酿造过程中双乙酰的控制及检测方法
啤酒酿造中双乙酰的代谢调控研究进展
啤酒酿造中双乙酰的代谢调控研究进展摘要双乙酰是啤酒生产过程中由酵母在合成氨基酸的途径中产生的重要风味物质。
其含量是衡量啤酒成熟的重要标志。
本文简要综述了啤酒生产中双乙酰的形成机制和代谢调控研究进展。
关键词：啤酒酿造；双乙酰；代谢；调控啤酒中双乙酰的主要成分是2，3-丁二酮，是酵母发酵过程中的代谢副产物，是影响啤酒风味的重要因素，是衡量啤酒成熟的主要依据。
如果在生产过程中控制不当，就会使双乙酰含量超过阈值，致使啤酒风味改变。
国家标准中优级淡色啤酒要求双乙酰含量在0．13mg/L以下。
双乙酰的形成与消除几乎成了促进啤酒成熟以及缩短发酵周期的核心问题。
传统的啤酒酿造中，啤酒酵母在主发酵期产生的双乙酰，会在发酵后期和贮酒期由啤酒酵母重新吸收还原成味阈值较高的2，3-丁二醇，从而达到促进啤酒口味成熟的目的。
但在啤酒后发酵和贮酒过程中，由于双乙酰还原的速度很慢，要想得到双乙酰含量合格的成熟啤酒，就要延长发酵周期，这对于提高发酵罐的利用率和经济效益都不利。
因此，有目的地控制啤酒中的双乙酰含量，对于促进啤酒成熟、缩短发酵周期、改善啤酒质量和提高经济效益具有非常重要的意义。
现今在啤酒生产中，无论是优化发酵条件、酵母菌种的改良、还是外加a-乙酰脱羧酶等方法都是从双乙酰的代谢途径出发的。
可以说双乙酰代谢途径的调控是解决啤酒发酵过程中双乙酰含量对啤酒风味影响的根本所在。
所以研究啤酒酿造过程中形成双乙酰的机制、途径以及如何有目的的控制啤酒中的双乙酰受到了广泛的关注。
1、啤酒生产中双乙酰的形成机制和代谢途径最初的啤酒酿造者认为，双乙酰是由啤酒中污染的乳酸菌产生的。
直到20世纪60年代。
研究者才发现双乙酰是酵母的正常代谢产物。
双乙酰是正常发酵过程中，由啤酒酵母细胞体内所进行的缬氨酸生物合成的中间产物ɑ-乙酰乳酸在分泌到细胞外时，由非酶促的氧化脱羧反应自发产生的。
当酵母生产繁殖，需要大量合成缬氨酸时，丙酮酸被大量转化为ɑ-乙酰乳酸，而由于乙酰羟基同分异构还原酶(RI)效率非常低，使得双乙酰前体物质ɑ-乙酰乳酸得以积累，在酵母细胞内ɑ-乙酰乳酸不会转化为双乙酰，当一部分ɑ-乙酰乳酸分泌出细胞进入啤酒中，自发的氧化脱羧形成双乙酰，如果酵母活性高，则双乙酰依靠渗透酶将双乙酰输送进入酵母细胞，被酵母重新吸收，有酵母自身的酶催化，还原成乙偶姻(3-羟基-2-丁酮)和2，3-丁二醇，排出细胞外。
双乙酰的测定方法有气相色谱法 。小斯
测定双乙酰的实验方案双乙酰的测定方法有气相色谱法、极谱法和比色法等等。
邻苯二胺比色法是凡遇连二酮类都能发生显色反应的方法，所以，此法测得之值为双乙酰与戊二酮的总量，结果偏高，但此法测定快速简便。
1．原理：用蒸汽将双乙酰从样品中蒸馏出来，加入邻苯二胺后，形成2，3-二甲基喹喔啉。
在335nm 波长下有一最大吸收峰，其吸光度与双乙酰的含量符合朗伯-比尔定律，可对样品的双乙酰含量进行定量测定。
2．试剂（1）4mol/L 盐酸取浓盐酸150mL，注入300mL 蒸馏水中。
（2）1%邻苯二胺精密称取分析纯邻苯二胺0.25g 溶解于4mol/L 盐酸中，并定容至25mL，摇匀。
贮存于棕色瓶中，应当日配制。
3．仪器（1）紫外分光光度计（2）双乙酰蒸馏装置一套4．测定步骤（1）蒸馏按图6-1 把双乙酰蒸馏器安装好，把排气夹子7 打开，置内装2.5mL 蒸馏水的容量瓶(或量筒)于冷凝器下端，使馏出口尖端浸没在水面下，外加冰水冷却。
加热蒸汽发生器至沸，通汽加热夹套蒸馏器，备用。
于100mL 量筒中先加入2～4 滴消泡剂，再注入5℃左右未除气啤酒100mL。
待夹套蒸馏器下端冒大汽时，打开进样口瓶塞，将啤酒迅速注入到蒸馏器内，再用约10mL 蒸馏水冲洗量筒，洗液同时倒入，迅速盖好进样口塞子。
用水封口，待夹套蒸馏器下端再次冒大汽时，将排气夹子夹住，开始蒸馏，接馏液，直到馏出液接近25mL 时取下容量瓶，用水定容至25mL，摇匀(蒸馏应在3 分钟内完成。
)（2）显色混匀馏出液，分别吸取馏出液10mL 于两支比色管中。
一管作为样品管加入0.5mL1%邻苯二胺溶液，另一管不加作空白，充分摇匀后，同时置于暗处放置20～30 分钟，然后于样品管中加2mL 4 mol/L 盐酸溶液，于空白管中加2.5mL4mol/L 盐酸溶液，混匀。
（3）测定在335nm 波长处，用2cm 比色皿以空白作对照测定样品吸光度。
5．计算(mg/L) 1.2 235 双乙酰= A ×式中——样品吸光度，指用2cm 比色皿测得的，若用1cm 比色皿，则吸光度乘以2；1.2——换算系数，系多次用纯双乙酰测得的吸光度和双乙酰含量的换算系数。
啤酒酿造中的双乙酰及其酶法控制研究进展
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《 现代食品科技 》
Ｍｏ ｅ ｎＦ ｏ ｃｅ ｃ ｎ ｅｈ ｏｏ ｙ ｄ ｒ ｏ 源自Ｓ ｉ ｅ ｄＴ ｃ ｎ ｌｇ ｎ ａ
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啤酒酿造中的双 乙酰及其酶法控制研究进展
励建荣 ，裘纪 莹 （ 工商大 学食 品生物 与环境 工程 学 院，浙江省食 品安全 重点 实验 室 ，浙 江 杭 州 １０５ 浙江 Ｉ ０３） ３
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啤酒生产过程中双乙酰的控制
２ ０ 年第 ２ （ Ｏ２ 期 总第 １ １ ０期）
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啤 酒生产过程中双 乙酰的控制
李
摘
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贵阳 ５ ００ ） ５０ ２
（ 贵州瀑布集团技术处 ， 贵州
要： 在发 酵过 程中， 筛选分 离提 高双 乙酰的酵母变异茵株， 高其对双 乙酰的还原速率 ； 高发酵 ｅ ｔｏ ｎ ｇ ｍ ｎ ｆＢｉ ｃ ｔ ｌ ｎ Ｂｅ ｒ Ｂｒ ｗｉ ｇ ａ ｅｙ ｅ ｅ ｎ ｉ
Ｌ ＩＲｏ ｇ ｎ
｛ ｅ ｔ ｌ ｅ ａｔ ｎ Ｇ ｉ￣ ｔｒ ｌ Ｇ ｐ ｕｙｎ ．Ｇ ｉｈｕ ５０ ０ ，Ｃ ｉａ Ｔ ｅ ａ Ｄ ｐ ｒ ｔ ｕｄｏ Ｗａｅ ａ ｍｕ Ｇ ｌ ￣ ｕｚｏ ５ ０ ２ ｈｎ ｔＯ ｍｅ ｕ ｆｌ ａ
低双 乙酰的含量是有利 的。
２ Ｏｍ ／ ０ ｇ Ｌ时， 双乙酰含量几乎停留在同一数值 ， 说明 ｎ 一氨基氮
过量 ； 氨基氨在 １０ ０ ｍ Ｌ ， ａ一 ８ —２ ０ 时 双乙酰含量随 ａ 一氨基氮 含量变化趋于平缓， 以， 所 对双 乙酰的控制 来说 ， 以麦汁中 ａ 一氨 基氮含量在 １ ８ ０—２０ｍ ／ 之 间最台适 。 ０ ｇＬ ２ 发酵过程中对双 乙酰的控制
通风搅拌， 降低 麦汁的 ｐ Ｈ值 ， 以加速 ａ一乙酰乳 酸的分解速度 ； 在主酵中游加 ｎ一乙酰乳 酸脱装晦 、 利用 Ｃ 洗潦 、 添加抗坏血酸（ ｃ 等控制双 乙酰。（ Ｖ） 鹿晓） 关键词： 啤酒生产 ； 双 乙酰； 控制 中国分类号：Ｔ ２２ ５ Ｔ ２ １４ Ｓ６ ； Ｓ ６ 文献标识码 ： Ｂ 文章编号 ：０ １ ９ ｓ （ｏ ２ｏ — ０ ７ 仇 １０ — ２ ６ ２ｏ ） ２ ０ ６ 一
啤酒发酵过程中双乙酰（馊味）的控制方法
啤酒发酵过程中双乙酰（馊味）的控制方法啤酒发酵过程中双乙酰的控制方法饭出现馊味主要是由于细菌（主要是蜡状芽孢杆菌）污染所产生，该菌为革兰氏阳性菌，30-32℃为最适合温度，100℃，20min可以杀死，该菌可产两种毒素，分别为耐热和不耐热，可以导致腹泻和呕吐，因此，剩饭一定要低温保藏，吃前回锅加热2015-09-24 09:15阅读：双乙酰是啤酒发酵过程中酵母自身代谢出的一种副产物，是影响啤酒风味的重要物质，同时也是啤酒成熟的限制性指标。
它具有挥发性和强烈的刺激性。
当其含量过高（≥1.5mg/L）时，会使啤酒出现令人不愉快的饭馊味，严重破坏啤酒的风味，影响啤酒的感官质量。
双乙酰的形成途径1.酵母活性较差，出现酵母细胞自溶后，其体内的α-乙酰乳酸溶解在酒液中，经氧化会形成双乙酰。
2.生产过程中污染了某些厌氧菌（主要是联球菌和乳酸杆菌等）。
它们在后酵厌氧条件下，能够迅速繁殖，并同时生成α-乙酰乳酸和双乙酰。
而α-乙酰乳酸经氧化脱羧，可形成双乙酰。
3.由乙酰辅酶A与羟乙基硫胺素的焦磷酸盐（又称活性乙醛）直接缩合，进一步释放出辅酶A，形成双乙酰。
4.由α-乙酰乳酸非酶脱羧氧化而成，此为生成双乙酰的主要途径。
双乙酰的前驱物质α-乙酰乳酸是酵母合成缬氨酸的中间产物，由丙酮酸被大量转化为α-乙酰乳酸，但由于乙酰羟基同分异构还原酶效率很低，因此，使双乙酰的前驱物质α-乙酰乳酸得以积累。
在酵母细胞内，α-乙酰乳酸不会转化为双乙酰。
还有一部分α-乙酰乳酸通过酵母细胞壁和细胞膜溢出，渗透到细胞外，经非酶作用，氧化脱羧形成双乙酰。
影响双乙酰生成的因素1、麦汁组分的影响糖化麦汁营养成分是否合理，直接关系到酵母能否进行正常的生理代谢，其中α-氨基酸的含量尤为重要，在麦汁中应保持在180mg／L左右，最好不低于160mg／L。
只有达到这个含量，麦汁中的缬氨酸才能满足酵母的生长需要，而自身代谢产生的缬氨酸反应，才能被抑制在较低的水平，双乙酰的生成量才可能较低。
精酿原浆啤酒生产过程中双乙酰控制技术研究
2020年31期技术创新科技创新与应用Technology Innovation and Application精酿原浆啤酒生产过程中双乙酰控制技术研究*罗跃中，李忠英，熊名务（湖南化工职业技术学院，湖南株洲412000）引言双乙酰是一种独特的风味物质，其特征是带有一股类似于馊饭的味道。
在生产啤酒时，啤酒的成熟度以及口感可以通过检测双乙酰的含量来判断，其风味阈值是0.2ppm 。
其前驱体为a-乙酰乳酸，a-乙酰乳酸是经过啤酒酵母的帮助在乙酰羟酸合成酶的作用下产生的，并且经过非酶氧化的途径在细胞的外部产生双乙酰。
对其含量进行合理的控制保证啤酒的饮用口感。
因此，在进行啤酒生产时，降低其双乙酰含量，使啤酒的口感达到最佳，使啤酒生产重点关注的问题。
1微型精酿原浆啤酒的研究背景我校与山东中德啤酒设备有限公司合作，引进一套10t 原浆啤酒生产线，建立微型精酿原浆啤酒生产车间，于2015年9月份正式投入生产[1]。
产品质量符合食品生产要求，消费者反馈效果较好。
但是在生产过程发现双乙酰控制不稳定且含量在0.05~0.08mg/L 之间。
虽然低于国家标准0.1mg/L ，但啤酒产品中双乙酰还有很大降低空间。
此外，作为精酿原浆啤酒不需要经过后续的过滤、杀菌和包装处理，使用临时酒桶灌装，使用周期1~4天，灌装后保藏周期不长的原因主要是没有经过过滤的酵母随着环境温度的升高又重新代谢生产成双乙酰等副产物，影响口感。
因此，本文将重点研究影响啤酒风味物质双乙酰产生的发酵生产条件、生产菌酵母及使用代数、生产条件等因素，旨在进一步降低和稳定控制双乙酰含量，改善和提高精酿原浆啤酒口感风味。
2双乙酰的形成以及分解在进行啤酒的发酵时，啤酒酵母会产生大量的a-乙酰乳酸，由于其合成以及分解的不平衡，容易导致其在啤酒酵母中不断的沉积，而有一部分进入到啤酒的发酵液中，从而发生反应，产生双乙酰。
啤酒酵母还能够通过反应产生还原酶，可以对双乙酰进行反应还原，变成乙偶姻，经过降解反应后生成丁二醇，丁二醇和乙偶姻都不会对啤酒的口感和其他方面产生影响。
试验啤酒中双乙酰的测定[最新]
![试验啤酒中双乙酰的测定[最新]](https://img.taocdn.com/s3/m/3e405bc648649b6648d7c1c708a1284ac850058d.png)
实验啤酒中双乙酰的测定一、实验目的了解双乙酰的测定方法，监测啤酒质量。
二、实验原理双乙酰(丁二酮)是赋予啤酒风味的重要物质。
但含量过大，能使啤酒有一种馊饭味。
轻工部部颁标推规定成品啤酒中双乙酰含量＜0．2ppm。
双乙酰的测定方法有气相色谱法、极谱法和比色法等等。
邻苯二胺比色法是连二酮类都能发生显色反应的方法，所以，此法测得之值为双乙酰与戊二酮的总量，结果偏高。
但此法快速简便，是轻工部部颁标准规定的方法。
用蒸汽将双乙酰从样品中蒸馏出来，加邻苯二胺，形成2，3—二甲基喹喔琳，其盐酸盐在335nm波长下有一最大吸收峰，可进行定量测定。
三、实验仪器与试剂(1)紫外分光光度计。
(2)双乙酰蒸馏装置双乙酰蒸馏装置示意图1、夹套蒸馏器2、蒸汽发生器3、冷凝器4、25mL容量瓶（或量筒）5、加样口6、电炉(1)4N盐酸(2)1％邻苯二胺精密称取分析纯邻苯二胺250.0mg，溶于4N盐酸中，并定容至25mL，贮于棕色瓶中，限当日使用。
（3）消泡剂有机硅消泡剂或甘油聚醚。
四、实验步骤(1)按上图把双乙酰蒸馏器安装好，把夹套蒸馏器下端的排气夹子打开。
(2)将内装 2.5mL蒸馏水的容量瓶(或量筒)放于冷凝器下，使出口尖端浸没在水面下，外加冰水冷却。
(3)加热蒸汽发生器至沸，通汽加热夹套，备用。
(4)于100mL量筒中加入2~4滴消泡剂，再注入5℃左右未除气啤酒100mL。
(5)待夹套蒸馏器下端冒大汽时，打开进样口瓶塞，将啤酒迅速注入蒸馏器内，再用约10mL 蒸馏水冲洗量筒，同时倒入，迅速盖好进样口塞子，用水封口。
(6)待夹套蒸馏器下端再次冒大汽时，将排气夹子夹住，开始蒸馏，到馏出液接近25mL 时取下容量瓶，用水定容至25mL，摇匀(蒸馏应在3分钟内完成)。
(7)分别吸取馏出液10mL于两支比色管中。
一管作为样品管加入0.5mL邻苯二胺溶液，另一管不加作空白，充分摇匀后，同时置于暗处放置20~30分钟，然后于样品管中加2mL4N 盐酸溶液，于空白管中加2.5mL4N盐酸溶掖，混匀。
啤酒生产中双乙酰的生成机理及控制
交流平台实战案例CASE ANALYSIS编辑︱孙雁︱E-mail:zhiyezazhi@ＯＣＣＵＰＡＴＩＯＮ1272009 9啤酒生产中双乙酰的生成机理及控制文/杨曼璐国家啤酒标准把双乙酰含量作为重要的质量指标及衡量啤酒成熟的尺度。
一、双乙酰的生成机理二、酿造条件对双乙酰生成量的影响1. 麦汁组成麦汁中的碳水化合物是酵母所需主要碳源，氨基酸是酵母同化所需主要氮源，同时麦汁中维生素、微量元素Ｃａ２＋、Ｎａ＋等都对酵母发酵产生不同程度的影响。
麦汁中有必须足够的氨基酸才能保证酵母正常发育和新陈代谢。
在制备麦汁时，如果辅料用量高，或溶解不良麦芽较多时，麦汁中氨基酸含量不足，啤酒中双乙酰含量会升高。
2. 麦汁中溶解氧如果麦汁通风供氧不足（＜６ ｍｇ／Ｌ），则酵母增殖缓慢，发酵降糖慢，还原双乙酰能力低。
但供氧太足（＞１０ ｍｇ／Ｌ），会使酵母增殖过猛，提高酒液中酵母代谢产物的浓度，也会造成营养供应不足，同样会造成双乙酰含量的增加。
3. 酵母添加量提高酵母添加量可以扩大酵母细胞和麦汁接触面积，发酵速度相应加快，一定程度上抑制α－乙酰乳酸的生成，加速双乙酰的还原。
如果酵母数量少，增殖负担就会加重，需要的营养就会增多，缬氨酸消耗量必然增加。
而加大酵母添加量，减少了酵母增殖量，减少了缬氨酸的消耗，双乙酰生成量就得到抑制。
4. 酵母菌种由于酵母遗传基因的差异，不同酵母菌还原双乙酰的能力有很大的差异。
如青岛酵母峰值在（０．３～０．３５）ｐｐｍ（非法定单位，１ ｐｐｍ＝１×１０－６），蓝带酵母的峰值仅（０．１５～０．２０）ｐｐｍ。
所以酵母菌种对啤酒中双乙酰含量的影响是十分显著的。
酵母中的酸含量，包括控制缬氨酸积累速度的酶类的含量，与啤酒中乙酰乳含量关系显著。
5. 发酵温度、发酵方法提高发酵温度会加速酵母的新陈代谢，加速双乙酰的生成与还原，但如果发酵温度过高，会产生较多的高级醇，从而影响啤酒口味。
提高发酵温度一定要根据酵母菌株的特性，保持酒体的质量稳定。
控制啤酒中双乙酰含量措施的探讨与研究
衰退 。
图 2 由活性乙醛形成双乙酰
113 杂菌污染
污染了可以产生双乙酰的杂菌 ,主要是链球菌 、 杆菌等 [ 5 ] 。
2 影响啤酒中双乙酰含量的主要因素
211 酵母菌种
经研究发现 ,不同酵母菌种 α- 乙酰羟基丁酸合 成酶活力差别很大 ,这就造成了 α- 乙酰乳酸生成量 的差异 ;在相同发酵条件下 ,不同酵母菌种生成双乙 酰前体物质的峰值差别很大 ,有的在 013m g /L 左右 , 有的高达 110m g /L 以上 。酵母强壮 、数量多 、代谢旺 盛 ,双乙酰还原速度快 ; 繁殖期的幼酵母 、贮存时间 过长或高温贮存的酵母 、使用代数过多的酵母 、衰退 及发酵迟缓的酵母 、凝集性强沉淀快及分散不良的 酵母 ,还原双乙酰的能力弱 。此外 ,酵母被球菌和乳 酸菌等杂菌污染 ,容易产生较多的双乙酰 。
31112 构建酵母工程菌株 α-乙酰乳酸脱羧酶可以 直接将 α- 乙酰乳酸转化为乙偶姻 ,而不经过双乙酰
长和繁殖 ,充足的 α-氨基氮有利于酵母的繁殖 。从 图 1可以看出 ,缬氨酸对形成双乙酰的前体物质 α乙酰乳酸具有反馈抑制作用 ,如果提高麦汁中缬氨酸 的含量 ,则可抑制从丙酮酸合成缬氨酸的支路代谢 , 从而减少 α-乙酰乳酸的生成 。麦汁中 α- 氨基氮的 含量与双乙酰峰值的关系如表 1所示 。 浅色麦芽制成的麦汁中缬氨酸含量高于深色麦
21314 麦汁中 Zn2 + 含量 麦汁中 Zn2 + 含量一般为 0115～0120m g /L , Zn2 + 含量充足 ,使酵母活力旺盛 ,还 原双乙酰的能力就强 。
21315 麦汁的 pH 将接种麦汁的 pH 从 512～514 迅 速降至 413～415左右 ,能减少 α- 乙酰乳酸的生成 ,从 而降低双乙酰含量 。 21316 大罐发酵 与传统发酵相比 ,大罐发酵的啤 酒双乙酰含量相对较低 ,因大罐发酵悬浮于酒液中 的酵母密度大 、沉淀时间长 ,双乙酰还原相对较快 。 21317 酵母细胞自溶后 ,细胞内的 α- 乙酰乳酸进入 啤酒 ,经氧化转化为双乙酰 。
紫外分光光度计法测定啤酒中的双乙酰
取样前酒样释放的量要适量， 取样要准确， 在取样的同
时， 样品内存在酵母和空气以及温度上升和时间的延长， 都可
能直接引起双乙酰迅速变化， 所以， 我们用紫外分光光度计法
测定酒样或半成品酒样在取样的时候， 要尽量多放一些酒样，
把瓶颈口或管道中酵母杂质冲下去， 这样取来的酒样才能较
为均匀， 有代表性， 双乙酰测定的数值才能准确［５］。
ｓ＝
………………（ ２）
ｓｒ ＝
………………（ ３）
表１
样品 测定
编号 吸光值
１ ０．０７７９ ０．０６０９
２ ０．０６３７ ０．０４８９
３ ０．０８３４ ０．０６７２
４ ０．０பைடு நூலகம்７９ ０．０７０４
５ ０．０８１１ ０．０６３６
６ ０．０８８４ ０．０７３６
表２
样品 测定
编号 吸光值
７
０．０７３３
０．０６２５
称 取 邻 苯 二 胺 ０．１００ｇ， 溶 于 ４ｍｏｌ／Ｌ 盐 酸 溶 液 中 ， 并 定 容 至 １０ｍＬ， 摇匀， 放于暗处。此溶液须当天配制与使用； 若配制 出来的溶液呈红色， 应重新更换新试剂； １．３．３ 有机硅消泡剂（或甘油聚醚）。 １．４ 试验步骤 １．４．１ 蒸馏
将双乙酰蒸馏器安装好， 加热蒸汽发生瓶， 使水至沸。通 汽预热后， 置 ２５ｍＬ 容量瓶于冷凝器出口接受馏出液， 外 加 冰 浴 冷 却 ； 加 ３ 滴 消 泡 剂 于 １００ｍＬ 量 筒 中 ， 再 注 入 未 经 除 气 的 预先冷至 ５℃左右的酒样 １００ｍＬ， 迅速移入已预 热 的 蒸 馏 器 内， 并用少量水冲洗量筒及带塞漏斗， 盖塞。然后用水封口， 进 行 蒸 馏 ， 直 至 馏 出 液 接 近 ２５ｍＬ（蒸 馏 需 在 ３～５ｍｉｎ 内 完 成）时 取下容量瓶， 达到室温用水定容， 摇匀。 １．４．２ 显色与测量
控制啤酒酿造过程的双乙酰的生物工程技术进展_黄祖新
控制啤酒酿造过程的双乙酰的生物工程技术进展黄祖新(福建师范大学生物工程学院;福州350007)摘 要 双乙酰是啤酒酿造过程中产生的重要风味物质,控制双乙酰产生的途径是减少A -乙酰乳酸的形成或加速双乙酰的还原。
本文介绍微生物工程、酶工程、基因工程等现代生物工程技术在啤酒酿造过程控制双乙酰的应用方法及其最新进展,指出现代生物工程技术的应用必将推动啤酒工艺和设备的变革,促进啤酒酿造技术的飞跃进步。
关键词 双乙酰 A -乙酰乳酸 啤酒本世纪四十年代前有人认为啤酒链球菌(beer sarcina pediococcus caatobacillus)的污染是产生双乙酰的原因。
这一观点维持了相当长一段时期,双乙酰被人们作为检测啤酒受细菌污染指标。
五十年代中期Kockov a K ratochviyovo 和Burg er 等[1]证明在不考虑啤酒有害菌污染的情况下,双乙酰的产生是由发酵过程中酵母的生理变化引起的。
从那时起酿造学者对双乙酰研究的注意力从细菌污染转移到酵母的生理特性上。
大约在六十年代,人们通过对啤酒风味物质的分析,逐渐认识到产生/生酒味0的主要成份是连二酮(双乙酰和2,3-丁二酮)、醛类以及硫化物等,其中以双乙酰最为重要。
双乙酰的形成与消除几乎成了促进啤酒成熟以及缩短发酵周期的核心问题。
七十年代中期,人们进行了一系列研究,已经揭示了酵母产生和还原双乙酰的机理,开发出新的发酵及啤酒成熟技术,有力地推动啤酒工业的发展。
从八十年代以来,微生物工程、酶工程、基因工程等现代生物工程技术应用于啤酒酿造过程的双乙酰的控制,已得到显著的进展。
1 微生物工程抗生素工业微生物筛选育种方面的成功,启示着啤酒中双乙酰问题首先从酵母筛选育种入手,啤酒酿造研究人员在以下方面进行这项工作。
1.1 缬氨酸、异亮氨酸营养缺陷型酵母的筛选。
井上乔等[7]研究实验证明缬氨酸能通过反馈抑制A -乙酰乳酸的生成来影响双乙酰的生成。
所以,为防止发酵过程双乙酰生成量过多而要求麦汁中有足够的A -氨基氮。
实验 啤酒中双乙酰的测定
实验啤酒中双乙酰的测定一、实验目的了解双乙酰的测定方法，监测啤酒质量。
二、实验原理双乙酰(丁二酮)是赋予啤酒风味的重要物质。
但含量过大，能使啤酒有一种馊饭味。
轻工部部颁标推规定成品啤酒中双乙酰含量＜0．"2ppm。
双乙酰的测定方法有气相色谱法、极谱法和比色法等等。
邻苯二胺比色法是连二酮类都能发生显色反应的方法，所以，此法测得之值为双乙酰与戊二酮的总量，结果偏高。
但此法快速简便，是轻工部部颁标准规定的方法。
用蒸汽将双乙酰从样品中蒸馏出来，加邻苯二胺，形成2，3—二甲基喹喔琳，其盐酸盐在335nm波长下有一最大吸收峰，可进行定量测定。
三、实验仪器与试剂(1)紫外分光光度计。
(2)双乙酰蒸馏装置双乙酰蒸馏装置示意图1、夹套蒸馏器2、"蒸汽发生器3、"冷凝器4、"25mL容量瓶（或量筒）5、"加样口6、"电炉(1)4N盐酸(2)1％邻苯二胺精密称取分析纯邻苯二胺250."0mg，溶于4N盐酸中，并定容至25mL，贮于棕色瓶中，限当日使用。
（3）消泡剂有机硅消泡剂或甘油聚醚。
四、实验步骤(1)按上图把双乙酰蒸馏器安装好，把夹套蒸馏器下端的排气夹子打开。
(2)将内装2."5mL蒸馏水的容量瓶(或量筒)放于冷凝器下，使出口尖端浸没在水面下，外加冰水冷却。
(3)加热蒸汽发生器至沸，通汽加热夹套，备用。
(4)于100mL量筒中加入2~4滴消泡剂，再注入5℃左右未除气啤酒100mL。
(5)待夹套蒸馏器下端冒大汽时，打开进样口瓶塞，将啤酒迅速注入蒸馏器内，再用约10mL蒸馏水冲洗量筒，同时倒入，迅速盖好进样口塞子，用水封口。
(6)待夹套蒸馏器下端再次冒大汽时，将排气夹子夹住，开始蒸馏，到馏出液接近25mL时取下容量瓶，用水定容至25mL，摇匀(蒸馏应在3分钟内完成)。
(7)分别吸取馏出液10mL于两支比色管中。
一管作为样品管加入0."5mL邻苯二胺溶液，另一管不加作空白，充分摇匀后，同时置于暗处放置20~30分钟，然后于样品管中加2mL4N盐酸溶液，于空白管中加2."5mL4N盐酸溶掖，混匀。
啤酒中双乙酰
啤酒中双乙酰
2.3一戊二酮，在啤酒中的味觉值约为0.6－ 0.9ppm，一般对啤酒口味的影响不大，且在正 常啤酒中双乙酰和2.3一戊二酮之比约3-6：1
联二酮在啤酒中 的 标准值为〈0.1mg/L 联二酮的含量是啤酒成熟的标志，随着主酵期 和后酵期的缩短，双乙酰含量的测定越来越重要。
啤酒中双乙酰
2——吸光度与双乙酰含量的换标系数
现代啤酒厂对氧的控制目标
浊〕； 现代啤酒厂对氧的控制目标
②多酚的氧化使啤酒颜色加深；
③使啤酒形成涩味、后苦味和辛辣味。
啤酒中的氧
2〕促进啤酒胶体混浊： 麦汁和啤酒中含有大量的有硫基的蛋白质
和多肽，它们被氧化后形成双硫键，促进 了蛋白质和多酚的聚合，形成混浊物质。 3〕使双乙酰上升 在啤酒中含有的α—乙酰乳酸在O2存在时 易氧化成双乙酰。
啤酒中双乙酰
5〕计算： X=A335×1.2
式中：X——试样中双乙酰含量mg/L A335——试样在335nm波长下，用
2cm比色皿测得的吸光度 1.2——吸光度与双乙酰含量的换
标系数 结果表示至两位小数，同一样品平行测
啤酒中双乙酰
2. 色谱法：
啤酒中的氧
一.概述：
在啤酒生产过程中，除了发酵初期O2有利于酵 母细胞的合成外，在其它酿造过程中O2和氧化为 啤酒的头号敌人，氧在啤酒中的作用分布如下：
小于0.
①多酚的氧化、聚合会使啤酒的非生 结果表示至两位小数，同一样品平行测定值之差不应超过0.
3一戊二酮之比约3-6：1
* 取25ml容量瓶承受馏出液，容量瓶内装少许蒸馏水，使馏出液管口能刚好浸在水下。
物 稳 定 性 下 降 〔 即 使 啤 酒 形 成 胶 体 混 * 在335nm处，用2cm比色皿，以管2作参比溶液，测定吸光度。
啤酒中双乙酰含量的测定
1.仪器
紫外分光光度计 双乙酰蒸馏器（蛇形冷凝管） 蒸汽发生器 移液管 容量瓶25ml 比色管50ml
2.试剂
* 盐酸溶液：〔C（HCI）=4mol/L〕。取333ml浓
盐酸，搅拌下注入约500ml水中，稀释至1000ml， 摇匀，放置冷却。
* 邻苯二胺溶液：（1%）。溶250.0mg邻苯二胺于 4mol/L盐酸中，用4mol/L盐酸稀释至25.00mห้องสมุดไป่ตู้， 使用当天配制，贮于暗处。
* 消泡剂：甘油聚醚或有机硅消泡剂。
3.操作
1.样品的采集制备 2.样品的测定 将双乙酰蒸馏器安装好，加热蒸汽发生瓶，使水至沸。通汽
预热后，置25mL容量瓶于冷凝器出口接受馏出液，外加冰 浴冷却，加2～4滴消泡剂于100mL量筒中，再注入未经除 气的预先冷至5℃左右的酒样100mL，迅速移入已预热的蒸 馏器内，并用少量水冲洗带塞漏斗，盖塞。然后用水封口， 进行蒸馏，直至馏出液接近25mL(蒸馏需在3～5min内完成) 时取下容量瓶，达到室温用水定容，摇匀。 测样前先用待测样品润洗比色皿2～3次。分别吸取馏出液 10.0mL于两支干燥的比色管中，并于第一支管中加入邻苯 二胺溶液0.5mL，第二支管中作空白实验，充分摇匀后，同 时置于暗处放置20～30min，然后向第一支管中加4mol/L盐 酸溶液2mL，向第二支管中加入4mol/L盐酸溶液2.5mL，混 匀后在335nm波长下，用20mm玻璃比色皿，以空白调仪器 零点，测定其吸光度。比色测定操作须在20min内完成。
4.数据处理
X=A335×1.2
式中：X——试样中双乙酰含量mg/L
A335——试样在335nm波长下，用2cm比 色皿测得的吸光度
1.2——吸光度与双乙酰含量的换标系数
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酿造过程中双乙酰的控制及检测方法
一：什么是双乙酰
双乙酰是2.3丁二酮和2.3戊二酮的统称
但由于2.3丁二酮的风味阈值远远低于2.3戊二酮，所以平时我们所说的双乙酰的含量为2.3丁二酮的量。
双乙酰具有不愉快的馊饭味，是判断啤酒是否成熟的重要标志之一。
二：酿造过程中双乙酰的产生途径
1.葡萄糖通过EMP途径转化为丙酮酸
2.丙酮酸转化为α—乙酰乳酸（双乙酰的前驱物质）
3.α—乙酰乳酸非酶氧化形成双乙酰
由此我们可以得出双乙酰的产生是在酵母利用麦汁中的糖分进行发酵的过程中产生，要控制双乙酰的产生量主要是要控制双乙酰的前驱物质α—乙酰乳酸的产生量。
三：双乙酰的还原途径
1.双乙酰被酵母吸收在酵母中酶的作用下还原成乙偶姻
2.乙偶姻在酵母体内继续还原成2，3丁二醇
由此我们可以看出双乙酰虽然通过酵母在发酵时糖代谢的过程中产生，但是也酵母在发酵的后期也可以还原双乙酰，而且在整个啤酒酿造的过程中双乙酰的还原只能通过酵母中的一种酶进行还原。
所以要降低啤酒中双乙酰的含量还可以用加速双乙酰还原来进行控制。
四：双乙酰代谢的控制
1.降低前驱物质α—乙酰乳酸的产生量
措施：改良酵母菌种
提高麦汁中α-氨基氮含量，可以抑制合成酶的活性
2.加速双乙酰的还原
措施：提高酵母的细胞密度（增大酵母的接种量）
提高还原温度（封罐后高温还原）
限制后期酵母的出芽率（封罐）
五：国标中对于啤酒中双乙酰的量的要求
二级啤酒：0.20mg/l 一级啤酒0.13mg/l
六：双乙酰的检测方法（邻苯二胺显色法）
1.原理
用蒸汽将双乙酰蒸馏出来，与邻苯二胺反应，生成2.3-二甲基喹喔啉，在波长335nm下测量其吸光度。
2.仪器
带有加热套管的双乙酰蒸馏器
蒸汽发生瓶（2000ml或3000ml）或者锥形瓶，平底烧瓶
容量瓶25ml
紫外分光光度计，备有20mm的石英比色皿或10mm的石英比色皿
3.试剂和溶液
盐酸溶液（4mol/l）
邻苯二胺溶液：10g/l（称取邻苯二胺0.1g用盐酸溶液溶解并定容至10ml摇匀，放于暗处，注意此溶液即用即配）
有机硅消泡剂（或甘油聚醚）
4.分析步骤
将双乙酰蒸发器安装好，加热蒸汽发生瓶至沸，通气预热后，置25ml容量瓶于冷凝器出口接收馏出液，加1-2滴消泡剂于100ml量筒中，在注入未经除气已降温至5℃的啤酒样，迅速转移至蒸馏器内，并用少量的水冲洗带塞漏斗，盖塞。
然后用水密封进行蒸馏，直至流出液接近25ml（蒸馏须在三分钟内完成）时取下容量瓶，达到室温后用重蒸水定容，摇匀。
5.显色与测量
分别吸出馏出液于两只干燥的比色管中，并于第一只中加入0.5ml邻苯二胺溶液0.5ml，第二支不加做空白，充分摇匀后同时放入暗处放置20-30分钟，然后于第一支管中加入2ml
盐酸溶液，第二支管中加入2.5ml盐酸溶液，混匀后用20mm（或10mm）的石英比色皿于波长335nm下，以空白做参比，测定其吸光度（比色需在20分钟内完成）
6.结果计算
双乙酰含量（mg/l）=试样在335nm下用20mm石英比色皿的吸光度*1.2（用20mm石英比色皿时，吸光度与双乙酰的换算系数）
注：若用10mm的石英比色皿则换算系数则为2.4。