8外周血单个核细胞分离
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数200 个以上的淋巴细 胞中花环形成细 胞的百分数。 胞的百分数。 凡能结合三个以 SRBC者为花环 上SRBC者为花环 形成细胞。 形成细胞。 正常值：60正常值：60-80%
淋巴细胞功能检测 淋巴细胞转化试验
原理
指体外培养的淋巴细胞与特异性抗原或非特异性 促有丝分裂物质如植物血凝素（PHA）等接触后 发生胚变（或返祖）现象，转化为淋巴母细胞的 一种方法。 淋巴细胞在抗原或促有丝分裂原的刺激下淋巴细 胞的DNA合成而分裂增殖，并在细胞形态上也向 母细胞转化，因此通过形态学观察或同位素掺入 法可测得细胞分裂增殖的程度，从而判断淋巴细 胞对有关刺激物的反应及其功能，以此了解机体 的细胞免疫状态。
水平离心
血小板
1500r 20min
⒈ 简述补体的概念、分泌细胞及激活途径。 ⒉ 简述补体的经典激活途径的具体过程。 ⒊ 补体结合反应为什么需分两阶段进行？如果将 几种成分反应顺序颠倒，结果会如何？ ⒋ 参加补体结合反应的各已知成分，为什么须预 先滴定？试验中所设计的四种对照管有何意义？
用毛细吸管轻轻插入灰白色层， 用毛细吸管轻轻插入灰白色层，沿管壁轻轻吸出 该层的单个核细胞，盛入另一支离心管中。 该层的单个核细胞，盛入另一支离心管中。 将 所 得 到 的 PBMC 悬 液 用 5 倍 体 积 的 Hanks 液 或 RPMI- 640洗涤3 min。 RPMI-l640洗涤3次，1500 rpm 5min。 洗涤 次洗涤后加入2 Hanks液重悬细胞 液重悬细胞， 50ul 第2次洗涤后加入2ml Hanks液重悬细胞，取50ul 50ul胎盼蓝于离心管中混匀，室温染色3分钟， ul胎盼蓝于离心管中混匀 加50ul胎盼蓝于离心管中混匀，室温染色3分钟， 取少量染色细胞， 用血细胞计数板进行计数， 取少量染色细胞 ， 用血细胞计数板进行计数 ， 剩 余细胞进行离心洗涤
计数200个细胞，一般活性应在95％以上 计数200个细胞，一般活性应在95％ 200个细胞 95
注意事项
与血液样品接触时应注意安全防护， 1. 与血液样品接触时应注意安全防护 ， 避免血源 性传染病传染。 性传染病传染。 操作应轻柔， 细胞悬液应充分混匀， 2. 操作应轻柔 ， 细胞悬液应充分混匀 ， 避免损伤 细胞活性及细胞丢失。 细胞活性及细胞丢失。 3.细胞分层液在室温下比重为 l.077±0.001g/L； 细胞分层液在室温下比重为l 077± 001g/L g/L； 应避光4 下保存， 应避光 4 ℃ 下保存 ， 取出后逐渐升至室温后混 方可使用。使用中应避免细菌污染。 匀，方可使用。使用中应避免细菌污染。 稀释血液可降低红细胞的凝集， 4. 稀释血液可降低红细胞的凝集 ， 提高淋巴细胞 收获量， 收获量 ， 但如果要保留血浆成分作其他实验用 则不能稀释血液，以免影响血浆成分。 时，则不能稀释血液，以免影响血浆成分。
人血液中各种细胞的密度如下： 人血液中各种细胞的密度如下： 红细胞： 红细胞：1.093 白细胞： 白细胞：1.092 淋巴细胞和单核细胞：1.075淋巴细胞和单核细胞：1.075-1.090 血小板：1.030-1.035 血小板：1.030-
F/H = 1.077±0.001 1.077±
肝素抗凝全血1.5ml+等量Hanks液
E玫瑰花环试验
Erythrocyte rosette formation test
原理
T淋巴细胞表面有绵羊红细胞受体（CD2），不 淋巴细胞表面有绵羊红细胞受体（CD2），不 表面有绵羊红细胞受体 ）， 需要任何处理可与绵羊红细胞结合形成花环， 需要任何处理可与绵羊红细胞结合形成花环， B淋巴细胞和巨噬细胞无绵羊红细胞受体，因 淋巴细胞和巨噬细胞无绵羊红细胞受体， 此形成E花环的细胞主要是T淋巴细胞。 此形成E花环的细胞主要是T淋巴细胞。 计算外周血中E花环形成细胞的百分率，可从 计算外周血中E花环形成细胞的百分率， 数量大致推测机体的细胞免疫状态。 数量大致推测机体的细胞免疫状态。
将F/H管稍倾斜 F/H管稍倾斜 将稀释血液在距分层液界面上1 将稀释血液在距分层液界面上1 cm 处沿试管壁缓慢加至分层液上面。 处沿试管壁缓慢加至分层液上面。 应注意保持两界面清晰， 应注意保持两界面清晰，勿使血液 混入分层液内。 混入分层液内。
Ficoll/Hypaque (2:1)
1500rpm, 20 min
转化的淋巴细胞
未转化的淋巴细胞
计数细胞, 加入FCS-Hanks调整最终细胞浓度为 2×106 计数细胞, 加入FCS-Hanks调整最终细胞浓度为 FCS
细 胞 计 数 板
淋巴细胞浓度（细胞数/ml） 四个大方格内细胞数/4× 淋巴细胞浓度（细胞数/ml）=四个大方格内细胞数/4×104 /ml /4
台盼蓝染色测定细胞存活率
原理
T cells
SRBC
E- rosette
方法
取上述FCS-Hanks调整最终细胞浓度为 取上述FCS-Hanks调整最终细胞浓度为 2×106 FCS 的细胞悬液0.2ml 加入0.2ml0.5% 0.2ml， 0.2ml0.5%的绵羊红细 的细胞悬液0.2ml，加入0.2ml0.5%的绵羊红细 混匀后放37℃水浴10 37℃水浴10分钟 胞，混匀后放37℃水浴10分钟 1000rpm,水平离心5min 1000rpm,水平离心5min 水平离心 用毛细吸管弃上清，轻轻转动悬浮细胞， 用毛细吸管弃上清，轻轻转动悬浮细胞，加2 滴美兰染液， 滴美兰染液，轻摇 取上述细胞悬液1滴于洁净载玻片桑， 取上述细胞悬液1滴于洁净载玻片桑，盖上盖 玻片，高倍镜/ 玻片，高倍镜/油镜下观察
外周血单个核细胞的分离及 活力测定和E 活力测定和E玫瑰花环试验
Isolation and storage of PBMC and viability test & Erythrocyte rosette formation test
实验原理
人外周血单个核细胞（ 人外周血单个核细胞 （ peripheral blood cell， PBMC） mononuclear cell ， PBMC ） 包括淋巴细胞 和单核细胞。 和单核细胞。 单个核细胞的体积、 单个核细胞的体积 、 形态和比重与外周血 其他细胞不同。 因此利用一种介于1 075其他细胞不同 。 因此利用一种介于 1.075ficoll1.090 之间的聚蔗糖 - 泛影葡胺 （ ficollhypaque）分离液作密度梯度离心， hypaque）分离液作密度梯度离心，离心后 不同比重的血细胞在分离液中呈梯度分布, 不同比重的血细胞在分离液中呈梯度分布, 从而分离出PBMC PBMC。 从而分离出PBMC。
台盼蓝（ blue） 台盼蓝（trypan blue）染色法是测定细胞活力的 最简便的方法。 最简便的方法。 台盼蓝又称锥蓝，是一种阴离子型染料， 台盼蓝又称锥蓝，是一种阴离子型染料，它不能透 过活细胞正常完整的细胞膜， 活细胞不着色， 过活细胞正常完整的细胞膜，故活细胞不着色， 但死亡细胞的细胞膜通透性增加， 但死亡细胞的细胞膜通透性增加，可使染料通过 细胞膜进入细胞内， 死细胞着色呈蓝色。 细胞膜进入细胞内，使死细胞着色呈蓝色。 细胞存活率(%)＝无色细胞数/细胞总数× 细胞存活率(%)＝无色细胞数/细胞总数×100% (%)
淋巴细胞功能检测 淋巴细胞转化试验
原理
指体外培养的淋巴细胞与特异性抗原或非特异性 促有丝分裂物质如植物血凝素（PHA）等接触后 发生胚变（或返祖）现象，转化为淋巴母细胞的 一种方法。 淋巴细胞在抗原或促有丝分裂原的刺激下淋巴细 胞的DNA合成而分裂增殖，并在细胞形态上也向 母细胞转化，因此通过形态学观察或同位素掺入 法可测得细胞分裂增殖的程度，从而判断淋巴细 胞对有关刺激物的反应及其功能，以此了解机体 的细胞免疫状态。
水平离心
血小板
1500r 20min
⒈ 简述补体的概念、分泌细胞及激活途径。 ⒉ 简述补体的经典激活途径的具体过程。 ⒊ 补体结合反应为什么需分两阶段进行？如果将 几种成分反应顺序颠倒，结果会如何？ ⒋ 参加补体结合反应的各已知成分，为什么须预 先滴定？试验中所设计的四种对照管有何意义？
用毛细吸管轻轻插入灰白色层， 用毛细吸管轻轻插入灰白色层，沿管壁轻轻吸出 该层的单个核细胞，盛入另一支离心管中。 该层的单个核细胞，盛入另一支离心管中。 将 所 得 到 的 PBMC 悬 液 用 5 倍 体 积 的 Hanks 液 或 RPMI- 640洗涤3 min。 RPMI-l640洗涤3次，1500 rpm 5min。 洗涤 次洗涤后加入2 Hanks液重悬细胞 液重悬细胞， 50ul 第2次洗涤后加入2ml Hanks液重悬细胞，取50ul 50ul胎盼蓝于离心管中混匀，室温染色3分钟， ul胎盼蓝于离心管中混匀 加50ul胎盼蓝于离心管中混匀，室温染色3分钟， 取少量染色细胞， 用血细胞计数板进行计数， 取少量染色细胞 ， 用血细胞计数板进行计数 ， 剩 余细胞进行离心洗涤
计数200个细胞，一般活性应在95％以上 计数200个细胞，一般活性应在95％ 200个细胞 95
注意事项
与血液样品接触时应注意安全防护， 1. 与血液样品接触时应注意安全防护 ， 避免血源 性传染病传染。 性传染病传染。 操作应轻柔， 细胞悬液应充分混匀， 2. 操作应轻柔 ， 细胞悬液应充分混匀 ， 避免损伤 细胞活性及细胞丢失。 细胞活性及细胞丢失。 3.细胞分层液在室温下比重为 l.077±0.001g/L； 细胞分层液在室温下比重为l 077± 001g/L g/L； 应避光4 下保存， 应避光 4 ℃ 下保存 ， 取出后逐渐升至室温后混 方可使用。使用中应避免细菌污染。 匀，方可使用。使用中应避免细菌污染。 稀释血液可降低红细胞的凝集， 4. 稀释血液可降低红细胞的凝集 ， 提高淋巴细胞 收获量， 收获量 ， 但如果要保留血浆成分作其他实验用 则不能稀释血液，以免影响血浆成分。 时，则不能稀释血液，以免影响血浆成分。
人血液中各种细胞的密度如下： 人血液中各种细胞的密度如下： 红细胞： 红细胞：1.093 白细胞： 白细胞：1.092 淋巴细胞和单核细胞：1.075淋巴细胞和单核细胞：1.075-1.090 血小板：1.030-1.035 血小板：1.030-
F/H = 1.077±0.001 1.077±
肝素抗凝全血1.5ml+等量Hanks液
E玫瑰花环试验
Erythrocyte rosette formation test
原理
T淋巴细胞表面有绵羊红细胞受体（CD2），不 淋巴细胞表面有绵羊红细胞受体（CD2），不 表面有绵羊红细胞受体 ）， 需要任何处理可与绵羊红细胞结合形成花环， 需要任何处理可与绵羊红细胞结合形成花环， B淋巴细胞和巨噬细胞无绵羊红细胞受体，因 淋巴细胞和巨噬细胞无绵羊红细胞受体， 此形成E花环的细胞主要是T淋巴细胞。 此形成E花环的细胞主要是T淋巴细胞。 计算外周血中E花环形成细胞的百分率，可从 计算外周血中E花环形成细胞的百分率， 数量大致推测机体的细胞免疫状态。 数量大致推测机体的细胞免疫状态。
将F/H管稍倾斜 F/H管稍倾斜 将稀释血液在距分层液界面上1 将稀释血液在距分层液界面上1 cm 处沿试管壁缓慢加至分层液上面。 处沿试管壁缓慢加至分层液上面。 应注意保持两界面清晰， 应注意保持两界面清晰，勿使血液 混入分层液内。 混入分层液内。
Ficoll/Hypaque (2:1)
1500rpm, 20 min
转化的淋巴细胞
未转化的淋巴细胞
计数细胞, 加入FCS-Hanks调整最终细胞浓度为 2×106 计数细胞, 加入FCS-Hanks调整最终细胞浓度为 FCS
细 胞 计 数 板
淋巴细胞浓度（细胞数/ml） 四个大方格内细胞数/4× 淋巴细胞浓度（细胞数/ml）=四个大方格内细胞数/4×104 /ml /4
台盼蓝染色测定细胞存活率
原理
T cells
SRBC
E- rosette
方法
取上述FCS-Hanks调整最终细胞浓度为 取上述FCS-Hanks调整最终细胞浓度为 2×106 FCS 的细胞悬液0.2ml 加入0.2ml0.5% 0.2ml， 0.2ml0.5%的绵羊红细 的细胞悬液0.2ml，加入0.2ml0.5%的绵羊红细 混匀后放37℃水浴10 37℃水浴10分钟 胞，混匀后放37℃水浴10分钟 1000rpm,水平离心5min 1000rpm,水平离心5min 水平离心 用毛细吸管弃上清，轻轻转动悬浮细胞， 用毛细吸管弃上清，轻轻转动悬浮细胞，加2 滴美兰染液， 滴美兰染液，轻摇 取上述细胞悬液1滴于洁净载玻片桑， 取上述细胞悬液1滴于洁净载玻片桑，盖上盖 玻片，高倍镜/ 玻片，高倍镜/油镜下观察
外周血单个核细胞的分离及 活力测定和E 活力测定和E玫瑰花环试验
Isolation and storage of PBMC and viability test & Erythrocyte rosette formation test
实验原理
人外周血单个核细胞（ 人外周血单个核细胞 （ peripheral blood cell， PBMC） mononuclear cell ， PBMC ） 包括淋巴细胞 和单核细胞。 和单核细胞。 单个核细胞的体积、 单个核细胞的体积 、 形态和比重与外周血 其他细胞不同。 因此利用一种介于1 075其他细胞不同 。 因此利用一种介于 1.075ficoll1.090 之间的聚蔗糖 - 泛影葡胺 （ ficollhypaque）分离液作密度梯度离心， hypaque）分离液作密度梯度离心，离心后 不同比重的血细胞在分离液中呈梯度分布, 不同比重的血细胞在分离液中呈梯度分布, 从而分离出PBMC PBMC。 从而分离出PBMC。
台盼蓝（ blue） 台盼蓝（trypan blue）染色法是测定细胞活力的 最简便的方法。 最简便的方法。 台盼蓝又称锥蓝，是一种阴离子型染料， 台盼蓝又称锥蓝，是一种阴离子型染料，它不能透 过活细胞正常完整的细胞膜， 活细胞不着色， 过活细胞正常完整的细胞膜，故活细胞不着色， 但死亡细胞的细胞膜通透性增加， 但死亡细胞的细胞膜通透性增加，可使染料通过 细胞膜进入细胞内， 死细胞着色呈蓝色。 细胞膜进入细胞内，使死细胞着色呈蓝色。 细胞存活率(%)＝无色细胞数/细胞总数× 细胞存活率(%)＝无色细胞数/细胞总数×100% (%)