珠磨法提取酵母基因组
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利用海砂提取酵母基因组
1、挑GS115单菌落接种于50mL三角瓶6mLYPD培养基中,摇两瓶。将30℃,200r/min,培养过夜(16~18h)的酵母细胞分别吸取1.5mL菌液放在1.5mL EP 管中,共8管,12000r/min,5min,离心收集细胞;
2、用无菌水将细胞悬浮(借助10uL枪头),洗细胞,12000r/min,5min,离心;再次用无菌水洗细胞,只洗表面,去上清;
3、加入200uL(0.275g)海砂,200uL裂解液,200uL酚氯仿(25:24),将细胞悬浮(借助10uL枪头),然后涡旋震荡1min,放在冰上1min,重复四次;
4、12000r/min,5min,离心,吸取上清液(260uL),两管合一管,共4管,每管520uL,加入等体积的酚氯仿(酚265uL,氯仿255uL),颠倒混匀,去蛋白,12000r/min,5min,离心;
5、吸取上清液(500uL),加入等体积的酚氯仿(酚255uL,氯仿245uL),颠倒混匀,去蛋白,12000r/min,5min,离心;
6、吸取上清液(480uL),加入等体积的酚氯仿(酚245uL,氯仿235uL),颠倒混匀,去蛋白,12000r/min,5min,离心;
7、吸取上清液(460uL),加入2倍体积(920uL)的无水乙醇,放在—80℃,30min;
8、12000r/min,5min,离心,去上清,加入400uL体积的70%乙醇,用手弹起沉淀,洗涤,12000r/min,5min,离心,去上清,再次加入400uL体积的70%乙醇,只洗表面,去上清,将DNA自然晾干;
9、用20uL的超纯水溶解DNA,加入1uLRNaseA,37℃,消化30min;
10、取5uLDNA溶液,用1%琼脂糖凝胶跑电泳。
试剂配方:
1、1M Tris-Hcl(pH 8.0):配50mL
Tris碱:6.06g
水:50mL
用浓盐酸约2.1mL调pH至8.0,
2、0.5M EDTA(pH 8.0):配50mL
EDTA二钠盐:9.306g
水:50mL
用NaOH(分子量40g/mol)约1g,调pH至8.0
注意:EDTA难溶,需调到pH8.0才能溶解,溶解时超声并加热3、TE缓冲液(pH 8.0):配制500mL
1M Tris-Hcl(pH 8.0):5mL
0.5M EDTA(pH 8.0):1mL
水:494mL,
调pH至8.0
4、提取基因组裂解液配方
Triton X-100:2%
SDS(W/V):1%
Nacl:100mM
Tris.Hcl(pH:8.0):10mM
配100mL裂解液:
Triton X-100:2mL
SDS:1g
Nacl(分子量58.44g/mol):0.5844g
Tris.Hcl(pH:8.0):1M Tris.Hcl(pH:8.0)1mL