酵母菌DNA的提取

酵母DNA提取方法

方法一：

石英砂法

1、5000rpm×5min 收集过夜培养的菌体（5ml左右），于200μL 裂解液(50 mmol/ L Tris-HCl pH 8.0 , 180 mmol/ LEDTA pH 8.0 , 1 % SDS , 现配)中，加入3/10 总体积石英砂在涡流混合器上振荡13min，每隔4min 将离心管取出用力甩几下，然后65℃水浴10min。

2、加入200μL 5mol/L KAc，冰浴8min；

3、12000rpm×5min 转移上清至新的离心管中；

4、加入 3 mol/L NaAc 35μl，加入异丙醇200μL混匀后冰浴8min，12000rpm×5min收集沉淀；

5、200μL TE 溶解，加入RNase10μL，65℃水浴10min；

6、加入200μL 氯仿－异戊醇（24:1）,抽提；

7、温柔地取上清150μL ，加入20μL 3 mol/L NaAc及375μL 无水乙醇，混匀后

12000rpm×8min 收集DNA；

8、70% 乙醇洗涤沉淀，吹干后TE 溶解，-20℃保藏。

方法二：

蜗牛酶法

1. 接种于5 ml的YEPD培养基中在25℃-28℃振荡培养12-16 h。

2. 3500 rpm离心5min沉淀细胞，用1ml 的无菌水洗涤一次，再加0.5ml solution Ⅰ(1M 山梨醇，0.1M EDTA, pH=7.5)重悬。

3. 转移细胞至1.5 ml 的离心管中，加入0.1蜗牛酶(30mg/ml)溶液，37℃保温30-60min, 以获得原生质体。

4. 最大转速离心1min以沉淀细胞，用500ulsolutionⅡ(50mMTris-HCl, 20mM EDTA,pH=7.4)溶液悬浮，然后加入50μl 10% SDS, 混合65℃保温30min。

5. 加入200μl 5M 醋酸钾，放于冰上30 min。

6. 最大转速离心15min，转移上清液至新的离心管中，用等体积的异丙醇沉淀DNA。

7. 室温下放置5min，离心10min，用70%的乙醇洗涤一次，真空干燥，用50ul pH=7.4 TE溶液溶解。

方法三：

蜗牛酶过夜处理法

将酵母接种到YPD培养基中30℃过夜培养16～18h，离心收集1.5mL，用灭菌水洗涤两次；加入600μL裂解液，35μL蜗牛酶，37℃消化过夜；加入饱和酚450μL，氯仿-异戊醇(体积比24:1)150μL，轻轻颠倒混匀使溶液成为乳状，并保持10min，3000r/min离心10min；吸取上清液，用氯仿-异戊醇(体积比24:1)450μL再抽提1次，10000r/min离心5min；取上清加入异丙醇800μL，－20℃静置30min；10000r/min离心5min，沉淀物用70%乙醇洗两次，自然干燥后溶于30μL TE缓冲液；加入0.5μL10mg/mL的RNaseA，37℃温浴30min，自然冷却后保存。

方法四：

蜗牛酶反复冻融法

收集过夜培养16～18h的菌体1.5mL，加入500μLPBS溶液重悬菌体，12000r/min离心2min，用PBS重洗一次；将沉淀溶于35μL的蜗牛酶溶液中，加入65μL的PBS，45℃作用2h，加100μL裂解液，－20℃冷冻，然后室温振荡溶解，反复3次；向悬浮液中加入150μL 5mol/L KAc(pH8.9)轻轻混匀，然后10000r/min离心5min；取上清液，加入两倍体积的无水乙醇，轻轻混匀，室温放置5min；12000r/min离心10min，将沉淀溶解在100μL TE中；加入等体积的酚-氯仿-异戊醇(体积比25:24:1)，轻柔颠倒混匀，12000r/min离心5min，重复抽提1次；加1/10体积的3mol/L醋酸钠(pH5.2)，2.5倍体积的无水乙醇，－20℃放置30min；10000r/min离心5min，弃上清液，用70%乙醇溶液洗涤沉淀两次，室温干燥后用20μL TE溶解；加入0.5μL 10mg/mL的RNaseA，37℃温浴30min，自然冷却后保存。

方法五：

溶解在100μL TE中；加入等体积的酚-氯仿-异戊醇(体积比25:24:1)，轻柔颠倒混匀，12000r/min离心5min，重复抽提1次；加1/10体积的3mol/L醋酸钠(pH5.2)，2.5倍体积的无水乙醇，－20℃放置30min；10000r/min离心5min，弃上清液，用70%乙醇溶液洗涤沉淀两次，室温干燥后用20μL TE溶解；加入0.5μL 10mg/mL的RNaseA，37℃温浴30min，自然冷却后保存。

方法六：

1、配一个破菌缓冲液：

Triton X-100 2%（v/v）SDS 1%（w/v）

NaCl 100mM Tris-HCl（pH 8.0）10mM

2、把酵母细胞离心收集，加200ul的石英砂或玻璃珠，加入200μl的破菌液再加200μl的酚氯仿，涡旋一分钟，放在冰上一分钟，一共反复4次

3、加入500μl的ddH2O，涡旋，离心，抽上清和等体积的酚氯仿混合

4、涡旋，离心，抽上清和等体积的酚氯仿混合，重复4直到离心后两层之间没有蛋白出现

5、抽上清加1ml的无水乙醇，放在-20度30min

6、离心，抽上清，再用70%乙醇洗一次，真空干燥，用TE或ddH20溶解

方法七：

接种酵母到2.5ml 酵母试管培养基中(YPD培养基)，30℃，培养16～18h；取1.5ml 酵母培养液，室温下，1500 × g 离心5～10min 收集菌体；菌体用灭菌水洗1 次，1500 ×g 离心5min；菌体用200μl SCED(1mol/L 山梨醇、10mmol/L 柠檬酸钠、10mmol/LEDTA、10mmol/L DTT 二硫苏糖醇)溶液重悬，加入3 0μl 10mg/ml 溶菌酶(Lysozyme)37℃温浴1h；加入100μl 2%SDS 混匀，-20℃冰冻，然后室温震荡溶解，反复3 次；向悬浮液中加入150μl 5mol/L KAc(pH 8.9)轻轻混匀，然后10000r/min 离心5min；将上清转移到一新的1.5ml 离心管中，加入 2 倍体积的乙醇，轻轻混匀，室温放置5min 后12000r/min 离心10min；除去上清，将沉淀溶解在300μl TE(10mmol/L Tris-HCl，pH7.4，1mmol/L EDTA，pH8.0) 中，加入6μl RNase (10mg/ml)，37℃温浴30min；加入饱和酚和氯仿各150μl 充分混匀，然后10000r/min 离心5min；转移上清到新的1.5ml 离心管中，加入1/2体积的7.5mol/L NH4Ac(pH7.5)和等体积的异丙醇，-20℃放置20min 后12000r/min 离心10min；除去上清，加入300μl 70% 乙醇漂洗沉淀一次，10000r/min离心5min；风干除去乙醇，用2 0μl TE 溶解酵母DNA。