14-分子发光光谱法
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分子发光光谱法
内转换
内转换：同多重度电子能级中，等能级间的无辐 射能级交换。 通过内转换和振动弛豫，高激发单重态的电子 跃回第一激发单重态的最低振动能级。
外转换 外转换：激发分子与溶剂或其他 分子之间产生相互作用而转移能 量的非辐射跃迁； 外转换使荧光或磷光减弱或“ 猝灭”。
系间跨越 系间跨越：不同多重态,有重叠的转动能级间的非 辐射跃迁。 改变电子自旋，禁阻跃迁，通过自旋—轨道 耦合进行。
荧光强度对温度变化敏感。
一般地，随温度降低，溶液中荧光物质的量子效率和荧光强
度将增大，并伴随光谱的蓝移。温度增加，碰撞频率增加， 使外转换的去激发几率增加。
(3) pH的影响
对酸碱化合物，溶液pH的影响较大，需要严格控制； 如苯胺：在pH 5-12溶液中，以分子形式存在，有荧光。
pH< 5时以苯胺阳离子形式存在，无荧光
ex em
（3）可变波长同步扫描荧光法：使两单色器在扫描过程中以 不同的速率同时进行扫描，即波长可变。
同步扫描荧光法的特点：
优点：
（1）使光谱简化； （2）使谱带窄化；
（3）减小光谱的重叠现象；
（4）减小散射光的影响。
例如：采用同步扫描技 术检测如图萘、蒽、菲 、芘混合物，可简化光 谱，减少光谱重叠，提 高分辨率。 缺点： 因为同步扫描荧光损失了 其它光谱带所含的信息， 对光谱学的研究不利。
比较法：
在线性范围内，测定标样和试样的荧光强度，直接
比较。
三、荧光分析法的应用
可采用直接测定法或间接测定（荧光猝灭）法
1、无机化合物的分析
与有机试剂配合物后测量；可测量约60多种元素。 铍、铝、硼、镓、硒、镁、稀土常采用荧光分析法； 氟、硫、铁、银、钴、镍采用荧光熄灭法测定； 铜、铍、铁、钴、锇及过氧化氢采用催化荧光法测定； 铬、铌、铀、碲采用低温荧光法测定； 铈、铕、锑、钒、铀采用固体荧光法测定
第十一章 分子发光―荧光、 磷光和化学发光光谱法Molecular .
已逐步形成一支在这个研究领域中的工作队伍，研究内
容2已020从/6/15经典的荧光分析方扩展到新近发展起来的新技术。
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上一张幻灯片 下一张幻灯片
§11－1 分子荧光和磷光光谱法
1．产生机理
在一般温度下，大多数分子处在基态的最低振动 能级。处于基态的分子吸收能量(电能、热能、化 学能或光能等到)后天激发为激发态。激发态是很 不稳定的，它得很快地释放出能量又重新跃迁回 基态。若分子返回基态时以发射的电磁辐射(即光) 的形式释放能量，就称为“发光”；如果物质的 分子吸收了光能而被激发，跃迁回基态所发射的 电磁辐射，称为荧光和磷光。现从分子结构理论 来讨论荧光和磷光的产生机理。
进入二十世纪以后，荧光现象被研究得更多了，在理论 或实验技术上都得到极大的发展。特别是随着激光、计 算机和电子学的新成就及技术的引入，大大推动了荧光 分析法在理论上及实验技术的发展，出现了许多新的理 论和新的方法。
在我国，二十世纪五十年代初期仅有极少数的分析工作
者从事荧光分析方面的研究工作。到了 下一张幻灯片
磷光也是某些物质受紫外光照射后产生的光。1944年 Lewis和Kasha提出了磷光与荧光的不同概念，指出磷光 是分子从亚稳的激发三重态跃迁回基态所发射出的光， 它有别于从激发单态跃迁回基态所发射的荧光。磷光分 析法由于其有某些特点，几十年来的理论研究及应用也 不断得到发展。
2020/6/15
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处于分子基态单重态的分子轨道上的电子，激发 时不能直接跃迁至第一激发三重态轨道上（不符 合光谱选择定则），但处于单重激发态的轨道上 的电子，可以通过体系跨越（系间窜跃），转移 到三重态轨道上；在这个过程中，处于激发态的 电子自旋发生变化，这个过程需要时间较长，故 处于三重激发态的寿命为10－4~1s；当其由三重激 发态的最低振动能级跃迁回基态时产生磷光。
分子荧光光谱法
激发态分子在发射荧光之前，很快经历了振动松 弛或者内转化的过程损失了一部分激发能，致使 发射向对于激发总是有一定的损失。
荧光光谱 磷光光谱
辐射跃迁只使激发态分子衰变到基态的不同振动 能级，然后通过振动松弛进一步损失能量。
图2 萘的激发光谱I、荧光II和 磷光光谱III
荧光与分子结构的关系
具有大的共轭π键的结构 化合物
ϕF
λex/nm
λem/nm
含有π→π＊跃迁能级的芳 苯
0.11
205
278
香族化合物的荧光最强芳环 蒽
0.29
286
321
越大其荧光峰越移向长波长 萘
0.46
365
400
方向，且荧光长度往往比较
丁省
0.60
390
480
强。
戊省
0.52
580
640
取代基的影响
给电子基团，如-0H、-OR、 -NH2、-CN、-NR2等，使 荧光增强。
分子荧光光谱法
molecular fluorescence analysis
CONTENTS
01 概述/ 02 荧பைடு நூலகம்分析基本原理/ 03 荧光分析仪器 /
04 检测结果与分析/ 05 对比与发展 /
Part 01
概述
overview
原子光谱法 分子光谱法
主要研究内容
The Main Contents Of The Research
系间窜越 isc
03 不同多重态的两个电子态间的非辐射跃迁过 程（例如S1---T1，T1---S0）
内转换
振动弛豫
S2
系间跨越
S1
能
量
荧光光谱 磷光光谱
辐射跃迁只使激发态分子衰变到基态的不同振动 能级，然后通过振动松弛进一步损失能量。
图2 萘的激发光谱I、荧光II和 磷光光谱III
荧光与分子结构的关系
具有大的共轭π键的结构 化合物
ϕF
λex/nm
λem/nm
含有π→π＊跃迁能级的芳 苯
0.11
205
278
香族化合物的荧光最强芳环 蒽
0.29
286
321
越大其荧光峰越移向长波长 萘
0.46
365
400
方向，且荧光长度往往比较
丁省
0.60
390
480
强。
戊省
0.52
580
640
取代基的影响
给电子基团，如-0H、-OR、 -NH2、-CN、-NR2等，使 荧光增强。
分子荧光光谱法
molecular fluorescence analysis
CONTENTS
01 概述/ 02 荧பைடு நூலகம்分析基本原理/ 03 荧光分析仪器 /
04 检测结果与分析/ 05 对比与发展 /
Part 01
概述
overview
原子光谱法 分子光谱法
主要研究内容
The Main Contents Of The Research
系间窜越 isc
03 不同多重态的两个电子态间的非辐射跃迁过 程（例如S1---T1，T1---S0）
内转换
振动弛豫
S2
系间跨越
S1
能
量
分子发光光谱法
由于物理主义的进步，人们发现分子发光光谱的重要性，它的应用也
越来越普遍。
分子发光光谱是一种用来测量分子光学性质的技术。
它
通过测量发光分子的光谱图，可以获得更多完整且准确的信息，而这
些信息有助于揭示分子结构与性质的关系。
分子发光光谱是一种活性技术，它利用光谱来了解化学反应物的结构。
这项技术利用发出的光的频率和强度来分析分子，由于分子的结构它
们发出的光每个都有不同的频率和强度。
另外，分子发光光谱还能够
反映分子间的相互作用，从而在实验室中观察分子间的相互作用。
分子发光光谱法在科学研究中也得到广泛应用，它被用来研究分子的
结构、反应机理、生物活性及其过程，广泛应用于有机合成、药物研
究及生物化学等领域。
它已经成为结构和生物活性异质性测定的重要
手段，其应用范围也得到了显著的扩展。
例如，分子发光光谱被用来
研究有机和无机分子的生物活性和结构特征，以及有机分子間的相互
作用。
它还可以用来分析酶的结构和功能，从而帮助人们了解酶的作
用机制，还可以检测药物的生物学活性和结构。
未来，分子发光光谱将继续在科学研究中得到广泛应用，将在许多实
际领域，如医学、农业等方面发挥重要作用。
它将为人们提供更多关
于分子结构和性质的信息，从而有助于更深入地探索分子的特性和机制。
《分子发光光谱法》课件
分子对光的吸收具有选择性，激发光谱和发射光谱是荧光物 质的基本特征。
Δ 绘制激发光谱曲线时，固定测量波长为荧光（磷光）最大发
射波长 em，改变激发波长 ex，根据所测得荧光发射强度与
激发波长的关系，可绘制激发光谱曲线。
Δ 固定激发光波长为最大激发光波长 ex，测量不同的波长所
发射的荧光（磷光）强度时，使激发波长和强度保持不变，
二、化学发光分析仪器
⒈ 分立取样式仪器
放大器
数字 显示器
记录仪
高压 稳压电源
分立取样式化学发光仪器示意图
1－反应器 2－反应池 3－恒温水箱 4－贮液管 5－滤光片 6－光电倍增管
⒉ 流动注射式仪器
V
R
D
P
流动注射式化学发光仪器示意图
R-试剂载流 S-样品 P-蠕动泵 V-进样阀 D-检测器
第十四章 分子发光光谱法
Molecular Luminescence Analysis
本章要求
⒈ 掌握分子荧光和分子磷光的基本原理； ⒉ 了解荧光光谱仪的结构； ⒊ 了解化学发光分析法的原理及应用。
分子发光法研究高能态分子释放能量回到基态时所发生的 光辐射，包括：光致发光（分子荧光和分子磷光）、化 学发光、生物发光和电化学发光等 。
14.1 分子荧光光谱法
一、分子荧光的产生
分子吸收了电磁辐射后处于激发态，激发态分子经历一个 碰撞及发射的去激发过程。
1. 分子能级与跃迁
分子能级比原子能级复杂； 每个电子能级上，都存在振动、 转动能级；基态(S0)→激发态(S1、S2、激发态振动能级)；
激发态→基态：多种途径和方式， 速度最快、激发态寿命 最短的途径占优势。
⑴ 光源：高压汞灯和氙弧灯（最广泛的光源，可发射 200~800 nm）。
Δ 绘制激发光谱曲线时，固定测量波长为荧光（磷光）最大发
射波长 em，改变激发波长 ex，根据所测得荧光发射强度与
激发波长的关系，可绘制激发光谱曲线。
Δ 固定激发光波长为最大激发光波长 ex，测量不同的波长所
发射的荧光（磷光）强度时，使激发波长和强度保持不变，
二、化学发光分析仪器
⒈ 分立取样式仪器
放大器
数字 显示器
记录仪
高压 稳压电源
分立取样式化学发光仪器示意图
1－反应器 2－反应池 3－恒温水箱 4－贮液管 5－滤光片 6－光电倍增管
⒉ 流动注射式仪器
V
R
D
P
流动注射式化学发光仪器示意图
R-试剂载流 S-样品 P-蠕动泵 V-进样阀 D-检测器
第十四章 分子发光光谱法
Molecular Luminescence Analysis
本章要求
⒈ 掌握分子荧光和分子磷光的基本原理； ⒉ 了解荧光光谱仪的结构； ⒊ 了解化学发光分析法的原理及应用。
分子发光法研究高能态分子释放能量回到基态时所发生的 光辐射，包括：光致发光（分子荧光和分子磷光）、化 学发光、生物发光和电化学发光等 。
14.1 分子荧光光谱法
一、分子荧光的产生
分子吸收了电磁辐射后处于激发态，激发态分子经历一个 碰撞及发射的去激发过程。
1. 分子能级与跃迁
分子能级比原子能级复杂； 每个电子能级上，都存在振动、 转动能级；基态(S0)→激发态(S1、S2、激发态振动能级)；
激发态→基态：多种途径和方式， 速度最快、激发态寿命 最短的途径占优势。
⑴ 光源：高压汞灯和氙弧灯（最广泛的光源，可发射 200~800 nm）。
分子荧光光谱法
菲
线状环结构比非线状 结构的荧光波长长
• 芳香族化合物因具有共轭的不饱和体系， 芳香族化合物因具有共轭的不饱和体系， 多数能发生荧光 • 多环芳烃是重要的环境污染物，可用荧光 多环芳烃是重要的环境污染物， 法测定 • 3，4 - 苯并芘是强致癌物 ， 苯并芘是强致癌物
λ ex = 386 nm λem = 430 nm
（二）荧光与有机化合物结构的关系
物质只有吸收了紫外可见光，产生π 物质只有吸收了紫外可见光，产生π → π*，n → π* 跃迁， 跃迁，产生荧光 跃迁相比，摩尔吸收系数大10 π → π*与n → π*跃迁相比，摩尔吸收系数大102~103， 寿命短 跃迁常产生较强的荧光， π → π*跃迁常产生较强的荧光， n → π*跃迁产生的 荧光弱
1. 电子自旋状态的多重性
大多数分子含有偶数电子，基态分子每一个轨道 大多数分子含有偶数电子， 中两个电子自旋方向总是相反的↑↓ 中两个电子自旋方向总是相反的↑↓ ，处于基态单 重态。 当物质受光照射时， 重态。用 “S0” 表示 ；当物质受光照射时，基态 分子吸收光能产生电子能级跃迁， 分子吸收光能产生电子能级跃迁，由基态跃迁至 更高的单重态，电子自旋方向没有改变， 更高的单重态，电子自旋方向没有改变，净自旋 = 0 .这种跃迁是符合光谱选律的 第一激发单重态 S1
VR S2 IC VR S1 ISC
VR：振动驰豫 ： IC：内部转换 ： ISC：系间窜跃 ：
T1
S0 吸光 吸光
S0
3. 荧光光谱的产生—辐射去激 荧光光谱的产生—
处于S 处于S1或T1态的电子返回S0态时，伴随有发光现 态的电子返回S 态时， 象，这种过程叫辐射去激 发光 S0 S1或T1 荧光： （1）荧光： 当电子从第一激发单重态S 当电子从第一激发单重态S1的最低振动能级回到基 态S0各振动能级所产生的光辐射叫荧光 荧光是相同多重态间的允许跃迁，产生速度快， 荧光是相同多重态间的允许跃迁，产生速度快， 10-9~10-6s，又叫快速荧光或瞬时荧光，外部光源停 又叫快速荧光或瞬时荧光， 止照射， 止照射，荧光马上熄灭 无论开始电子被激发至什么高能级，它都经过无辐 无论开始电子被激发至什么高能级， 射去激消耗能量后到S 的最低振动能级，发射荧光， 射去激消耗能量后到S1的最低振动能级，发射荧光， 荧光波长比激发光波长长。 荧光波长比激发光波长长。 λ 荧>λ激
分子荧光光度法
分子荧光光度法
分子荧光光度法是一种常用于检测物质浓度和反应动力学的分析方法。
它基于分子在受到光激发后发射荧光的原理，通过测量荧光的强度来确定物质的浓度。
在分子荧光光度法中，首先需要选择一个适合的激发波长，以激发待测物质中的荧光染料或标记物。
当激发波长的光照射到样品中时，样品中的分子吸收光能并跃迁到激发态。
在激发态停留的时间足够长时，分子会发生非辐射跃迁，即释放出荧光。
荧光的强度与待测物质的浓度成正比，因此可以通过测量荧光的强度来确定物质的浓度。
分子荧光光度法具有许多优点。
首先，它具有高灵敏度和高选择性，可以检测到极低浓度的物质。
其次，它具有快速和简便的特点，可以在短时间内完成测定。
此外，分子荧光光度法还具有广泛的应用领域，包括环境监测、生物学研究、医学诊断等。
然而，分子荧光光度法也存在一些限制。
首先，荧光信号受到许多因素的影响，如环境条件、荧光染料的性质等。
因此，在进行分子荧光光度法测定时，需要对这些因素进行严格的控制。
其次，某些样品可能会产生背景荧光干扰，这会降低测定的准确性。
因此，需要采取适当的方法来消除背景荧光的影响。
分子荧光光度法是一种重要的分析方法，它在物质浓度测定和反应
动力学研究等方面具有广泛的应用。
通过合理选择激发波长和采取适当的控制措施，可以获得准确和可靠的分析结果。
这种方法的发展将进一步推动科学研究和实际应用的进步。
分子发光
（ 3）基态单重态到激发单重态的激发为允许跃迁，基 态单重态到激发三重态的激发为禁阻跃迁。
（4）激发三重态的能量较激发单重态的能量低。
2、分子能级结构与分子发射光谱
处于激发态的电子，通常以辐射跃迁方式或无辐射
跃迁方式再回到基态。
辐射跃迁：荧光、磷光的发射。 无辐射跃迁：振动弛豫（VR）、内转化（ic）、体系间 窜跃（isc）等。
A
(2.3 A) 2 (2.3 A)3 I f I o [2.3 A ] 2 3
如果吸光度A<0.05, 方括号中其他各项与第一项相比 均可忽略:
I f 2.3 I o A
由于A=bc，故在实验条件固定时，荧光强度与浓
度成正比，即：
I f 2.3I 0 A
抗体、抗原
酶联免疫吸附分析示意 Enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA）
2. 荧光与有机化合物结构的关系
（1）跃迁类型 对于大多数荧光物质，首先经历激发，然后经过
振动弛豫或其他无辐射跃迁，再发生 跃迁而得到荧光。
（2）共轭效应 容易实现激发 的芳香族化合物容易发生荧光。 增加体系的共轭度荧光效率将增大，主要是由于增大荧 光物质的摩尔吸光系数，有利于产生更多的激发态分子。
类型 转入三重态猝灭： 溶解氧与荧光物质。 发生电子转移反应猝灭： 猝灭剂与荧光物质。 浓度较高单重激发态的分子在 荧光物质的自猝灭： 发生荧光之前和未激发的荧光 物质分子碰撞而引起的自猝灭。 29
二、荧光分析仪
Cary Eclipse 荧光分光光度计 荧光、磷光化学/生物发光 美国瓦里安技术中国有限公司
抗磁性。
当分子吸收能量后，在跃迁过程中不发生电子自旋方
分析化学-分子发光分析法
3. 流式细胞术（FCM） 对悬液中的单细胞或其他生物粒子,通过检测
标记的荧光信号，实现高速、逐一的细胞定量 分析和分选的技术。
§4 化学发光分析法
Chemiluminescence Analysis
基本原理 化学发光反应类型 化学发光测量仪器 化学发光分析法的应用
一、基本原理
化学发光是由于化学反应而导致的光发射。 发生于生命体系的化学发光称为生物发光。 生物发光均有酶（荧光素酶）参加。
最大化学发光强度与发光物质浓度成正 比： Icl max = Kc
化学发光的积分值与发光物质浓度成正 比： Icl = Kc
二、化学发光反应的类型
直接化学发光
A 十 B C＊ ， C＊ C 十 hν
间接（敏化）化学发光 A 十 B C＊ + D ， C＊+ F C 十 F＊
F＊ F 十 hν
三、New technique of fluorescence analysis
1. 激光荧光分析 F 与 I0 成正比，激光的强度大，可提高
荧光法的灵敏度。
2.时间分辨荧光分析
由于不同分子的荧光寿命不同，在激发 和检测之间延缓一段时间，使不同荧光寿命 的物质达到分别检测的目的。
时间分辨荧光免疫法 将稀土元素的螯合物标记抗体，与体液中 的抗原结合。当加入一种增效剂时，稀土 元素被释放出来，形成新的螯合物，能产生 长寿命的 荧光（10 ~1000 μs)。待样品中 蛋白质等物质所发荧光完全衰减后进行测定， 可有效消除背景干扰。 已用于测定甲胎蛋白、促性腺绒毛激素、 皮质醇等体内微量物质的测定。
2.化学发光免疫分析仪
化学发光免疫分析是将化学发光分析和 免疫分析相结合而建立的一种超微量分析 技术。兼具发光分析的高灵敏性和抗原抗 体反应的高特异性的特点。
新编仪器分析第四版第三章分子发光分析法
a. 化学反应必须产生足够的化学能，且被发光物质
吸收形成电子激发态。
在紫外可见光区观察化学发光，160~420kJ· mol-1激发能。 化学反应多是在有O3、H2O2等参加的高能反应。
b. 处于激发态分子能够以光的形式释放能量返回基态
45
2.化学发光效率
化学发光效率CL
激发态分子的产率
发射的光子数 CL Ce em 参加反应的分子数 激发态分子数 发射的光子数 参加反应的分子数 激发态分子数
第三章 分子发光分析法
1
第一节 概述 分子发光（molecular luminescence）
某些物质分子吸收能量跃迁到较高的电子激发态后， 返回基态的过程中伴随发光的现象。以此建立的起来 的分析方法很为非自发光分析法。
hγ
M+ 能量 →M＊
M
2
分子发光分析法: 根据物质所发射的光谱线的位置及强度 进行物质鉴定和含量测定的方法。
620
17
二、分子荧光的性质
1、荧光激发光谱
18
（1）激发光谱的绘制
固定第二单色器波长，改变第一单色器波长进行扫描 反映了激发光波长连续变化时，某一固定荧光测定波长强度
的变化。Fλ—纵坐标， λex(激发波长)—横坐标
光源 第一单色器 或滤光片
激发
Fλ
记录仪 荧光
固定em 荧光波长
第二单色器 或滤光片
22
镜像关系?
IF4800
4400
固定em=620nm(MAX)
1→ 4 1→ 3
固定ex=290nm (MAX)
1→4 1→3 1→2
4 3 2 1
S1
4000 3600 3200 2800 2400 2000 1600 1200 800 400
吸收形成电子激发态。
在紫外可见光区观察化学发光，160~420kJ· mol-1激发能。 化学反应多是在有O3、H2O2等参加的高能反应。
b. 处于激发态分子能够以光的形式释放能量返回基态
45
2.化学发光效率
化学发光效率CL
激发态分子的产率
发射的光子数 CL Ce em 参加反应的分子数 激发态分子数 发射的光子数 参加反应的分子数 激发态分子数
第三章 分子发光分析法
1
第一节 概述 分子发光（molecular luminescence）
某些物质分子吸收能量跃迁到较高的电子激发态后， 返回基态的过程中伴随发光的现象。以此建立的起来 的分析方法很为非自发光分析法。
hγ
M+ 能量 →M＊
M
2
分子发光分析法: 根据物质所发射的光谱线的位置及强度 进行物质鉴定和含量测定的方法。
620
17
二、分子荧光的性质
1、荧光激发光谱
18
（1）激发光谱的绘制
固定第二单色器波长，改变第一单色器波长进行扫描 反映了激发光波长连续变化时，某一固定荧光测定波长强度
的变化。Fλ—纵坐标， λex(激发波长)—横坐标
光源 第一单色器 或滤光片
激发
Fλ
记录仪 荧光
固定em 荧光波长
第二单色器 或滤光片
22
镜像关系?
IF4800
4400
固定em=620nm(MAX)
1→ 4 1→ 3
固定ex=290nm (MAX)
1→4 1→3 1→2
4 3 2 1
S1
4000 3600 3200 2800 2400 2000 1600 1200 800 400
《分子发光光谱》PPT课件
共振荧光(Resonance)：
λex = λem
2020/12/31
h
7
电子重态示意图
基态单重态
激发单重态
激发三重态
2020/12/31
h
8
• 分子中电子的运动状态除了电子所处的能级外， 还包含有电子的多重态，用M=2S+1表示，S 为各电子自旋量子数的代数和，其数值为0或1
• 根据Pauli不相容原理，分子中同一轨道所占 据的两个电子必须具有相反的自旋方向，即自 旋配对Βιβλιοθήκη 2020/12/31h
6
（一）荧光磷光的产生
分子发光的类型
按激发的模式分类： 分子发光
按分子激发态的类型分类：
按光子能量分类：
分子发光
光致发光 化学发光/生物发光 热致发光 场致发光 摩擦发光
荧光 瞬时荧光 迟滞荧光
磷光
斯托克斯荧光(Stokes)：
λex < λem
荧光 反斯托克斯荧光 (Antistokes)：λex > λem
• 辐射跃迁主要涉及到荧光、延迟荧光或磷光的 发射
• 无辐射跃迁是指以热的形式释放多余的能量， 包括振动弛豫、内(部)转移、系间跨(窜)越及 外(部)转移等过程
2020/12/31
h
14
荧光和磷光的产生过程中能量 传递方式及作用
• 振动弛豫 • 内转移 • 荧光发射 • 系间窜跃 • 磷光发射 • 外转移 • 延迟荧光
2020/12/31
h
3
• 直到1852年，对荧光分析法具有开拓性工作的 Stokes在考察奎宁和绿色素的荧光时，用分光 计观察到其荧光的波长比入射光的波长稍为长 些，而不是由光的漫反射引起的，从而导入荧 光是光发射的概念，他还由发荧光的矿石“萤 石”推演而提出了“荧光”这一术语，他还研 究了荧光强度与荧光物质浓度之间的关系，并 描述了在高浓度或某些外来物质存在时的荧光 猝灭现象
第四章 分子光谱法
紫外可见吸收光谱 分子荧光和磷光光谱 化学发光光谱
一、概述
分子和原子一样，也有它的特征分子能级， 分子和原子一样 ，也有它的特征分子能级 ， 分子内 部的运动可分为价电子运动、 部的运动可分为价电子运动、 分子内原子在平衡位置附 近的振动和分子绕其重心的转动。 近的振动和分子绕其重心的转动。因此分子具有电子能 振动能级和转动能级。 级、振动能级和转动能级。 分子从外界吸收能量后，就能引起分子能级的跃迁， 分子从外界吸收能量后，就能引起分子能级的跃迁， 即从基态跃迁到激发态， 即从基态跃迁到激发态，分子吸收能量同样具有量子化的 特征，即分子只能吸收等于二个能级之差的能量，符合： 特征，即分子只能吸收等于二个能级之差的能量，符合： ⊿E＝E2－E1＝hν=hc/λ ＝ 由于三种能级跃迁所需能量不同， 由于三种能级跃迁所需能量不同，所以需要不同波长 的电磁辐射使它们跃迁， 的电磁辐射使它们跃迁，即在不同的光学区域出现吸收或 发射谱带。 发射谱带。
第一节
紫外－ 紫外－可见吸收光谱法
一、紫外可见吸收光谱
紫外可见吸收光谱法是研究分子吸收190紫外可见吸收光谱法是研究分子吸收 750nm波长范围内的吸收光谱 。 紫外可见吸收 波长范围内的吸收光谱。 波长范围内的吸收光谱 光谱主要产生于分子中价电子在电子能级间的跃 是研究物质电子光谱的分析方法， 迁，是研究物质电子光谱的分析方法，通过测定 分子对紫外可见光的吸收， 分子对紫外可见光的吸收，可以鉴定和测定大量 的无机化合物和有机化合物。 的无机化合物和有机化合物。
2. 分子磷光：处于最低单重激发态的分子以无辐 分子磷光： 射弛豫方式进入第一最低三重激发态， 射弛豫方式进入第一最低三重激发态，再由三重 激发态跃迁回到基态而发出的光。 激发态跃迁回到基态而发出的光。 分子荧光和磷光同属光致发光， 分子荧光和磷光同属光致发光，磷光发射则 在超过10-5s后发生，并且在激发的电磁辐射停止 后发生， 在超过 后发生 照射后，仍能持续数分钟至数小时。 照射后，仍能持续数分钟至数小时。 3. 化学发光：是化学反应物或反应产物受反应释 化学发光： 放的化学能激发而产生的光辐射。 放的化学能激发而产生的光辐射。
一、概述
分子和原子一样，也有它的特征分子能级， 分子和原子一样 ，也有它的特征分子能级 ， 分子内 部的运动可分为价电子运动、 部的运动可分为价电子运动、 分子内原子在平衡位置附 近的振动和分子绕其重心的转动。 近的振动和分子绕其重心的转动。因此分子具有电子能 振动能级和转动能级。 级、振动能级和转动能级。 分子从外界吸收能量后，就能引起分子能级的跃迁， 分子从外界吸收能量后，就能引起分子能级的跃迁， 即从基态跃迁到激发态， 即从基态跃迁到激发态，分子吸收能量同样具有量子化的 特征，即分子只能吸收等于二个能级之差的能量，符合： 特征，即分子只能吸收等于二个能级之差的能量，符合： ⊿E＝E2－E1＝hν=hc/λ ＝ 由于三种能级跃迁所需能量不同， 由于三种能级跃迁所需能量不同，所以需要不同波长 的电磁辐射使它们跃迁， 的电磁辐射使它们跃迁，即在不同的光学区域出现吸收或 发射谱带。 发射谱带。
第一节
紫外－ 紫外－可见吸收光谱法
一、紫外可见吸收光谱
紫外可见吸收光谱法是研究分子吸收190紫外可见吸收光谱法是研究分子吸收 750nm波长范围内的吸收光谱 。 紫外可见吸收 波长范围内的吸收光谱。 波长范围内的吸收光谱 光谱主要产生于分子中价电子在电子能级间的跃 是研究物质电子光谱的分析方法， 迁，是研究物质电子光谱的分析方法，通过测定 分子对紫外可见光的吸收， 分子对紫外可见光的吸收，可以鉴定和测定大量 的无机化合物和有机化合物。 的无机化合物和有机化合物。
2. 分子磷光：处于最低单重激发态的分子以无辐 分子磷光： 射弛豫方式进入第一最低三重激发态， 射弛豫方式进入第一最低三重激发态，再由三重 激发态跃迁回到基态而发出的光。 激发态跃迁回到基态而发出的光。 分子荧光和磷光同属光致发光， 分子荧光和磷光同属光致发光，磷光发射则 在超过10-5s后发生，并且在激发的电磁辐射停止 后发生， 在超过 后发生 照射后，仍能持续数分钟至数小时。 照射后，仍能持续数分钟至数小时。 3. 化学发光：是化学反应物或反应产物受反应释 化学发光： 放的化学能激发而产生的光辐射。 放的化学能激发而产生的光辐射。
分子荧光光谱法实验报告
(3)荧光强度与荧光物质浓度的关系
用强度为I0的入射光，照射到液池内的荧光物质时，产生荧光，荧光强度If用仪器测得，在荧光浓度很稀(A<0.05)时，荧光物质发射的荧光强度If与浓度有下面的关系：If=KC。
三、实验试剂和仪器
试剂：罗丹明B乙醇溶液；1-萘酚乙醇溶液；3,3’-Diethyloxadicarbocyanine iodide：标准溶液，10μg/ml, 20μg/ml,30μg/ml,40μg/ml和未知浓度；蒸馏水；乙醇。
(8)pH值的影响：弱酸或弱碱分子和它们的离子在电子构型上不同，是不同的型体，各具有特殊的荧光量子产额和荧光光谱。
2.激发光谱与发射光谱有什么关系？
答：发射光谱与激发光谱没有直接的关系，但是发射光谱一般要比激发光谱波长长。
3.如何进行多组分混合物的荧光分析？
答：(1)如果两组分的荧光峰相互不干扰,可直接测定。可分别在各自的荧波长处测定，求出它们的含量。
具有不饱和基团的基态分子经光照射后，价电子跃迁产生荧光，是当电子从第一激发单重态S1的最低振动能级回到基态S0各振动能级所产生的光辐射。
(1)激发光谱
是指发光的某一谱线或谱带的强度随激发光波长(或频率)变化的曲线。横坐标为激发光波长，纵坐标为发光相对强度。
激发光谱反映不同波长的光激发材料产生发光的效果。即表示发光的某一谱线或谱带可以被什么波长的光激发、激发的本领是高还是低；也表示用不同波长的光激发材料时，使材料发出某一波长光的效率。荧光为光致发光，合适的激发光波长需根据激发光谱确定——激发光谱是在固定荧光波长下，测量荧光体的荧光强度随激发波长变化的光谱。获得方法：先把第二单色器的波长固定，使测定的λem不变，改变第一单色器波长，让不同波长的光照在荧光物质上，测定它的荧光强度，以I为纵坐标，λex为横坐标所得图谱即荧光物质的激发光谱，从曲线上找出λex，，实际上选波长较长的高波长峰。
用强度为I0的入射光，照射到液池内的荧光物质时，产生荧光，荧光强度If用仪器测得，在荧光浓度很稀(A<0.05)时，荧光物质发射的荧光强度If与浓度有下面的关系：If=KC。
三、实验试剂和仪器
试剂：罗丹明B乙醇溶液；1-萘酚乙醇溶液；3,3’-Diethyloxadicarbocyanine iodide：标准溶液，10μg/ml, 20μg/ml,30μg/ml,40μg/ml和未知浓度；蒸馏水；乙醇。
(8)pH值的影响：弱酸或弱碱分子和它们的离子在电子构型上不同，是不同的型体，各具有特殊的荧光量子产额和荧光光谱。
2.激发光谱与发射光谱有什么关系？
答：发射光谱与激发光谱没有直接的关系，但是发射光谱一般要比激发光谱波长长。
3.如何进行多组分混合物的荧光分析？
答：(1)如果两组分的荧光峰相互不干扰,可直接测定。可分别在各自的荧波长处测定，求出它们的含量。
具有不饱和基团的基态分子经光照射后，价电子跃迁产生荧光，是当电子从第一激发单重态S1的最低振动能级回到基态S0各振动能级所产生的光辐射。
(1)激发光谱
是指发光的某一谱线或谱带的强度随激发光波长(或频率)变化的曲线。横坐标为激发光波长，纵坐标为发光相对强度。
激发光谱反映不同波长的光激发材料产生发光的效果。即表示发光的某一谱线或谱带可以被什么波长的光激发、激发的本领是高还是低；也表示用不同波长的光激发材料时，使材料发出某一波长光的效率。荧光为光致发光，合适的激发光波长需根据激发光谱确定——激发光谱是在固定荧光波长下，测量荧光体的荧光强度随激发波长变化的光谱。获得方法：先把第二单色器的波长固定，使测定的λem不变，改变第一单色器波长，让不同波长的光照在荧光物质上，测定它的荧光强度，以I为纵坐标，λex为横坐标所得图谱即荧光物质的激发光谱，从曲线上找出λex，，实际上选波长较长的高波长峰。
分子荧光光谱法
单色器： 第一单色器——选择激发光波长λ1 （＞250nm的紫外 光），称为激发单色器。 第二单色器——选择(测量)发射光（荧光）波长λ2 ， 与激发光入射方向垂直，称为荧光单色器。
样品池： 采用低荧光材料，通常为石英池。 检测器： 光电倍增管。
Ⅳ、荧光法的应用
荧光法灵敏度高、选择性好，可用于痕量 分析，但是能产生荧光的物质较少，使其 应用范围较小。
（2）Stokes位移 Stokes位移是指激发光谱与荧光光谱之间的波长 差值。 荧光的波长总是大于激发光的波长。这是由于发 射荧光之前的振动驰豫和内转换过程损失了一定的能 量。
（3）荧光光谱的形状与激发光波长无关 电子跃迁到不同激发态，吸收不同波长的能 量，产生不同的吸收带，但荧光均是激发态电子 回到第一激发单重态的最低振动能级再跃迁回到 基态而产生的，这与荧光物质分子被激发至哪一 能级无关。因此，荧光光谱的形状和激发光的波 长λ1无关。
溶液浓度较低时：
F K I 0 2.303bc
当入射光的λ1 和 I0一定时 ： F=Kc 即： 在低浓度时，溶液的荧光强度与荧光物质 的浓度成正比。 ————这是荧光法定量的基础。
7.影响荧光强度的因素
（1）内部因素
自猝灭——发光物质分子间碰撞而发生的能量无辐射 转移。自猝灭随溶液浓度的增加而增加。
分子荧光产生机理
1.光谱类型
荧光光谱是物质分子 吸收紫外光后产生的分子 发射光谱。 2.跃迁类型
分子中原子的电子能 级跃迁，伴随振动能级的 跃迁。
3.分子的激发与失活
（1）分子的激发
基态→激发态(S1、S2、激发态振动能级)：吸收特定 频率的辐射，跃迁一次到位。 激发态→基态：多种途径和方式，速度最快、激发态 寿命最短的占优势。
《分子发光分析法》PPT课件
F
0.11 0.29
λexmax(nm) 205 286
λemmax (nm) 278 321
蒽
丁省
0.46
0.60
365
390
400
480
精选课件ppt
7-2
戊省 0.52 580 640
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3.荧光与分子结构的关系
• 2）刚性平面结构 荧光物质的刚性和平面性增加，
有利于荧光发射。
精选课件ppt
3. 荧光和磷光光谱的产生
（1）荧光：
S1或T1 发光 S0
当电子从第一激发单重态S1的最低振动 能级回到基态S0各振动能级所产生的光 辐射叫荧光
荧光是相同多重态间的允许跃迁，产生 速度快，10-9~10-6s，又叫快速荧光或瞬 时荧光，外部光源停止照射，荧光马上 猝灭
精选课件ppt
7-2 提要 返10 回
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7-2 分子荧光分析法及其原理
• 一、分子荧光和磷光的产生
1.电子自旋状态的多重性
2. 无辐射跃迁
3. 荧光和磷光光谱的产生
二、分子荧光分析法的基本原理
1.激发光谱和荧光谱
2.荧光强度及其与浓度的关系
3.荧光与分子结构的关系
4.影响荧光强度的因素
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一、荧光和磷光光谱的产生(图)
• 具有不饱和基团的基态分子光照后，价 电子跃迁产生荧光和磷光
基态分子
光照激发
价电子跃迁到激发态
去激发光 * * n
基态
精选课件ppt
7-2
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1. 电子自旋状态的多重性
• 单重态：用 “S0” 表示 • 当物质受光照射时，基态电子能级跃迁至
分子发光光谱法资料
（b）减弱荧光的取代基 ——-COOH 、 -NO2 、-
COOR 、-NO、-SH 吸电子基团, 使荧光波长蓝移， 荧光强度减弱
芳环上被F、Cl、Br、I 取代后，使系间跨跃加强，磷 光增强，荧光减弱。其荧光强度随卤素原子量增加而 减弱，磷光相应增强，这种效应为重原子效应。
（c）影响不明显的取代基 —— -NH3+、-R、
温度对磷光影响更大
3. pH的影响
大多数含有酸性或碱性基团的芳香族化合物的荧 光性质受溶液pH的影响很大
共轭酸碱对是具有不同荧光性质的两种型体，具 有各自的荧光效率和荧光波长
例： 苯酚
_
OH
O
_
OH
H+
pH≈1有 pH≈13
荧光
无荧光
离子化后， 荧光消失
但两个苯环相连的化合物，又表现出相反的性质， 分子形式无荧光，离子化后显荧光
只有在浓度低时使用，荧光物质测定的是微量或 痕量组分，灵敏度高
浓度高时， If与C不呈线形关系，有时C增大， If 反而降低，有时发生荧光猝灭效应。
14.3 荧光和磷光分析仪器
（一）荧光分析仪器——主要由光源、2个单色器、 液槽、检测器和显示器组成
光源
I0
I
第一单色器
液池
吸收检测器
l ex
与分光光度计有两点不同 ①两个单色器
荧光—荧光分析法
光致发光：以光源来激发而发光 磷光—磷光分析法
电致发光：以电能来激发而发光 生物发光：以生物体释放的能量激发而发光 化学发光：以化学反应能激发而发光—化学发光分析法
二、分子荧光分析法的特点
1. 灵敏度高 荧光强度随激发光强度增强而增强（提高激发光
强度，可提高荧光强度。
分子荧光光谱仪的工作原理
分子荧光光谱仪的工作原理
分子荧光光谱仪是一种用于研究分子的荧光光谱特性的仪器。
其工作原理主要包括激发、发射和检测三个步骤。
1. 激发：首先，使用一个激发源（例如激光器）产生特定波长的激发光，使待测样品中的分子吸收能量。
这些分子吸收能量后处于激发态。
2. 发射：被激发后，分子会发生跃迁，从激发态返回到基态，并释放出激发能量。
在这个过程中，分子会发射出特定波长的荧光光子。
每个分子的荧光光子的波长和强度与其结构以及周围环境有关。
3. 检测：荧光光子经过光学系统进行收集和分离，之后通过光电探测器转换成电信号。
这些电信号经过放大和处理后，可以得到样品的荧光光谱。
分子荧光光谱仪通过测量样品的荧光光谱，可以提供关于分子的结构、环境以及反应动力学等方面的信息。
分子发光光谱法-荧光光谱
分子发光光谱法
荧光光谱
常用术语
激发光 发光分子
荧光（发射光）
紫外灯照射 荧光油墨区域 明亮图案
基态 第一激发态 吸 收 荧 光
E
电子能级跃迁与分子荧光
λex: 荧光激发波长 (excitation wavelength)；
λem: 荧光发射波长 (emission wavelength).
一般指最大激发和发射波长, 用于定量分析. 激发光谱 发射光谱 λex λem λ (nm)
激发 发射
激发 发射
分子荧光光谱
分子荧光发射光谱的特性
——斯托克斯（Stokes）位移
分子的荧光发射波
长总是比其相应的
吸收（或激发）光
谱的波长长。
荧光磷光
分子荧光发射光谱的特性——镜像对称规则
分子的荧光发射光
谱与其吸收光谱之
间存在着镜像关系。
分子荧光发射光谱的特性
——荧光发射光谱的形状与激发波长无关
)
101(0bc F F I k I ε--Φ=在稀溶液中, 当εbc<0.05, 荧光强度与浓度呈线性关系
bc
I k I F F ε0Φ= c 荧光物质浓度 φF 荧光量子产率 I 0 激发光强度 ε 摩尔吸光系数 b 光程长度 k 常数
荧光强度和浓度的关系。
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反而降低，有时发生荧光猝灭效应。
14.3 荧光和磷光分析仪器
（一）荧光分析仪器——主要由光源、2个单色器、
液槽、检测器和显示器组成
I0
光源 第一单色器
I
液池
吸收检测器
l ex
第二单色器
与分光光度计有两点不同
①两个单色器
l em
检测器 放大器及记录器
②检测器与激发光互成直角
1、光源
激发光源一般要求比吸收测量中的光源有更大的 发射强度；适用波长范围宽 分光光度计计中，常使用氘灯、卤钨灯作光源 荧光光度计中常用高压汞灯和氙弧灯
T1 → S0跃迁
电子由S0进入T1的可能过程：
S0 →激发→振动弛豫→内转移→系间跨越→振动弛豫→ T1
发光速度很慢： 10-3～10 s 。 光照停止后，可持续一段时间。
二、激发光谱与荧光(磷光)光谱
荧光 ( 磷光 ) ：光致发光，照射光波长
如何选择？
1. 荧光(磷光)激发光谱
固定发射波长，化合物发射的荧光(磷 光)强度与照射光激发波长的关系曲线
不少有机配体是弱荧光体或不发荧光，但与Mn+形 成螯合物后变为平面构型，就会使荧光加强或产 生荧光 例：8-羟基喹啉为弱荧光体，与Mn+（如 Al3+、 Mg2+）形成螯合物后，能形成刚性结构，荧光加 M 强 OH OH
N
N
（4）取代基的类型
取代基对荧光物质的荧光特征和强度也有很大影 响。分成三类：
线状环结构比非线状 结构的荧光波长长
不产生荧光
产生荧光
• 芳香族化合物因具有共轭的不饱和体系， 多数能发生荧光 • 多环芳烃是重要的环境污染物，可用荧光 法测定
• 3，4-苯并芘是强致癌物
lex = 386 nm lem = 430 nm
（2） 刚性平面结构—较稳定的平面结构
具有强荧光的分子多数有刚性平面结构Hale Waihona Puke 光致发光及影响荧光发射因素
荧光 涉及吸收和发射两个过程 1.基态--激发态
基态 ﹡
n ↑↓ ↑↓ ↑ ↑↓ ↑↓
激发态
↑ ↑↓ ↑↓ n→﹡ S=1 M=2S+1=3 激发三重态 T ↓ ↑↓ ↑↓
分立轨道上 非成对电子 平行自旋更 稳定
→﹡
净电子自旋 S=0 分子多重态 M=2S+1=1 单重基态 S0 S=0
5. 溶液荧光的猝灭
荧光猝灭——荧光物质与溶剂或其它物质之间发生 化学反应，或发生碰撞后使荧光强度下降或荧光效 率f 下降称为荧光猝灭。
使荧光强度降低的物质称为荧光猝灭剂
氧分子及产生重原子效应的溴化物、碘化物等都是 常见的荧光猝灭剂
碰撞猝灭—— M +l激 → M*；M* + Q → M + Q +热 静态猝灭——荧光分子与猝灭剂形成不发荧光的基 态配合物
荧光显微镜
38
应用示例
利用三明治夹心免疫法研究MCF-7 肿瘤细胞表面MUC1蛋白的 表达，以正常细胞HepG2为对照
From left to right: Hoechst fluorescence excited at 405 nm; FITC fluorescence excited at 488 nm; bright field and merged. Scale bars: 20 μm.
利用汞蒸气放电发光的 应用最广泛的一种光 光源；常用其发射365 nm、 源，可发射 250~800nm 405 nm、 436 nm 三条谱线 很强的连续光源 以365 nm 的谱线最强
2、单色器
荧光计用滤光片作单色器，荧光计只能用于定量分析， 不能获得光谱
大多数荧光光谱仪采用两个光栅单色器，有较高的分
二、分子荧光分析法的特点
1. 灵敏度高
荧光强度随激发光强度增强而增强（提高激发光 强度，可提高荧光强度。
激发光 强 发射荧光 强 激发 物质
荧光检测的信号是发射光的绝对强度，采用高灵 敏度的检测系统可大大提高灵敏度，检测限荧光 分析法比分光光度法低2~4个数量级
2. 选择性好
不同的物质用不同的光进行激发，选择不同的激发 光波长
较高激发态 吸收能 量受激 基 态 光辐射 退激
分子在退激过程中以光辐射形式释放能量
根据分子受激时所吸收能源及辐射光的机理不同分为 以下几类： 光致发光：以光源来激发而发光
荧光—荧光分析法
磷光—磷光分析法
电致发光：以电能来激发而发光 生物发光：以生物体释放的能量激发而发光 化学发光：以化学反应能激发而发光—化学发光分析法
发射荧光的能力， f 越大，荧光越强，在0~1之间
荧光量子产率与激发态能量释放各过程的速率常数 有关，如外转换过程速度快，不出现荧光发射
2. 荧光（磷光）与有机化合物结构的关系
物质只有吸收了紫外可见光，产生 *、n * 跃迁，产生荧光
*与n *跃迁相比，摩尔吸收系数大 102~103，寿命短
但两个苯环相连的化合物，又表现出相反的性质， 分子形式无荧光，离子化后显荧光
OH
_ O
例：—苯酚 无荧光 有荧光
另外，表面活性剂也会影响荧光强度和特性
4. 内滤光作用和自吸现象
内滤光作用：溶液中含有能吸收激发光或荧光物质发射的荧
光，如色胺酸中的重铬酸钾；
自吸现象：化合物的荧光发射光谱的短波长端与其吸收光谱 的长波长端重叠，产生自吸收；如蒽化合物。
14.2
荧光和磷光光谱法
一、荧光和磷光光谱的产生 具有不饱和基团的基态分子光照后，价电子跃迁 产生荧光和磷光 基态分子 光照激发 价电子跃迁到激发态
去激发光 * * n
基 态
在光致激发和去激发的过程中，分子中的价电 子（ 、n电子）处于不同的自旋状态，通常用 电子自旋状态的多重性来描述。
辨率，能扫描图谱，既可获得激发光谱，又可获得荧
光光谱
第一单色器作用：分离出所需要的激发光，选择最佳 激发波长l ex ，用此激发光激发液池内的荧光物质 第二单色器作用：滤掉杂散光和杂质所发射的干扰光， 用来选择测定用的荧光波长l em。
在选定的l em 下测定荧光强度，定量分析
3、样品池 盛放测定溶液，通常是石英材料的方形池，四面 都透光，只能用手拿棱或最上边 4、检测器 把光信号转化成电信号, 放大, 直接转成荧光强度 荧光的强度一般较弱，要求检测器有较高的灵敏 度，荧光光度计采用光电倍增管 荧光分析比吸收光度法具有高得多的灵敏度，是 因为荧光强度与激发光强度成正比，提高激发光 强度可 大大提高荧光强度 5、读出装置 记录仪记录或打印机打印出结果，扫描激发光谱 和发射光谱
不同的物质发射的荧光不同，选择不同的检测荧光 波长
比较容易排除其它物质的干扰，选择性好
3. 实验方法简单
4. 待测样品用量少；仪器价格适中；测定范围较广
发光强度可定量测定许多痕量的无机物和有机物， 广泛应用在生物化学、分子生物学、免疫学及农牧 产品分析、卫生检疫等领域。 荧光法比磷光法应用广泛
*跃迁常产生较强的荧光 n *跃迁产生的荧光弱，但可产生系间跨跃，产 生更强的磷光
（1） 共轭体系——有较强的荧光 具有共轭体系的芳环或杂环化合物， 电子共轭 程度越大，越易产生荧光; 环越多，共轭程度越 大，产生荧光波长越长，发射的荧光强度越强
f 苯 萘 蒽 菲 0.11 0.29 0.46 l ex /nm 205 286 365 lem /nm 278 310 400 350
五、荧光强度与荧光物质浓度的关系
用强度为I0的入射光，照射到液池内的荧光物质 时，产生荧光，荧光强度If 用仪器测得，在荧光 浓度很稀时，荧光物质发射的荧光强度If 与浓度 呈线形关系
只有在浓度低时使用，荧光物质测定的是微量或
痕量组分，灵敏度高
浓度高时， If与C不呈线形关系，有时C增大， If
M=2S+1=1 激发单重态 S
允许
允许
禁阻
2.激发态→基态的能量传递途径
电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时，通过 辐射跃迁(发光)和无辐射跃迁等方式失去能量
传递途径
辐射跃迁 无辐射跃迁
荧光
延迟荧光
磷光
系间跨越 内转移
外转移
振动弛豫
内转换 S2
内转换 振动弛豫 系间跨越
S1
能 量 吸 收 T1 发 射 荧 光 T2
（c）影响不明显的取代基 —— -NH3+、-R、
- SO3H等
四 环境对荧光、磷光的影响
1. 溶剂的影响 同一荧光物质在不同溶剂中会有不同的荧光性质 一般来说，溶剂的极性增强，荧光波长红移，荧光
强度增大
2. 温度的影响——低温下测定，提高灵敏度
辐射跃迁的速率基本不随温度变，非辐射跃迁随温
度升高显著增大。大多数荧光物质都随溶液温度升
620
3.激发光谱与发射光谱的关系
a. Stokes位移 激发光谱与发射光谱之间的波长差值。 发射光谱的波长比激发光谱的长。 振动弛豫消耗了能量+溶剂的弛豫作用 b.发射光谱的形状与激发波长无关 电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量，产生 不同吸收带，但均回到第一激发单重态的最低振动能级再
外转换
发 射 磷 振动弛豫 光
S0
l1
l2
l 2
l3
非辐射能量传递过程
振动弛豫：同一电子能级内以热能量交换形式由高振动能级 至低相邻振动能级间的跃迁。 发生振动弛豫的时间10 -12 s。 内转换：同多重度电子能级中,等能级间的无辐射能级交换。 通过内转换和振动弛豫，高激发单重态的电子跃回 第一激发单重态的最低振动能级
14.3 荧光和磷光分析仪器
（一）荧光分析仪器——主要由光源、2个单色器、
液槽、检测器和显示器组成
I0
光源 第一单色器
I
液池
吸收检测器
l ex
第二单色器
与分光光度计有两点不同
①两个单色器
l em
检测器 放大器及记录器
②检测器与激发光互成直角
1、光源
激发光源一般要求比吸收测量中的光源有更大的 发射强度；适用波长范围宽 分光光度计计中，常使用氘灯、卤钨灯作光源 荧光光度计中常用高压汞灯和氙弧灯
T1 → S0跃迁
电子由S0进入T1的可能过程：
S0 →激发→振动弛豫→内转移→系间跨越→振动弛豫→ T1
发光速度很慢： 10-3～10 s 。 光照停止后，可持续一段时间。
二、激发光谱与荧光(磷光)光谱
荧光 ( 磷光 ) ：光致发光，照射光波长
如何选择？
1. 荧光(磷光)激发光谱
固定发射波长，化合物发射的荧光(磷 光)强度与照射光激发波长的关系曲线
不少有机配体是弱荧光体或不发荧光，但与Mn+形 成螯合物后变为平面构型，就会使荧光加强或产 生荧光 例：8-羟基喹啉为弱荧光体，与Mn+（如 Al3+、 Mg2+）形成螯合物后，能形成刚性结构，荧光加 M 强 OH OH
N
N
（4）取代基的类型
取代基对荧光物质的荧光特征和强度也有很大影 响。分成三类：
线状环结构比非线状 结构的荧光波长长
不产生荧光
产生荧光
• 芳香族化合物因具有共轭的不饱和体系， 多数能发生荧光 • 多环芳烃是重要的环境污染物，可用荧光 法测定
• 3，4-苯并芘是强致癌物
lex = 386 nm lem = 430 nm
（2） 刚性平面结构—较稳定的平面结构
具有强荧光的分子多数有刚性平面结构Hale Waihona Puke 光致发光及影响荧光发射因素
荧光 涉及吸收和发射两个过程 1.基态--激发态
基态 ﹡
n ↑↓ ↑↓ ↑ ↑↓ ↑↓
激发态
↑ ↑↓ ↑↓ n→﹡ S=1 M=2S+1=3 激发三重态 T ↓ ↑↓ ↑↓
分立轨道上 非成对电子 平行自旋更 稳定
→﹡
净电子自旋 S=0 分子多重态 M=2S+1=1 单重基态 S0 S=0
5. 溶液荧光的猝灭
荧光猝灭——荧光物质与溶剂或其它物质之间发生 化学反应，或发生碰撞后使荧光强度下降或荧光效 率f 下降称为荧光猝灭。
使荧光强度降低的物质称为荧光猝灭剂
氧分子及产生重原子效应的溴化物、碘化物等都是 常见的荧光猝灭剂
碰撞猝灭—— M +l激 → M*；M* + Q → M + Q +热 静态猝灭——荧光分子与猝灭剂形成不发荧光的基 态配合物
荧光显微镜
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应用示例
利用三明治夹心免疫法研究MCF-7 肿瘤细胞表面MUC1蛋白的 表达，以正常细胞HepG2为对照
From left to right: Hoechst fluorescence excited at 405 nm; FITC fluorescence excited at 488 nm; bright field and merged. Scale bars: 20 μm.
利用汞蒸气放电发光的 应用最广泛的一种光 光源；常用其发射365 nm、 源，可发射 250~800nm 405 nm、 436 nm 三条谱线 很强的连续光源 以365 nm 的谱线最强
2、单色器
荧光计用滤光片作单色器，荧光计只能用于定量分析， 不能获得光谱
大多数荧光光谱仪采用两个光栅单色器，有较高的分
二、分子荧光分析法的特点
1. 灵敏度高
荧光强度随激发光强度增强而增强（提高激发光 强度，可提高荧光强度。
激发光 强 发射荧光 强 激发 物质
荧光检测的信号是发射光的绝对强度，采用高灵 敏度的检测系统可大大提高灵敏度，检测限荧光 分析法比分光光度法低2~4个数量级
2. 选择性好
不同的物质用不同的光进行激发，选择不同的激发 光波长
较高激发态 吸收能 量受激 基 态 光辐射 退激
分子在退激过程中以光辐射形式释放能量
根据分子受激时所吸收能源及辐射光的机理不同分为 以下几类： 光致发光：以光源来激发而发光
荧光—荧光分析法
磷光—磷光分析法
电致发光：以电能来激发而发光 生物发光：以生物体释放的能量激发而发光 化学发光：以化学反应能激发而发光—化学发光分析法
发射荧光的能力， f 越大，荧光越强，在0~1之间
荧光量子产率与激发态能量释放各过程的速率常数 有关，如外转换过程速度快，不出现荧光发射
2. 荧光（磷光）与有机化合物结构的关系
物质只有吸收了紫外可见光，产生 *、n * 跃迁，产生荧光
*与n *跃迁相比，摩尔吸收系数大 102~103，寿命短
但两个苯环相连的化合物，又表现出相反的性质， 分子形式无荧光，离子化后显荧光
OH
_ O
例：—苯酚 无荧光 有荧光
另外，表面活性剂也会影响荧光强度和特性
4. 内滤光作用和自吸现象
内滤光作用：溶液中含有能吸收激发光或荧光物质发射的荧
光，如色胺酸中的重铬酸钾；
自吸现象：化合物的荧光发射光谱的短波长端与其吸收光谱 的长波长端重叠，产生自吸收；如蒽化合物。
14.2
荧光和磷光光谱法
一、荧光和磷光光谱的产生 具有不饱和基团的基态分子光照后，价电子跃迁 产生荧光和磷光 基态分子 光照激发 价电子跃迁到激发态
去激发光 * * n
基 态
在光致激发和去激发的过程中，分子中的价电 子（ 、n电子）处于不同的自旋状态，通常用 电子自旋状态的多重性来描述。
辨率，能扫描图谱，既可获得激发光谱，又可获得荧
光光谱
第一单色器作用：分离出所需要的激发光，选择最佳 激发波长l ex ，用此激发光激发液池内的荧光物质 第二单色器作用：滤掉杂散光和杂质所发射的干扰光， 用来选择测定用的荧光波长l em。
在选定的l em 下测定荧光强度，定量分析
3、样品池 盛放测定溶液，通常是石英材料的方形池，四面 都透光，只能用手拿棱或最上边 4、检测器 把光信号转化成电信号, 放大, 直接转成荧光强度 荧光的强度一般较弱，要求检测器有较高的灵敏 度，荧光光度计采用光电倍增管 荧光分析比吸收光度法具有高得多的灵敏度，是 因为荧光强度与激发光强度成正比，提高激发光 强度可 大大提高荧光强度 5、读出装置 记录仪记录或打印机打印出结果，扫描激发光谱 和发射光谱
不同的物质发射的荧光不同，选择不同的检测荧光 波长
比较容易排除其它物质的干扰，选择性好
3. 实验方法简单
4. 待测样品用量少；仪器价格适中；测定范围较广
发光强度可定量测定许多痕量的无机物和有机物， 广泛应用在生物化学、分子生物学、免疫学及农牧 产品分析、卫生检疫等领域。 荧光法比磷光法应用广泛
*跃迁常产生较强的荧光 n *跃迁产生的荧光弱，但可产生系间跨跃，产 生更强的磷光
（1） 共轭体系——有较强的荧光 具有共轭体系的芳环或杂环化合物， 电子共轭 程度越大，越易产生荧光; 环越多，共轭程度越 大，产生荧光波长越长，发射的荧光强度越强
f 苯 萘 蒽 菲 0.11 0.29 0.46 l ex /nm 205 286 365 lem /nm 278 310 400 350
五、荧光强度与荧光物质浓度的关系
用强度为I0的入射光，照射到液池内的荧光物质 时，产生荧光，荧光强度If 用仪器测得，在荧光 浓度很稀时，荧光物质发射的荧光强度If 与浓度 呈线形关系
只有在浓度低时使用，荧光物质测定的是微量或
痕量组分，灵敏度高
浓度高时， If与C不呈线形关系，有时C增大， If
M=2S+1=1 激发单重态 S
允许
允许
禁阻
2.激发态→基态的能量传递途径
电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时，通过 辐射跃迁(发光)和无辐射跃迁等方式失去能量
传递途径
辐射跃迁 无辐射跃迁
荧光
延迟荧光
磷光
系间跨越 内转移
外转移
振动弛豫
内转换 S2
内转换 振动弛豫 系间跨越
S1
能 量 吸 收 T1 发 射 荧 光 T2
（c）影响不明显的取代基 —— -NH3+、-R、
- SO3H等
四 环境对荧光、磷光的影响
1. 溶剂的影响 同一荧光物质在不同溶剂中会有不同的荧光性质 一般来说，溶剂的极性增强，荧光波长红移，荧光
强度增大
2. 温度的影响——低温下测定，提高灵敏度
辐射跃迁的速率基本不随温度变，非辐射跃迁随温
度升高显著增大。大多数荧光物质都随溶液温度升
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3.激发光谱与发射光谱的关系
a. Stokes位移 激发光谱与发射光谱之间的波长差值。 发射光谱的波长比激发光谱的长。 振动弛豫消耗了能量+溶剂的弛豫作用 b.发射光谱的形状与激发波长无关 电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量，产生 不同吸收带，但均回到第一激发单重态的最低振动能级再
外转换
发 射 磷 振动弛豫 光
S0
l1
l2
l 2
l3
非辐射能量传递过程
振动弛豫：同一电子能级内以热能量交换形式由高振动能级 至低相邻振动能级间的跃迁。 发生振动弛豫的时间10 -12 s。 内转换：同多重度电子能级中,等能级间的无辐射能级交换。 通过内转换和振动弛豫，高激发单重态的电子跃回 第一激发单重态的最低振动能级