大量Pichiapastoris酵母基因组DNA的提取
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Key words： Pichia pastoris Genome DNA Snail enzyme method Glass bead method Improved glass bead method
巴斯德毕赤酵母表达系统是目前应用最广泛的 外源基因表达系统之一。近年来已有 600 多种外源 蛋白在该 表 达 系 统 中 获 得 表 达［1］。 毕 赤 酵 母 表 达 系统中外源目的基因能够稳定表达，必须整合到酵 母染色体中。为了确保能够正确表达，首 先 要 确 认 外源基因是否正确 插 入，必 须 对 酵 母 重 组 子 染 色 体 DNA 进行 鉴 定 和 筛 选，提 取 高 质 量 的 酵 母 基 因组 DNA［2］。酵母基因组 DNA 制备比大肠杆菌 难 度 大，原 因 是 由 于 酵 母 细 胞 壁 难 于 破 坏，酵 母 基因组 DNA 不 能 很 好 地 释 放 出 来［3 － 5］。 制 备 的 酵母基因组 DNA 作为模板进行 PCR 等常规方法 时，如果基因组 DNA 的 质 量 要 求 不 高，很 可 能 出 现假阳性或假阴性 的 现 象，极 大 地 影 响 了 鉴 定 可 靠性及和筛选 进 度。另 外，在 进 行 Southern 杂 交 等试验时需要至少 10 μg 高质量的基 因 组 DNA
·研究报告·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN
2011 年第 4 期
大量 Pichia pastoris 酵母基因组 DNA 的提取
刘晓志 高健 韩柱 王志明 陈伟斌
（ 华北制药集团新药研究开发有限责任公司 抗体药物研制国家重点实验室，石家庄 050015）
摘 要： 巴斯德毕赤酵母（ Pichia pastoris） 表达系统是目前应用最广泛的外源基因表达系统之一，提取酵母基因组是研 究酵母必需的方法之一。针对常用的几种毕赤酵母基因组 DNA 的制备方法进行比较，并对玻璃珠法进行改进。改良的玻璃 珠法不但具有省时省力、操作简便且结果稳定的优点，适合于大量 DNA 的提取。该方法的革新将对酵母重组子的 PCR 鉴定 检测及表达产品 DNA 相关检测提供更高效稳定的保证，将成为酵母等类似微生物基因组 DNA 制备的首选方法。
本研究将两种方法结合，旨在使得毕赤酵母基 因组 DNA 的提取变得快速、简便，提取的 DNA 质量 及稳定性也较其他方法具有明显优势。本试验利用
收稿日期： 2010-10-15 基金项目： 国家“十一五”重大新药创制项目（ 2009ZX09102） 作者简介： 刘晓志，男，博士，研究方向： 生物药物的质量研究及质量控制； E-mail： liuxiaozhi666@ 163． com
加入 4 mg / mL RNA 酶 1 μL，37℃ 放置 3 h。加入 等体积的氯仿 / 异戊醇（ 24∶ 1） ，抽提 1 次，再加入 1 / 10 体积的 3 mmol / L 醋酸钠溶液和两倍体积预冷无 水乙醇沉淀回收。加 1 mL 灭菌水溶解，4℃ 过夜。经 紫外分光光度计和电泳对其含量和纯度进行检测。 1. 2. 4 玻璃珠提取法 菌体加入裂解液 2 mL（ 2% TritonX-100，1% SDS，100 mmol / L NaCl，10 mmol / L Tris-HCl，1 mmol / L EDTA） ，酚∶ 氯仿∶ 异戊醇（ 25 ∶ 24∶ 1） 2 mL，0. 1g 玻璃珠，利用振荡器剧烈充分震荡 10 min 以上。10 000 r / min 离心 15 min，取上清加 入1 /10体积的 3 mmol / L 醋酸钠溶液，再加两倍体积 入预冷无水乙醇，充分混合。13 000 r / min 离心 15 min，用 1 /2 离心管体积的 70% 乙醇溶液洗涤沉淀 1 次，13 000 r / min 离心 10 min，吸弃上清。37℃ 放置 15 min，加 1 mL 灭菌水溶解［7］。
加入 4 mg / mL RNA 酶 1 μL，37℃ 放置 3 h。加 入等体积的氯仿 / 异戊醇（ 24 ∶ 1） ，抽提 1 次，再加入 1 /10 体积的 3 mmol / L 醋酸钠溶液和两倍体积预冷 无水乙醇沉淀回收。加 1 mL 灭菌水溶解，4℃ 过夜。 经紫外分光光度计和电泳对其含量和纯度进行检测。 1. 2. 3 蜗牛酶 提 取 法 菌 体 用 2 mL 2% 蜗 牛 酶 30℃ 消化 1 h（ 2% 蜗牛酶用原生质体缓冲液配置， 原生质体缓冲液的配置 1 mol / L 山梨醇，0. 02 mol / L 柠檬酸 pH5. 8，配 制 经 0. 22 μm 微 孔 滤 膜 过 滤 除 菌） 。加入 2 mL NDS 缓冲液： 0. 01 mol / L Tris-HCl， pH9. 5 0. 5 mol / L EDTA，pH8. 0 1% SDS （ Sigma 公 司） ，2 mg / mL Pk，37℃ 水浴 1 h； 加入饱和酚和氯仿 各 2 mL 充分混匀，10 000 r / min 离心 10 min； 取上
加入 4 mg / mL RNA 酶 1 μL，37℃ 放置 3 h。加入 等体积的氯仿 / 异戊醇（ 24∶ 1） ，抽提 1 次，再加入1 /10 体积的 3 mmol / L 醋酸钠溶液和两倍体积预冷无水乙 醇沉淀回收。加 1 mL 灭菌水溶解，4℃ 过夜。经紫外 分光光度计和电泳对其含量和纯度进行检测。 1. 2. 5 改良玻璃珠提取法 菌体加入裂解液 2 mL （ 2% TritonX-100，1% SDS，100 mmol / L NaCl，10 mmol / L Tris-HCl，1 mmol / L EDTA） ，加入 0. 1 g 玻璃 珠 利 用 振 荡 器 剧 烈 充 分 震 荡 10 min 以 上， 10 000 r / min离心 15 min，吸弃上清，加入 2 mL NDS 缓冲液： 0. 01 mol / L Tris-HCl，0. 5 mol / L EDTA，1% SDS，2 mg / mL Pk，37℃ 水浴 1 h； 加入酚∶ 氯仿∶ 异戊 醇（ 25∶ 24∶ 1） 2 mL，震荡混匀，10 000 r / min 离心 10 min。取上清加入 1 /10 体积的 3 mmol / L 醋酸钠溶 液，再 加 两 倍 体 积 入 预 冷 无 水 乙 醇，充 分 混 合。 13 000 r / min离心 15 min，用 1 /2 离心管体积的 70% 乙醇溶液洗涤沉淀 1 次，13 000 r / min 离心10 min，吸 弃上清。37℃ 放置 15 min，加 1 mL 灭菌水溶解。
用于酶切 消 化，这 就 对 酵 母 基 因 组 DNA 的 提 取 技术提出了挑战。
毕赤酵母拥有较厚实的细胞壁，因此对于基因 组 DNA 提取的主要问题就集中在如何高效破坏细 胞壁。毕赤酵母的细胞壁厚约 25 nm，约占细胞干 质量的 30% ，并且具有坚韧的结构。它的结构分 3 层，外层是甘露聚搪，内层为葡聚糖，均是具有复杂 结构的分 枝 状 聚 合 物，中 间 层 含 有 丰 富 的 蛋 白 质。 传统破坏细胞壁的做法大致可以分为两类： 酶法和 机械法。酶法包括使用 Zymolyase、蜗牛酶和蛋白酶 K 等； 机械法包括超声波破碎法、液氮研磨法和玻璃 珠法等，各种方法都存在一定的缺点。
168
生物技术通报 Biotechnology Bulletin
2011 年第 4 期
试剂盒、蜗牛法酶法、玻璃珠法和改良玻璃珠法提取 酵母基因组 DNA，每种方法都经过 3 次重复试验， 提纯样品经紫外分光光度计和电泳检测，并考察各 种方法提取 DNA 的稳定性。
1 材料与方法
1. 1 材料 1. 1. 1 菌种 巴斯德毕赤酵母 X-33 菌种由本研究 室保存。 1. 1. 2 主要试剂 Multi-Copy Pichia Expression Kit （ Invitrogen） ； 玻璃珠（ Sigma-G8772） ； 蛋白酶 K（ Merck） ，蜗牛酶，其他试剂为国产分析纯。 1. 2 方法 1. 2. 1 酵母培养 将巴斯德毕赤酵母 X-33 菌种接 种于 100 mL YPD 培养基中，30℃ ，震荡培养 48 h； 取 10 mL 酵母菌液离心去上清，用去离子水洗 1 次， 用残余的液体重悬沉淀［6］。 1. 2. 2 试剂盒提取法 菌体用 2 mL SCED（ 1 mol / L 山梨醇、10 mmol / L 柠檬酸钠、10 mmol / L EDTA、10 mmol / L DTT 二硫苏糖醇） 溶液重悬，加入 0. 1 － 0. 3 mg Zymolyase 溶菌酶 37℃ 水浴 1 h； 加入 1% SDS 2 mL 冰浴 5 min，加入饱和酚和氯仿各 2 mL 充分混 匀，10 000 r / min 离心 10 min； 取上清加入 1 /10 体积 的 3 mmol / L 醋酸钠溶液，再加两倍体积入预冷无水 乙醇，充分混合。13 000 r / min 离心 15 min，用 1 /2 离心管体积的 70% 乙醇溶液洗涤沉淀 1 次，13 000 r / min 离心 10 min，吸弃上清。37℃ 放置 15 min，加 1 mL 灭菌水溶解。
Abstract： Pichia pastoris expression system that has been widely used for expressing foreign protein． The refore，has drawn growing attention to develop methods for extracting yeast genome． In this paper，several kinds of yeast genomic DNA preparation methods were compared，and the glass bead method was improved，which not only saves time but also can be operated easily with satisfactory results of large number of DNA extraction． This approach could be used as the genome DNA preparation method for yeast and other microbial．
清加入 1 /10 体积的 3 mmol / L 醋酸钠溶液，再加两 倍体积入预冷无水乙醇，充分混合。13 000 r / min 离心 15 min，用 1 /2 离心管体积的 70% 乙醇溶液洗 涤沉淀一次，13 000 r / min 离心 10 min，吸弃上清。 37℃ 放置 15 min，加 1 mL 灭菌水溶解。
关键词： Pichia pastoris 酵母 基因组 蜗牛酶法 玻璃珠法 改良玻璃珠法
DNA Extraction for Large GΒιβλιοθήκη Baidunome of Pichia pastoris
Liu Xiaozhi Gao Jian Han Zhu Wang Zhiming Chen Weibin
（ New Drug Research and Development Co． ，Ltd． of North China Pharmaceutical Corporation， State Key Laboratory of Antibody Drug Development，Shijiazhuang 050015）
加入 4 mg / mL RNA 酶 1 μL，37℃ 放置 3 h。加入 等体积的氯仿 / 异戊醇（ 24∶ 1） ，抽提 1 次，再加入1 /10
2011 年第 4 期
巴斯德毕赤酵母表达系统是目前应用最广泛的 外源基因表达系统之一。近年来已有 600 多种外源 蛋白在该 表 达 系 统 中 获 得 表 达［1］。 毕 赤 酵 母 表 达 系统中外源目的基因能够稳定表达，必须整合到酵 母染色体中。为了确保能够正确表达，首 先 要 确 认 外源基因是否正确 插 入，必 须 对 酵 母 重 组 子 染 色 体 DNA 进行 鉴 定 和 筛 选，提 取 高 质 量 的 酵 母 基 因组 DNA［2］。酵母基因组 DNA 制备比大肠杆菌 难 度 大，原 因 是 由 于 酵 母 细 胞 壁 难 于 破 坏，酵 母 基因组 DNA 不 能 很 好 地 释 放 出 来［3 － 5］。 制 备 的 酵母基因组 DNA 作为模板进行 PCR 等常规方法 时，如果基因组 DNA 的 质 量 要 求 不 高，很 可 能 出 现假阳性或假阴性 的 现 象，极 大 地 影 响 了 鉴 定 可 靠性及和筛选 进 度。另 外，在 进 行 Southern 杂 交 等试验时需要至少 10 μg 高质量的基 因 组 DNA
·研究报告·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN
2011 年第 4 期
大量 Pichia pastoris 酵母基因组 DNA 的提取
刘晓志 高健 韩柱 王志明 陈伟斌
（ 华北制药集团新药研究开发有限责任公司 抗体药物研制国家重点实验室，石家庄 050015）
摘 要： 巴斯德毕赤酵母（ Pichia pastoris） 表达系统是目前应用最广泛的外源基因表达系统之一，提取酵母基因组是研 究酵母必需的方法之一。针对常用的几种毕赤酵母基因组 DNA 的制备方法进行比较，并对玻璃珠法进行改进。改良的玻璃 珠法不但具有省时省力、操作简便且结果稳定的优点，适合于大量 DNA 的提取。该方法的革新将对酵母重组子的 PCR 鉴定 检测及表达产品 DNA 相关检测提供更高效稳定的保证，将成为酵母等类似微生物基因组 DNA 制备的首选方法。
本研究将两种方法结合，旨在使得毕赤酵母基 因组 DNA 的提取变得快速、简便，提取的 DNA 质量 及稳定性也较其他方法具有明显优势。本试验利用
收稿日期： 2010-10-15 基金项目： 国家“十一五”重大新药创制项目（ 2009ZX09102） 作者简介： 刘晓志，男，博士，研究方向： 生物药物的质量研究及质量控制； E-mail： liuxiaozhi666@ 163． com
加入 4 mg / mL RNA 酶 1 μL，37℃ 放置 3 h。加入 等体积的氯仿 / 异戊醇（ 24∶ 1） ，抽提 1 次，再加入 1 / 10 体积的 3 mmol / L 醋酸钠溶液和两倍体积预冷无 水乙醇沉淀回收。加 1 mL 灭菌水溶解，4℃ 过夜。经 紫外分光光度计和电泳对其含量和纯度进行检测。 1. 2. 4 玻璃珠提取法 菌体加入裂解液 2 mL（ 2% TritonX-100，1% SDS，100 mmol / L NaCl，10 mmol / L Tris-HCl，1 mmol / L EDTA） ，酚∶ 氯仿∶ 异戊醇（ 25 ∶ 24∶ 1） 2 mL，0. 1g 玻璃珠，利用振荡器剧烈充分震荡 10 min 以上。10 000 r / min 离心 15 min，取上清加 入1 /10体积的 3 mmol / L 醋酸钠溶液，再加两倍体积 入预冷无水乙醇，充分混合。13 000 r / min 离心 15 min，用 1 /2 离心管体积的 70% 乙醇溶液洗涤沉淀 1 次，13 000 r / min 离心 10 min，吸弃上清。37℃ 放置 15 min，加 1 mL 灭菌水溶解［7］。
加入 4 mg / mL RNA 酶 1 μL，37℃ 放置 3 h。加 入等体积的氯仿 / 异戊醇（ 24 ∶ 1） ，抽提 1 次，再加入 1 /10 体积的 3 mmol / L 醋酸钠溶液和两倍体积预冷 无水乙醇沉淀回收。加 1 mL 灭菌水溶解，4℃ 过夜。 经紫外分光光度计和电泳对其含量和纯度进行检测。 1. 2. 3 蜗牛酶 提 取 法 菌 体 用 2 mL 2% 蜗 牛 酶 30℃ 消化 1 h（ 2% 蜗牛酶用原生质体缓冲液配置， 原生质体缓冲液的配置 1 mol / L 山梨醇，0. 02 mol / L 柠檬酸 pH5. 8，配 制 经 0. 22 μm 微 孔 滤 膜 过 滤 除 菌） 。加入 2 mL NDS 缓冲液： 0. 01 mol / L Tris-HCl， pH9. 5 0. 5 mol / L EDTA，pH8. 0 1% SDS （ Sigma 公 司） ，2 mg / mL Pk，37℃ 水浴 1 h； 加入饱和酚和氯仿 各 2 mL 充分混匀，10 000 r / min 离心 10 min； 取上
加入 4 mg / mL RNA 酶 1 μL，37℃ 放置 3 h。加入 等体积的氯仿 / 异戊醇（ 24∶ 1） ，抽提 1 次，再加入1 /10 体积的 3 mmol / L 醋酸钠溶液和两倍体积预冷无水乙 醇沉淀回收。加 1 mL 灭菌水溶解，4℃ 过夜。经紫外 分光光度计和电泳对其含量和纯度进行检测。 1. 2. 5 改良玻璃珠提取法 菌体加入裂解液 2 mL （ 2% TritonX-100，1% SDS，100 mmol / L NaCl，10 mmol / L Tris-HCl，1 mmol / L EDTA） ，加入 0. 1 g 玻璃 珠 利 用 振 荡 器 剧 烈 充 分 震 荡 10 min 以 上， 10 000 r / min离心 15 min，吸弃上清，加入 2 mL NDS 缓冲液： 0. 01 mol / L Tris-HCl，0. 5 mol / L EDTA，1% SDS，2 mg / mL Pk，37℃ 水浴 1 h； 加入酚∶ 氯仿∶ 异戊 醇（ 25∶ 24∶ 1） 2 mL，震荡混匀，10 000 r / min 离心 10 min。取上清加入 1 /10 体积的 3 mmol / L 醋酸钠溶 液，再 加 两 倍 体 积 入 预 冷 无 水 乙 醇，充 分 混 合。 13 000 r / min离心 15 min，用 1 /2 离心管体积的 70% 乙醇溶液洗涤沉淀 1 次，13 000 r / min 离心10 min，吸 弃上清。37℃ 放置 15 min，加 1 mL 灭菌水溶解。
用于酶切 消 化，这 就 对 酵 母 基 因 组 DNA 的 提 取 技术提出了挑战。
毕赤酵母拥有较厚实的细胞壁，因此对于基因 组 DNA 提取的主要问题就集中在如何高效破坏细 胞壁。毕赤酵母的细胞壁厚约 25 nm，约占细胞干 质量的 30% ，并且具有坚韧的结构。它的结构分 3 层，外层是甘露聚搪，内层为葡聚糖，均是具有复杂 结构的分 枝 状 聚 合 物，中 间 层 含 有 丰 富 的 蛋 白 质。 传统破坏细胞壁的做法大致可以分为两类： 酶法和 机械法。酶法包括使用 Zymolyase、蜗牛酶和蛋白酶 K 等； 机械法包括超声波破碎法、液氮研磨法和玻璃 珠法等，各种方法都存在一定的缺点。
168
生物技术通报 Biotechnology Bulletin
2011 年第 4 期
试剂盒、蜗牛法酶法、玻璃珠法和改良玻璃珠法提取 酵母基因组 DNA，每种方法都经过 3 次重复试验， 提纯样品经紫外分光光度计和电泳检测，并考察各 种方法提取 DNA 的稳定性。
1 材料与方法
1. 1 材料 1. 1. 1 菌种 巴斯德毕赤酵母 X-33 菌种由本研究 室保存。 1. 1. 2 主要试剂 Multi-Copy Pichia Expression Kit （ Invitrogen） ； 玻璃珠（ Sigma-G8772） ； 蛋白酶 K（ Merck） ，蜗牛酶，其他试剂为国产分析纯。 1. 2 方法 1. 2. 1 酵母培养 将巴斯德毕赤酵母 X-33 菌种接 种于 100 mL YPD 培养基中，30℃ ，震荡培养 48 h； 取 10 mL 酵母菌液离心去上清，用去离子水洗 1 次， 用残余的液体重悬沉淀［6］。 1. 2. 2 试剂盒提取法 菌体用 2 mL SCED（ 1 mol / L 山梨醇、10 mmol / L 柠檬酸钠、10 mmol / L EDTA、10 mmol / L DTT 二硫苏糖醇） 溶液重悬，加入 0. 1 － 0. 3 mg Zymolyase 溶菌酶 37℃ 水浴 1 h； 加入 1% SDS 2 mL 冰浴 5 min，加入饱和酚和氯仿各 2 mL 充分混 匀，10 000 r / min 离心 10 min； 取上清加入 1 /10 体积 的 3 mmol / L 醋酸钠溶液，再加两倍体积入预冷无水 乙醇，充分混合。13 000 r / min 离心 15 min，用 1 /2 离心管体积的 70% 乙醇溶液洗涤沉淀 1 次，13 000 r / min 离心 10 min，吸弃上清。37℃ 放置 15 min，加 1 mL 灭菌水溶解。
Abstract： Pichia pastoris expression system that has been widely used for expressing foreign protein． The refore，has drawn growing attention to develop methods for extracting yeast genome． In this paper，several kinds of yeast genomic DNA preparation methods were compared，and the glass bead method was improved，which not only saves time but also can be operated easily with satisfactory results of large number of DNA extraction． This approach could be used as the genome DNA preparation method for yeast and other microbial．
清加入 1 /10 体积的 3 mmol / L 醋酸钠溶液，再加两 倍体积入预冷无水乙醇，充分混合。13 000 r / min 离心 15 min，用 1 /2 离心管体积的 70% 乙醇溶液洗 涤沉淀一次，13 000 r / min 离心 10 min，吸弃上清。 37℃ 放置 15 min，加 1 mL 灭菌水溶解。
关键词： Pichia pastoris 酵母 基因组 蜗牛酶法 玻璃珠法 改良玻璃珠法
DNA Extraction for Large GΒιβλιοθήκη Baidunome of Pichia pastoris
Liu Xiaozhi Gao Jian Han Zhu Wang Zhiming Chen Weibin
（ New Drug Research and Development Co． ，Ltd． of North China Pharmaceutical Corporation， State Key Laboratory of Antibody Drug Development，Shijiazhuang 050015）
加入 4 mg / mL RNA 酶 1 μL，37℃ 放置 3 h。加入 等体积的氯仿 / 异戊醇（ 24∶ 1） ，抽提 1 次，再加入1 /10
2011 年第 4 期