珠磨法提取酵母基因组
用于PCR实验的毕赤酵母基因组DNA制备方法的比较
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bp 左右的片段 。P E G 法转染毕赤酵母细胞 。 11212 基因组 DNA 模板的制备 :将菌液分为 4 组 ,每 组设 4 个浓度 (依次 3 倍稀释) , 每个浓度对应 2 管菌液 (每管 1 mL ) ,分别按以下 4 种方法制备毕赤酵母基因组 DNA 模板 , 在相同条件下进行 PCR 扩增 。(1) 玻璃珠法 [2 ]。将 1 mL 菌 液离心收集菌体 , 加入适量酸洗过的玻璃珠 , 剧烈震荡 2 min , 加入 400μL T E 及等体积的 Tris 饱和酚 , 翻转混匀 , 15 000 ×g 离心 5 min , 转移水相至一新离心管 , 加入等体积 的酚 ∶氯仿 ∶异戊醇 (25 ∶24 ∶1) , 颠倒混匀 , 15 000 ×g 离 心 5 min ,吸上清至一新离心管 ,加入 1/ 10 体积 3 mol /L NaAc 及 215 倍体积 95 %冰乙醇 , - 20 ℃过夜 ,4 ℃15 000 × g 离心 10 min ,弃上清 ,加入 1 mL 70 %乙醇 ,15 000 ×g 离心 5 min ,弃上清 ,37 ℃放置 15 min 干燥沉淀 ,沉淀溶于 60μL T E 中 。取适量溶液作为模板进行 PCR 。(2) 煮沸法 。将 1 mL 菌液 2 500 ×g 离心 5 min ,弃上清 ,沉淀中加入 500μL PBS 悬浮沉淀 , 2 500 ×g 离心 3 min ; 弃上清 , 沉淀溶于 100μL T E ,沸水浴 10 min , 15 000 ×g 离心 5 min ,取上清为模板作 PCR 。(3) 煮 - 冻 - 煮法 。将 1 mL 菌液 2 500 ×g 离心 5 min , 弃上清 ,沉淀中加入 500μL PBS 悬浮沉淀 ,2 500 ×g 离心 3 min ; 弃上清 , 沉淀溶于 100μL T E , 沸水浴 10 min , - 80 ℃ 冷冻 30 min ,再次沸水浴 10 min ,1 500 ×g 离心 5 min ,取上 清为模板作 PCR 。(4) 直接法 。直接取一定量原始菌液以不 经处理的菌体为模板进行 PCR 实验 。 11213 PCR 的反应条件 : 将上述获取的模板进行 PCR 扩 增 , AO X 上下游引物按毕赤酵母表达载体 p PlC 9 K 的序列 设 计 , 5 ′AO X1 为 5 ′GAC T GGT TCCAA T T GACAA GC3 ′ 3 ′AO X1 为 5 ′GCAAA T GGCA T TC T GACA TCC3 ′。PCR 反 应体系为无菌水 1315μL , 10 ×PCR buffer 215μL , dN TP2 μL ,上下游引物各 2μL 模板 DNA 2μL , Taq 酶 1μL 。PCR 扩增条件为 95 ℃预变性 5 min ,94 ℃60 s ,57 ℃ 30 s ,72 ℃ 40 s ,进行 35 个循环 ,72 ℃最终延伸 5 min 。
酵母的dna提取实验报告
酵母的dna提取实验报告
（最新版）
目录
一、实验目的
二、实验材料
三、实验步骤
四、实验结果
五、实验讨论
六、实验结论
正文
一、实验目的
本实验旨在通过提取酵母的 DNA，研究酵母的基因组成，并为后续的基因工程实验提供 DNA 样本。
二、实验材料
1.酵母菌种
2.蒸馏水
3.乙醇
4.氯化钠
5.滤纸
6.蒸馏器
7.离心机
三、实验步骤
1.酵母菌种的准备：选用新鲜的酵母菌种，将其放入蒸馏水中，保持适当的浓度。
2.提取 DNA：将酵母菌种放入离心机中，离心一定时间后，取出上清液。
向上清液中加入适量的氯化钠，使 DNA 逐渐析出。
3.滤过：将析出的 DNA 溶液倒入装有滤纸的漏斗中，通过滤纸将杂质滤除。
4.洗涤：将滤纸放入蒸馏水中，反复洗涤，直至滤纸上的 DNA 纯净。
5.乙醇沉淀：将洗涤后的滤纸放入乙醇中，静置一段时间，DNA 会逐渐沉淀。
6.收集 DNA：将沉淀后的 DNA 收集起来，即为提取的酵母 DNA。
四、实验结果
通过实验，成功提取到了酵母的 DNA，实验结果符合预期。
五、实验讨论
在实验过程中，我们发现在加入氯化钠后，DNA 的析出速度较快，说明氯化钠对 DNA 的析出有一定的促进作用。
此外，通过多次洗涤和乙醇沉淀，我们成功地提取到了纯净的酵母 DNA。
六、实验结论
通过本实验，我们成功地提取了酵母的 DNA，为后续的基因工程实验提供了必要的材料。
酵母菌DNA的提取
酵母DNA提取方法方法一：石英砂法1、5000rpm×5min 收集过夜培养的菌体（5ml左右），于200μL 裂解液(50 mmol/ L Tris-HCl pH 8.0 , 180 mmol/ LEDTA pH 8.0 , 1 % SDS , 现配)中，加入3/10 总体积石英砂在涡流混合器上振荡13min，每隔4min 将离心管取出用力甩几下，然后65℃水浴10min。
2、加入200μL 5mol/L KAc，冰浴8min；3、12000rpm×5min 转移上清至新的离心管中；4、加入 3 mol/L NaAc 35μl，加入异丙醇200μL混匀后冰浴8min，12000rpm×5min收集沉淀；5、200μL TE 溶解，加入RNase10μL，65℃水浴10min；6、加入200μL 氯仿－异戊醇（24:1）,抽提；7、温柔地取上清150μL ，加入20μL 3 mol/L NaAc及375μL 无水乙醇，混匀后12000rpm×8min 收集DNA；8、70% 乙醇洗涤沉淀，吹干后TE 溶解，-20℃保藏。
方法二：蜗牛酶法1. 接种于5 ml的YEPD培养基中在25℃-28℃振荡培养12-16 h。
2. 3500 rpm离心5min沉淀细胞，用1ml 的无菌水洗涤一次，再加0.5ml solution Ⅰ(1M 山梨醇，0.1M EDTA, pH=7.5)重悬。
3. 转移细胞至1.5 ml 的离心管中，加入0.1蜗牛酶(30mg/ml)溶液，37℃保温30-60min, 以获得原生质体。
4. 最大转速离心1min以沉淀细胞，用500ulsolutionⅡ(50mMTris-HCl, 20mM EDTA,pH=7.4)溶液悬浮，然后加入50μl 10% SDS, 混合65℃保温30min。
5. 加入200μl 5M 醋酸钾，放于冰上30 min。
4种酵母基因组提取方法的比较
4种酵母基因组提取方法的比较赵宏宇;李珺;赵玥;王馨;蔡禄【期刊名称】《食品科学》【年(卷),期】2011(032)009【摘要】为获得简便高效的提取酵母基因组DNA的方法,分别采用溶菌酶法、蜗牛酶过夜处理法、蜗牛酶反复冻融法和珠磨法处理酵母细胞,在荧光倒置显微镜下观察、比较细胞的破壁情况,提取基因组后利用紫外分光光度计测定样品中DNA 的浓度和纯度以及琼脂糖凝胶电泳和PCR扩增检测基因组DNA的质量.结果表明,除溶菌酶法外,其他3种方法均能提取出高质量的酵母基因组DNA.珠磨法提取酵母基因组具有质量高、成本低、时间短且操作简单的优点.【总页数】4页(P170-173)【作者】赵宏宇;李珺;赵玥;王馨;蔡禄【作者单位】内蒙古科技大学数理与生物工程学院,内蒙古,包头,014010;内蒙古科技大学生物工程与技术研究所,内蒙古,包头,014010;内蒙古科技大学数理与生物工程学院,内蒙古,包头,014010;内蒙古科技大学生物工程与技术研究所,内蒙古,包头,014010;内蒙古科技大学数理与生物工程学院,内蒙古,包头,014010;内蒙古科技大学数理与生物工程学院,内蒙古,包头,014010;内蒙古科技大学数理与生物工程学院,内蒙古,包头,014010;内蒙古科技大学生物工程与技术研究所,内蒙古,包头,014010【正文语种】中文【中图分类】O781【相关文献】1.一种简便高效的酵母基因组提取方法 [J], 唐巧玲;付鹏飞;王旭静;王志兴2.高质量毕赤酵母基因组DNA提取方法比较 [J], 唐天乐;高炳淼;长孙东亭;罗素兰3.酵母基因组及其线粒体基因组提取方法的比较 [J], 钱卫东;赵德志;宁肖肖;周颖欣4.肠道集聚性大肠杆菌基因组脱氧核糖核酸提取方法比较与改进 [J], 杨焕蝶;杨金玉;陈相艳;王易芬;郑琳琳;陈蕾蕾5.6种食用香辛料基因组DNA提取方法比较 [J], 周梦月;邢冉冉;王楠;葛毅强;陈颖因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
酵母基因组及其线粒体基因组提取方法的比较
随着 高通量 测序技术 的快速 发展和 测序成本 的下 降， 人们 已逐 步深入 到组学 的研 究水 平 。 其中， 由于酵 母 菌 是一 类 单细 胞 真核 微生 物 ， 具 有 结 构简 单 、 易 于 培养 、 生 长迅 速 、 遗 传背 景清 晰 ， 而且易 于接 受外 源基 因， 被 广 泛作 为 模 式生 物 或细 胞 工厂 ， 应用 于基 础 研
ｅ ｘ ｔ ｒ ａ ｃ ｔ ｉ ｏｎ ｍｅ ｔ ｈｏ ｄ ｗａ ｓ ａ ｃ ｈ ｉ ｅ ｙ ｅ ｄ． Ｈｅ ｒ ｅ ，ｔ ｈ ｅ ｋ ｉ ｔ ｍｅ ｔ ｈ ｏｄ， ｅ ｎ ｚ ｙｍ ａ ｔ ｉ ｃ ｍｅ ｔ ｈｏｄ ａ ｎ ｄ ｔ ｈ ｅ ｃ ｏ ｍｂ ｉ ｎａ ｔ ｉ ｏｎ ｏｆ Ｌｉ ｏ ＡＣ／ Ｓ Ｄ Ｓ／ ｇ ｌ ａ ｓ ｓ ｂｅ ａ ｄ ｅ ｘ ｔ ｒ ａ ｃ ｔ ｉ ０ｎ ｗｅ ｒ ｅ
Ｉ ０ ｌ Ｉ ！ ！苎 工 业
学 术 研 究
酵母基因组及其线粒体基因组提取方法的比较
钱 卫 东 赵 德 志 宁 肖肖 周 颖 欣
（ 陕西科技 大学生命科学与 工程 学院 陕西西安 ７ １ ０ ０ ２ １ ）
摘 要： 通 过 比较 多形 汉 逊 酵 母 基 因 组 及 其 线 粒 体 基 因组 的提 取 方 法 ， 获 得 一 种 简便 、 快速、 高效 、 合适 、 成 本 低 的提 取 方 法。 本 文 以多形 汉逊 酵母 为研 究对 象， 分别 采用试剂盒 法、 酶解 法和Ｌ ｉ ＯＡＣ／ Ｓ ＤＳ ／ 玻 璃珠组合 法提取 多形 汉逊 酵母 基 因组及 其 线粒体基 因组ＤＮＡ， 进 而运 用核 酸凝胶 电泳、 紫外分光光度计测 定ＤＮＡ浓度 及其纯度 。 结果袁 明 ： Ｌ ｉ ＯＡ Ｃ／ Ｓ ＤＳ ／ 玻璃殊组 合 法具 有ＤＮＡ提 取量 大 、 成本低 、 浓度 高 ； 试剂 盒 法提 取ＤＮＡ纯度较 高、 质 量较好 ， 但 是存 在提取 量 小 ， 浓度较低 ， 成本较 高等 缺 点 ； 酶 解 法 浓度 一般 ， 纯度 差 ， 成 本 高等 缺 点 。
酵母细胞质粒提取步骤和酵母细胞破壁方法
酵母细胞质粒提取步骤和酵母细胞破壁方法酵母细胞的细胞壁比较厚，不容易破壁，不如大肠杆菌的质粒容易提取，最近做了些酿酒酵母的实验，从酿酒酵母中提取质粒，现在就总结下实验的方法和步骤。
酵母细胞质粒提取步骤1. 接种单菌落(待检测酵母细胞)于25mL YNB(补加氨基酸营养物)培养基中，30℃振荡培养过夜。
2.第二天取一滴菌液于进行显微镜下观察,目镜用16,物镜用40倍观察细胞壁破碎前的状态,其成杆状,流动性比较下.3.取10ml的培养酵母菌液,5000g离心3min,弃上清液.加入5ml的1倍TE悬浮.4.将悬浮液倒入高压破壁仪的样品管中,利用高压破碎机进行破碎细胞壁,压力加到20Mpa,停留15s,降压,反复来回压3次.取出细胞液,取一滴于显微镜下观察,如果细胞呈不规则的球状时,而且其流动性比较大,说明其细胞壁已经破碎成为原生质体.5.取2个EP管,每管加入1.5ml上述的细胞液,12000g离心5min,收集原生质体.弃取上清液,每管加入300ul10%的SDS溶液,混匀冰浴5min,进行破原生质体.6.然后加入150ul的tris饱和酚,和150ul的卤仿异戊醇混合液(卤仿:异戊醇=24:1),混匀,12000g,离心10min.7.将水相移到另一EP管中,加入等体积的卤仿异戊醇混合液(卤仿:异戊醇=24:1), 混匀,12000g,离心10min.8. 将水相移到另一EP管中,加入1/10体积的3M KAC溶液和2倍体积的无水乙醇,放入-20℃冰箱中9.1h,12000g离心10min,倒出乙醇,等干燥后加入1ml的70%的无水乙醇,混匀,12000g,离心10min.10.弃去乙醇,等室温干燥后,每管加入20ul的TE溶液(如要去处RNA酶,加入1ul的100mg/ml 浓度的RNA酶),放入-20℃冰箱即可.11.跑电泳进行检测是否从酵母菌中提出质粒了.酵母破壁方法我给你介绍两个必叫简单点的酵母破壁方法，非常实用，我作过很多实验，这两个方法是我自己总结出来的，希望对你有用。
酵母菌DNA的提取
酵母DNA提取方法方法一：石英砂法1、5000rpm×5min 收集过夜培养的菌体（5ml左右），于200μL 裂解液(50 mmol/ L Tris-HCl pH 8.0 , 180 mmol/ LEDTA pH 8.0 , 1 % SDS , 现配)中，加入3/10 总体积石英砂在涡流混合器上振荡13min，每隔4min 将离心管取出用力甩几下，然后65℃水浴10min。
2、加入200μL 5mol/L KAc，冰浴8min；3、12000rpm×5min 转移上清至新的离心管中；4、加入 3 mol/L NaAc 35μl，加入异丙醇200μL混匀后冰浴8min，12000rpm×5min收集沉淀；5、200μL TE 溶解，加入RNase10μL，65℃水浴10min；6、加入200μL 氯仿－异戊醇（24:1）,抽提；7、温柔地取上清150μL ，加入20μL 3 mol/L NaAc及375μL 无水乙醇，混匀后12000rpm×8min 收集DNA；8、70% 乙醇洗涤沉淀，吹干后TE 溶解，-20℃保藏。
方法二：蜗牛酶法1. 接种于5 ml的YEPD培养基中在25℃-28℃振荡培养12-16 h。
2. 3500 rpm离心5min沉淀细胞，用1ml 的无菌水洗涤一次，再加0.5ml solution Ⅰ(1M 山梨醇，0.1M EDTA, pH=7.5)重悬。
3. 转移细胞至1.5 ml 的离心管中，加入0.1蜗牛酶(30mg/ml)溶液，37℃保温30-60min, 以获得原生质体。
4. 最大转速离心1min以沉淀细胞，用500ulsolutionⅡ(50mMTris-HCl, 20mM EDTA,pH=7.4)溶液悬浮，然后加入50μl 10% SDS, 混合65℃保温30min。
5. 加入200μl 5M 醋酸钾，放于冰上30 min。
酵母基因组DNA快速提取试剂盒(离心柱型)操作方法及步骤说明书
酵母基因组DNA 快速提取试剂盒目录号：DN20适用范围：适用于快速提取各种酵母基因组DNA试剂盒组成、储存、稳定性：试剂盒组成 保存50次 平衡液 室温 5 ml 缓冲液YB 室温20 ml 结合液CB 室温11 ml 抑制物去除液IR 室温25 ml 漂洗液WB 室温15 ml 第一次使用前按说明加指定量乙醇 洗脱缓冲液EB 室温 15 ml Lytic Enzyme -20℃2.5 ml 蛋白酶K 粉（可选）20mg/ml -20℃20mg 吸附柱AC 室温50个 收集管（2ml ） 室温 50个本试剂盒在室温储存12个月不影响使用效果。
储存事项:目录编号包装单位 DN200150次 DN2031 50次（带蛋白酶K ，带Lytic Enzyme ）1.结合液CB或者抑制物去除液IR低温时可能出现析出和沉淀，可以在37℃水浴几分钟帮助重新溶解，恢复澄清透明后冷却到室温即可使用。
2.为避免降低活性，方便运输，提供蛋白酶K为冻干粉状（20mg），收到后，可短暂离心后，加入1毫升灭菌水溶解配制成20mg/ml溶液，因为反复冻融可能会降低酶活性，因此溶解后立即按照每次使用量分装冻存，－20℃保存。
3.Lytic Enzyme为蜗牛酶甘油储液，因此比较粘稠，请小心取用，－20℃保存。
蜗牛酶是从蜗牛的嗦囊和消化道中制备的混合酶，它含有纤维素酶，果胶酶，淀粉酶，蛋白酶等20多种酶。
适合破碎溶解各种酵母的细胞壁。
4.避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、pH值变化，各溶液使用后应及时盖紧盖子。
产品介绍：该试剂盒采用DNA吸附柱和独有的溶液系统，适合于从多种来源的酵母培养物中快速简单地提取基因组DNA。
约3ml处于指数生长期的酵母培养液一般一次抽提可纯化出10-15μg的高质量的基因组DNA。
纯化DNA产物可直接用于PCR、酶切和杂交等实验。
酵母细胞经lytic Enzyme处理去除细胞壁后，独特的结合液/蛋白酶K迅速裂解细胞和灭活细胞内核酸酶，然后基因组DNA在高离序盐状态下选择性吸附于离心柱内硅基质膜，再通过一系列快速的漂洗－离心的步骤，抑制物去除液和漂洗液将细胞代谢物，蛋白等杂质去除，最后低盐的洗脱缓冲液将纯净基因组DNA从硅基质膜上洗脱。
不同破壁方法提取酵母菌总RNA的比较
不同破壁方法提取酵母菌总RNA 的比较易 弋1，容元平1，程谦伟1，黎 娅1，王晓林2(1.广西工学院生物与化学工程系，广西 柳州 545006；2. 中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所病原微生物生物安全国家重点实验室，北京 100071)摘 要：选择液氮碾磨、反复冻融、超声波、加玻璃珠漩涡振荡和蜗牛酶酶解5种方法破碎酵母菌细胞壁，再使用Trizol 法提取酵母菌总RNA ，通过对总RNA 进行质量浓度和纯度分析，比较不同破壁方法对酵母菌总RNA 提取的影响。
结果表明：在使用Trizol 法提取酵母菌总RNA 的实验中，反复冻融和液氮碾磨是较为有效且简便的酵母菌细胞壁破碎方法。
关键词：Tr iz ol 试剂；R NA 提取；酵母菌；破壁Comparison of Different Cell Wall Disruption Methods for Yeast Total RNA ExtractionYI Yi 1，RONG Yuan-ping 1，CHENG Qian-wei 1，LI Ya 1，WANG Xiao-lin 2(1. Department of Biological and Chemical Engineering, Guangxi University of Technology, Liuzhou 545006, China ；2. State Key Laboratory of Pathogen and Biosecurity, Institute of Microbiology and Epidemiology, Academy of Military Medical Sciences of thePLA, Beijing 100071, China)Abstract ：Five methods such as liquid nitrogen grinding, repeated freeze-thawing, ultrasonic treatment, vortex shaking with glass beads and snailase hydrolysis were used to break the cell wall of yeast for the extraction of total RNA by the Trizol method.Based on total RNA concentration and purity, these methods were compared for their effects on total RNA extraction from yeast. The results showed liquid nitrogen grinding and repeated freeze-thawing were the most effective and convenient methods for total RNA extraction from yeast by Trizol.Key words ：Trizol ；RNA extraction ；yeast ；cell wall disruption中图分类号：Q936 文献标识码：A 文章编号：1002-6630(2011)11-0161-04收稿日期：2010-09-03基金项目：广西壮族自治区青年科学基金项目(桂科青0991010)；广西壮族自治区教育厅科研项目(200707MS069)作者简介：易弋(1979—)，男，副教授，博士，主要从事生物工程研究。
磁珠法 酵母
磁珠法酵母
磁珠法是一种测定酵母群落结构和多样性的分子生物学方法。
该方法的基本原理是利用特定的引物与酵母DNA中的保守序列结合，通过聚合酶链反应扩增目标DNA片段。
然后，将这些扩增产物连接到磁性珠子上，通过磁力分离的方式将目标DNA分离出来。
最后，通过对分离得到的DNA进行测序分析，可以快速、准确地鉴定酵母群落中存在的不同菌种的数量和种类。
磁珠法在酵母研究中广泛应用，可以提供详细的酵母种群结构和多样性信息，为深入了解酵母的功能与相互作用提供重要的依据。
重组法酵母转基因的操作流程
重组法酵母转基因的操作流程1.酵母基因组DNA的提取酵母基因组DNA提取的目的是获取酵母菌体内的DNA用于后续的操作。
一般采用裂解酵母菌体的方法提取DNA，具体步骤如下：-通过酵母预培养，得到酵母菌悬浮液。
-沉淀酵母菌悬浮液，去除培养基。
-使用细胞裂解缓冲液裂解酵母细胞，释放DNA。
-使用丙酮沉淀DNA，去除其他杂质。
-通过洗涤、溶解等步骤得到纯化的酵母基因组DNA。
2.外源DNA的构建外源DNA的构建是将目标基因或其他DNA片段经过特定的操作，构建成可用于转基因的载体DNA。
-针对目标基因，进行PCR扩增或使用其他适当的方法获得目标DNA片段。
-将目标DNA片段与载体DNA进行连接，一般采用限制酶切和DNA连接酶的方法。
-外源DNA还可以构建其他特殊序列，如启动子、标记基因等，以实现特定的目标。
3.酵母菌体的转化转化是将外源DNA导入酵母中，使酵母细胞能够表达外源基因。
酵母菌体转化一般有两种方法：化学法和电转化法。
-化学法转化：-制备酵母靶菌株，包括选择合适的酵母菌株及对应培养基成分的调整。
-制备产生低盐胆固醇溶液和转化缓冲盐溶液。
-稀释酵母导入质粉末，并加入充足的低盐胆固醇溶液。
-在冰上孵育一段时间，将混合液通过热激冷冻的方法转移到电泳气泡中。
-通过勺子串入导入液，冻结导入液后，电泳电环泵注入电泳。
-电泳过程中伴有导入液的减量。
结束电泳时，针尾切割成小片。
-电转化法转化：-将酵母细胞培养至对应的生长期。
-调整酵母细胞浓度。
-准备转化缓冲盐溶液和性相为空凝气泡的溶液。
-将酵母细胞和目标DNA溶液混合。
-通过不同电压的电击法将酵母细胞进行电转化。
-回收转化后的酵母菌体并进行培养。
4.筛选转基因酵母为了筛选出成功转基因的酵母细胞，一般采用标记基因的方法。
-构建一个可表达特定筛选标记基因的转基因酵母菌株。
-将转化后的酵母菌种悬浮液培养在含有选择性的培养基中，使只有转基因酵母能够存活下来。
-通过对菌落进行PCR扩增或其他方法，确认是否成功获得目标基因的酵母菌株。
一种简便高效的酵母基因组提取方法
一种简便高效的酵母基因组提取方法唐巧玲;付鹏飞;王旭静;王志兴【摘要】提取基因组进行检测是酵母研究过程中的必要步骤之一.以毕赤酵母菌株GS115作为研究对象,主要成分为0.2 mol/L醋酸锂和1％ SDS的酵母裂解液能高效的裂解酵母细胞壁.与两种酵母基因组提取试剂盒相比,该方法从相同体积的酵母培养液中获得的基因组的量高5倍以上,并且操作简便、快速,能在2h内完成一次提取过程,极大地缩短了时间.以GS115中的内源AOX基因为目的基因,对提取的基因组进行PCR检测和Southern杂交检测,进一步验证了基因组的质量.因此,本文建立了一种简便、快速、经济而高效的酵母基因提取方法.【期刊名称】《生物技术进展》【年(卷),期】2012(002)004【总页数】4页(P293-296)【关键词】酵母;GS115;基因组提取;溶壁酶【作者】唐巧玲;付鹏飞;王旭静;王志兴【作者单位】中国农业科学院生物技术研究所,北京100081;中国农业科学院生物技术研究所,北京100081;中国农业科学院生物技术研究所,北京100081;中国农业科学院生物技术研究所,北京100081【正文语种】中文酵母因其遗传背景清楚、操作简便、生长快速等特点,常常作为真核基因表达的模式体系。
此外,酵母还广泛应用于食品生产和基因工程。
在研究过程中,提取酵母基因组进行目的基因的检测是必要步骤之一。
酵母细胞壁厚实坚韧,厚度为0.1～0.3 μm,重量占细胞干重的18%～30%,它的结构类似三明治,外层为甘露聚糖,中间是蛋白质分子层,内层为葡聚糖。
外层的甘露聚糖主链以α-1,6 糖苷键结合,支链以α-1,2 或α-1,3 糖苷键结合,内层的β-葡聚糖主链以β-1,6 糖苷键结合,支链以β-1,3糖苷键结合,形成网状结构,维持细胞壁的强度和韧性[1]。
因此,有效的破除酵母细胞壁是成功提取高质量酵母基因组的关键。
目前,文献报道了多种酵母基因组提取方法,如碱裂解法[2]、反复冻融法[3]、液氮研磨法[4]、超声波破碎法[5]、珠磨法[6]、蜗牛酶法[1]和溶壁酶法[7]等,这些方法利用的原理不同,各有利弊。
珠磨法提酵母基因组DNA
珠磨法提酵母基因组DNA
1. 收集过夜培养16～18h 的菌体1.5mL，用TE 洗涤两次
2. 溶于200μL TE中，加入50mg玻璃珠(直径0.3～0.5mm)和100μL 酚- 氯仿(体积比25:24)，漩涡振荡3min；
3. 12000r/min 离心2min，取上清液，
4. 加入等体积酚- 氯仿(体积比25:24)，抽提后（漩涡震荡15s）
5. 12000r/min 离心5min；
6. 取上清液，加入0.5μL RNaseA，37℃温浴30min；
7. 加入两倍体积无水乙醇，－20℃静置30min；
8. 10000r/min 离心5min，
9. 沉淀物用70% 乙醇洗两次（切勿吸打），自然干燥后，溶于20μL TE，保存。
液氮研磨法大提
1.收集过夜培养16～18h 的菌体100mL，用TE 洗涤两次
高速离心、去上清，吸水纸吸干，液氮充分研磨
2. 溶10ml TE中，加入5ml酚-氯仿(体积比25:24)，漩涡振荡3min；
3. 12000r/min 离心2min，取上清液，
4. 加入等体积酚- 氯仿(体积比25:24)，抽提后（漩涡震荡15s）
5. 12000r/min 离心5min；
6. 取上清液，加入0.5μL RNaseA，37℃温浴30min；
7. 加入两倍体积（预冷）无水乙醇，-20℃静置30min（或者更长）；
8. 10000r/min 离心5min，
9. 沉淀物用70%（预冷）乙醇洗两次（切勿吸打），自然干燥后，溶于100μL TE，保存。
玻璃珠法提取基因组DNA
图 １ ＰＣＲ 产物的 ２％ 琼脂糖凝胶电泳 １、２： 蛋白酶 Ｋ 法提取基因 组 ＤＮＡ 为 模 板 的 扩 增 结 果 ； ３ ： ＤＮＡ 分 子 量 标 志 ： ２ ０００、１ ０００、７５０、５００、２５０、１００ ｂｐ （ 由 上 至 下 ） ； ４、５： 玻 璃珠法提取基因组 ＤＮＡ 为模板的扩增结果。
（ ２００５－ １１－ ０７ 收稿）
玻璃珠法提取基因组 ＤＮＡ
戈海泽， 郭 刚， 张 瑞， 孙 蓓 （ 天津医科大学内分泌研究所， 天津 ３０００７０）
［ 关键词］ 玻璃珠； 基因组 ＤＮＡ； ＰＣＲ
［ 中图分类号］ Ｑ７５
［ 文献标识码］ Ｂ
［ 文章编号］ １００６－ ８１４７（ ２００６） ０２－ ０３１３－ ０２
表 １ 不同方法所得 ＤＮＡ 的纯度和浓度 ｘ±ｓ
方法 玻璃珠法 蛋白酶 Ｋ 法
Ａ２６０ ０．１２６ ０．０２ ０．１１９ ０．０２
Ａ２８０ ０．０７１ ０．０１ ０．０６７ ０．０２
Ａ２６０／Ａ２８０ １．７７５ ０．０２ １．７７８ ０．０２
ＤＮＡ 浓度 ０．１２６ ０．０１ ０．１１９ ０．０２
醇沉淀核酸， 但相对而言它们的操作都较为繁琐。 本实验通过玻璃珠法以及蛋白酶 Ｋ 法分别从组织 中 提 取 ＤＮＡ 得 出 以 下 结 论 ： （ １） ２ 种 方 法 所 提 取 的 ＤＮＡ 纯度及浓度无明显差异（ Ｐ＞０．０５） ， 都能得到适 合 ＰＣＲ 扩增的理想模板。（ ２） 玻璃珠法操作简便、省 时省力， 分别用以上 ２ 种方法提取相同标本的 ＤＮＡ， 玻 璃 珠 法 相 对 蛋 白 酶 Ｋ 法 要 节 省 一 半 的 时 间。（ ３） 玻璃珠法提取基因组 ＤＮＡ 非常经济， 每个标 本只需 ７￣８ 粒玻璃珠即可提取到所需 ＤＮＡ， 而蛋白 酶 Ｋ 法成本相对较高。本实验分别用 ２ 种方法提取 １５ 个标本的 ＤＮＡ， 蛋白酶 Ｋ 法所用成本是前者的 ３ 倍左右。玻璃珠法提取基因组 ＤＮＡ 是对以前方法的 改进， 对基础研究有一定的推广应用价值。 参考文献：
酿酒酵母ARS305侧翼序列对其自主复制活性的影响
酿酒酵母ARS305侧翼序列对其自主复制活性的影响真核生物染色体中存在多个复制起始位点，能够使真核生物巨大的基因组在较短时间内完成复制。
酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的复制起始位点称为自主复制序列（Autonomously replicating sequence，ARS），首次在酿酒酵母的TRPI基因紧密连锁DNA序列中发现，含有ARS的质粒转化酵母后能独立存在于宿主染色体外且能自主复制。
此后，Irene等从酿酒酵母Ⅲ号染色体中共发现有19个ARS，约为150 bp，其中含有一段11 bp富含A/T的保守序列ACS[5′-（A/T）TTTA（T/C）（A/G）TTT （A/T）-3′]。
然而含有保守序列ACS的不同片段在ARS活性方面却表现出明显的差异，部分活性高的ARS却没有ACS保守序列。
说明DNA复制起始功能不仅由ACS保守序列决定，还需核心序列3′和5′侧翼序列的参与。
在酵母遗传工程中，不考虑载体-宿主系统的类型、外源基因产物的性质和工程菌的培养条件等因素，重组质粒的稳定性可以从功能上鉴定复制起始位点的活性。
通过DNA重组技术将可能含有ARS的DNA片段构建到缺失复制起始位点的质粒后转入1/ 7细胞，如果它有较高的细胞转化率并且表现为遗传不稳定性，就表明该片段在宿主菌中可能有复制起始位点活性。
本研究扩增了以ARS305为核心的不同长度侧翼序列，并将其构建到酵母整合型载体pRS405中，通过电转化法转入酿酒酵母细胞中，测定了不同ARS片段对酵母转化效率及质粒在酵母中稳定性，为后续以酵母作为模式生物研究真核基因的复制与转录机制提供了参考。
1 材料与方法1.1 材料1.1.1 菌株和质粒Esherichia coli DH5α为内蒙古科技大学生物工程与技术研究所基因工程实验室保藏。
酿酒酵母YPH499（MATα ura3-52 lys2-801 anber ade2-101 ochre trp1-Δ63 his3-Δ200 leu2-Δ1）、整合型载体pRS405由美国新泽西州医学院微生物学与分子遗传学部Newlon教授馈赠。
高质量毕赤酵母基因组DNA提取方法比较
Abstrac:t In orde r to find an optim ized and e ffective m ethod, the re w ere five m ethods o f yeast g enom ic DNA extrac tion to be compared, including sna ilase, u ltrasonic ex traction, liqu id nitrogen a ttr ition, ly ticase and yeast DNA k it m ethods T he genom ic DNA qua lity w as exam ined by e lectrophoresis and u ltrav iolet spectropho tom eter R esults dem onstrated that genom ic DNA of P ichia p astor is could be iso la ted by a ll the five me thods, in wh ich snailase m ethod w as the best one to get h igh qua lity DNA T here fore, the snailase m ethod show ed m any advantag es such as relatively low expense and h igh effic iency over the rest
g) 非常高质量的基因组 DNA 用于酶切消 化。本 试验通过几种提取酵母基因组 DNA 的不同方法, 探 索出适合大规模提取高质量的酵母基因组 DNA 的 方法, 为进一步鉴定提供保证。
收稿日期: 2009 10 09 基金项目: 国家 863 计划 ( 2007AA 02Z114) , 国家自然科学基金 项目 ( 30860368) , 重大新药 创制国家 科技重大 专项课题ห้องสมุดไป่ตู้项目 ( 2009ZX 09103
乙醇发酵中酿酒酵母辅酶NAD+及NADH测定方法
乙醇发酵中酿酒酵母辅酶NAD+及NADH测定方法李骆冰;王永红;庄英萍;储炬;张嗣良【期刊名称】《食品与生物技术学报》【年(卷),期】2011(030)002【摘要】乙醇发酵过程中酿酒酵母细胞辅酶NAD+和NADH质量分数及其比例反映了胞内的氧化还原状态和细胞代谢活性,具有重要的生理意义.作者主要研究了加热萃取、珠磨破碎、反复冻融破碎3种方法对乙醇发酵过程酿酒酵母细胞辅酶NAD+和NADH提取和测定的影响,提出基于珠磨破碎、辅以加酸或碱并加热的萃取模式,以及合适的酶循环反应体系,从而建立了高效的胞内NAD+和NADH检测方法.【总页数】8页(P287-294)【作者】李骆冰;王永红;庄英萍;储炬;张嗣良【作者单位】华东理工大学,生物反应器工程国家重点实验室,上海,200237;华东理工大学,生物反应器工程国家重点实验室,上海,200237;华东理工大学,生物反应器工程国家重点实验室,上海,200237;华东理工大学,生物反应器工程国家重点实验室,上海,200237;华东理工大学,生物反应器工程国家重点实验室,上海,200237【正文语种】中文【中图分类】TQ920.1【相关文献】1.酿酒酵母菌体中辅酶Q10的提取及测定方法 [J], 赵树全;刘悦才;江国托2.绿色木霉BGLⅠ基因在酿酒酵母中的克隆表达及其纤维素乙醇发酵 [J], 刘泽寰;唐根云;全艳彩;龚映雪;肖文娟;王峻梅3.辅酶NADH模型物BNAH与活化烯烃在氧气饱和混合溶剂中的反应机理研究[J], 王珏玉;冯乙巳4.CO2背压啤酒发酵中乙酰辅酶A与酿酒酵母生长和酯类生成的相关性分析 [J], 杨东升;刘腊;李鹏5.增加NADH/NAD(+)的比例可提高根癌农杆菌中辅酶Q_(10)的产量 [J], Koo BS;龚桂花因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
酵母基因组编辑技术的应用
酵母基因组编辑技术的应用酵母（yeast）是科研领域中使用最多的模型生物之一。
通过对酵母基因组组成的研究，科学家们可以深入了解基因与生物现象之间的关系，也可以探究与疾病相关的基因机制。
而在当今时代，酵母基因组编辑技术的应用，更是在加速着这一研究领域的进展。
一、什么是酵母基因组编辑技术？酵母基因组编辑技术是利用基因编辑技术对酵母基因组进行修改的方法。
基因组是指一个生物体所有基因的集合体，而基因是决定生物特征、掌控生物活动以及维持生命机能的遗传物质。
酵母基因组编辑技术可以使我们更精准地修改酵母基因组，从而实现对酵母生物体性状的调控。
基因组编辑技术的主要基础是核酸修饰的体外合成以及CRISPR-Cas人造核酸酶修饰技术。
CRISPR-Cas系统识别特定序列并进行切割粘贴。
酵母基因操作通常采用质粒表达CRISPR-Cas复合物，配合特定的gRNA序列对靶序列进行切割，然后通过相应的修饰酵母将新的基因修改涉及到基因的插入、删除、替换、修饰等操作。
二、1、酵母紧缩染色质功能研究酵母核DNA以轨道方式排列在核组中。
在细胞减数分裂阶段，染色体会被细胞分裂成单倍体表型，易于实验室分析。
利用酵母基因组编辑技术，研究人员发现，酵母紧缩染色质实际上是由SWI/SNF等复合物获取的。
此外，这些研究还揭示了什么样的突变会导致紧缩染色质的失调，这对于了解染色体畸变在不同癌症中的作用是非常重要的。
2、基因组插入和探测在选择压力或药物暴露的酵母中，可通过基因组编辑技术插入基因，其可以在酵母之间分离，从而产生属性和特定表达。
另外，生物技术人员也可以利用酵母基因组编辑技术插入一个与基因相关的荧光标记，以追踪基因表达时的信息。
这些酵母变异体的构建还可以用于酶定位和组件交互测试。
3、酵母基因组修饰技术在创新研发中的应用酿造和饮食史长且悠久，酿造工艺主要利用酵母发酵的生物过程来生产酒类。
随着酒类市场的不断扩大和人们对食品安全、口感的要求提高，人们对酿酒过程和酿制过程也越发关注。
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利用海砂提取酵母基因组
1、挑GS115单菌落接种于50mL三角瓶6mLYPD培养基中，摇两瓶。
将30℃，200r/min，培养过夜（16~18h）的酵母细胞分别吸取1.5mL菌液放在1.5mL EP 管中，共8管，12000r/min，5min，离心收集细胞；
2、用无菌水将细胞悬浮（借助10uL枪头），洗细胞，12000r/min，5min，离心；再次用无菌水洗细胞，只洗表面，去上清；
3、加入200uL（0.275g）海砂，200uL裂解液，200uL酚氯仿（25:24），将细胞悬浮（借助10uL枪头），然后涡旋震荡1min，放在冰上1min，重复四次；
4、12000r/min，5min，离心，吸取上清液（260uL），两管合一管，共4管，每管520uL，加入等体积的酚氯仿（酚265uL，氯仿255uL），颠倒混匀，去蛋白，12000r/min，5min，离心；
5、吸取上清液（500uL），加入等体积的酚氯仿（酚255uL，氯仿245uL），颠倒混匀，去蛋白，12000r/min，5min，离心；
6、吸取上清液（480uL），加入等体积的酚氯仿（酚245uL，氯仿235uL），颠倒混匀，去蛋白，12000r/min，5min，离心；
7、吸取上清液（460uL），加入2倍体积（920uL）的无水乙醇，放在—80℃，30min；
8、12000r/min，5min，离心，去上清，加入400uL体积的70%乙醇，用手弹起沉淀，洗涤，12000r/min，5min，离心，去上清，再次加入400uL体积的70%乙醇，只洗表面，去上清，将DNA自然晾干；
9、用20uL的超纯水溶解DNA，加入1uLRNaseA，37℃，消化30min；
10、取5uLDNA溶液，用1%琼脂糖凝胶跑电泳。
试剂配方：
1、1M Tris-Hcl(pH 8.0)：配50mL
Tris碱：6.06g
水：50mL
用浓盐酸约2.1mL调pH至8.0,
2、0.5M EDTA(pH 8.0)：配50mL
EDTA二钠盐：9.306g
水：50mL
用NaOH（分子量40g/mol）约1g，调pH至8.0
注意：EDTA难溶，需调到pH8.0才能溶解，溶解时超声并加热3、TE缓冲液（pH 8.0）：配制500mL
1M Tris-Hcl(pH 8.0)：5mL
0.5M EDTA(pH 8.0)：1mL
水：494mL，
调pH至8.0
4、提取基因组裂解液配方
Triton X-100：2%
SDS(W/V)：1%
Nacl：100mM
Tris.Hcl（pH：8.0）：10mM
配100mL裂解液：
Triton X-100：2mL
SDS：1g
Nacl（分子量58.44g/mol）：0.5844g
Tris.Hcl（pH：8.0）：1M Tris.Hcl（pH：8.0）1mL。