温摇床，15/50 ml无菌离心管，水浴锅试剂：ddH2O，质粒小提试剂盒（天根），LB培养基，氨苄霉素，卡那霉素，感受态细菌，琼脂糖培养板实验步骤：1.LB固体培养基及琼脂糖培养板的制备：a)用双蒸水配制100mg/ml氨苄霉素、50mg/ml卡那霉素溶液，0.22μm滤器过滤，1.5ml EP管分装于-20保存；b)配制并高压灭菌LB固体培养基(自然冷却后4℃保存)：1L培养基含Tryptone(胰蛋白胨) 10g、Yeast Extract(酵母提取物) 5g、Nacl10g、再加入15g Agrose，定容到1L (玻璃瓶，此时不加Amp/Kana等抗生素)c)高压灭菌，待培养基自然冷却至50-60℃（温度高于75℃会导致Amp/Kana失效，但也不能太低，否则会使培养基提前凝固），取干净50ml离心管或高压灭菌过的小玻璃瓶，在无菌工作台中倒入冷却的LB培养基，并在按比例（配抗生素时的比例）加入氨苄/卡那霉素，摇匀。

小心倾倒至无菌10cm细菌培养皿中（不宜过多，一般8ml左右轻轻晃动能铺满整个皿底），待培养基自然冷却凝固。

培养板按照抗生素分类标记，继续在超净台（开风机）中倒置放置0.5~1h小时左右，使水分蒸发。

最后封口膜封口，装袋于4℃冰箱保存（注：一般平板应该按照实验需要多倒2~3个培养板，可能有培养板倒过程中产生气泡而不能正常使用）；2.质粒转化：a)在冰上缓慢融解感受态细菌，取30-50μl加入1ul浓度至少200~500ng/ul的质粒。

如果转化连接产物，每50微升感受态细菌加入2-10微升连接产物；（此步骤应严格在冰上操作）b)轻轻用手指弹动离心管，以混匀细菌和质粒或连接产物。

冰浴或冰水浴放置30分钟；c)42ºC水浴，热休克90sec；d)热休克后立即置于冰浴中，5分钟；e)加入500微升LB，37ºC 200rpm培养30-60min，并按比例加入相应的抗生素；f)在此期间准备清洗过的玻璃棒，喷酒精在超菌台紫外照射30min备用；g)将摇床上带培养基的EP管取出，室温2000rbp离心3min，此时应看到底部有白色沉淀；h)用枪吸去上清，剩下50-100ul，用枪将EP管底部的沉淀吹打混匀，在酒精灯旁，涂到含有相应抗生素的LB平板上，玻璃棒涂匀，37ºC恒温箱培养过夜不超过16h。