DNA LADDER 的检测

细胞凋亡的检测方法——DNA ladder的检测
细胞凋亡是指由于细胞内部程序激活而发生的自杀性死亡，是增殖的淋巴细胞被清除的主要方式，是由生理或病理信号引发的自主性的细胞清除过程。

生物体内细胞在特定的内源和外源信号诱导下，其死亡途径被激活，并在有关基因的调控下发生的程序性死亡，为程序性死亡过程的一种主要形式，强调的是形态学上的改变。

它涉及染色质凝聚和外周化、细胞质减少、核片段化、细胞质致密化、与周围细胞联系中断、内质网与细胞膜融合，最终细胞片段化形成许多细胞凋亡小体，被其他细胞吞入。

通过死亡信号诱发的受调节的细胞死亡过程, 是细胞生理性死亡的普遍形式。

凋亡过程中DNA发生片段化，细胞皱缩分解成凋亡小体，被邻近细胞或巨噬细胞吞噬，不发生炎症。

根据细胞凋亡过程中细胞发生的各种变化，从而有了针对各种症状的检测方法和手段。

如针对形态学上的变化，从而产生的形态学的检测方法。

运用光学显微镜，倒置显微镜，荧光显微镜，共聚焦激光扫描显微镜，透射电子显微镜观察细胞形态的变化。

由于细胞凋亡过程中出现的一些特异性的分子结构变化，也产生出了针对这些变化的检测方式。

如细胞凋亡过程中，细胞膜的磷脂酰丝氨酸会从膜内层翻出，因此，通过检测细胞表面的磷脂酰丝氨酸残基，也能反应出细胞正在凋亡或者已经凋亡。

其他的方法，如线粒体膜势能的检测，以及caspase酶活性的检测，等等这些方法都是基于细胞凋亡过程中的信号转导机制所产生的应对特定的信号分子的检测方法。

我觉得以上所述的这些方法都各自有其优缺点。

有时，仅仅运用一种方法也不能肯定的判断细胞是否发生凋亡。

这种情况下，大多需要用运用其他方法进一步来验证作为补充，以得到肯定的结果。

在众多检测细胞凋亡的方法中，我个人比较倾向于生化方法，也就是DNA分子片段的检测。

细胞凋亡时主要的生化特征是其染色质发生浓缩, 染色质DNA在核小体单位之间的连接处断裂, 形成50~300kbp长的DNA大片段, 或180~200bp整数倍的寡核苷酸片段, 在凝胶电泳上表现为梯形电泳图谱(DNA ladder)。

细胞经处理后，采用常规方法分离提纯DNA，进行琼脂糖凝胶和溴化乙啶染色，在凋亡细胞群中可观察到典型的DNA ladder。

如果细胞量很少，还可在分离提
纯DNA后，用32P-ATP和脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）使DNA标记，然后进行电泳和放射自显影，观察凋亡细胞中DNA ladder的形成。

以下是通过琼脂糖凝胶电泳来区分DNA条带的protocols。

运用电泳技术能够很明显地区分细胞是否发生凋亡，并且能与细胞坏死（坏死细胞的DNA断裂点为无特征的杂乱片断）区别开来。

（一）琼脂糖凝胶电泳
1、常规的琼脂糖凝胶电泳
方法一
Western blot 分析Procaspase-3的活化，以及活化的Caspase-3及对底物多聚（ADP-核糖）聚合酶[poly（ADP-ribose）polymerase，PARP]等的裂解。

（1）收集细胞（5×106）1000r/min，离心5min，去上清。

（2）PBS洗一次，1000r/min，离心5min，去上清。

（3）加细胞核裂解液500μl重悬细胞，50℃水浴，3～5h，不时振摇或37℃过夜。

（4）加0.5ml平衡酚抽提，上下颠倒几次混匀，6000r/min，离心5min。

（5）上清移至另一Ep管，加0.5ml氯仿：异戊醇抽提，上下颠倒几次混匀，6000r/min，离心5min。

（6）上清移至另一Ep管，加50μl的3mol/L乙酸钠和2ml预冷无水乙醇，上下颠倒几次混匀，可见絮状白色沉淀物。

（7）置液氮5～10min，12 000r/min离心10min沉淀DNA，去上清，真空抽干或风扇下吹干残存液体。

（8）加50～100μl TE缓冲液，另加5μl RNase，37℃水浴30min。

（9）取20μl加上样缓冲液2～5μl，1％琼脂糖凝胶电泳（电压50V，1.5～2h），UV下观察。

方法二
（1）离心收集细胞（5×106），PBS（无Ca2＋和Mg2＋）洗1～2次。

（2）0.5ml TBE溶液重悬，37℃孵育30min。

（3）1mg/ml蛋白酶K 37℃处理30min。

（4）加入上样缓冲液0.1ml。

（5）25μl上样，1.5％的琼脂糖凝胶上电泳，2V/cm 6h。

方法三
（1）收集细胞悬液（106细胞），低速离心（1000r/min，离心5min）。

（2）去上清，沉淀加0.4ml低渗缓冲液作用1h。

（3）13 000r/min，离心10min，将上清转移至另一Eppendorf管中，加等量50％异丙醇和0.5mol/L NaCl混匀，置液氮5min。

（4）12 000r/min，离心10min，弃上清，沉淀真空抽干。

（5）加TE 100μl，65℃加热10min，取20μl，加1～2μl上样缓冲液，电泳观察。

方法四
（1）收集细胞，1000r/min离心5min，去上清。

（2）用冰预冷的70％乙醇固定，可长期保存于－20℃冰箱。

（3）1000r/min离心5min，去除固定液，用约0.5ml的PBS重悬细胞。

（4）转入Eppendorf管中，同法离心，去上清。

（5）细胞用40μl PC缓冲液重悬，室温30～60min。

（6）1000r/min离心5min，吸上清于新的Eppendorf管中，真空浓缩15min。

（7）加入0.25％NP-40溶液3μl，1mg/ml RNase A溶液3μl，37℃，30min。

（8）加入3μl蛋白酶K，37℃，30min。

（9）加入12μl样品稀释液，含溴化乙锭的1.5％琼脂糖电泳，观察。

2、琼脂糖凝胶电泳的定量检测
方法一：简易末端标记法
（1）按常规提取细胞DNA。

（2）在0.5ml的EP管中加入细胞DNA，反应体系如下：细胞DNA 0.5～1.0μg，10×缓冲液2μl，32P-dATP（或-dCTP）0.5μCi，Klenow聚合酶5U，双蒸水加至20μl。

（3）混匀后稍加离心，室温反应30min。

（4）加1μl 0.5mol EDTA终止反应。

（5）常规酚/氯仿/异戊醇抽提1次，无水乙醇沉淀DNA，真空抽干。

（6）溶于20μl的TE缓冲液中。

（7）取标记DNA在1.8％琼脂糖凝胶上点样，50V电泳约2h。

（8）电泳后的凝集置滤纸上烘干，进行放射自显影。

方法二：5’末端32P标记法
细胞DNA的提取
（1）细胞悬液离心后，沉淀加消化缓冲液0.5ml，50℃3～5h，或37℃过夜。

（2）用等体积的酚：氯仿：异戊醇抽提细胞裂解液。

（3）将水相转移至新的试管，加入150mmol/L乙酸钠和10mmol/L氯化镁。

（4）加入2倍体积的预冷无水乙醇，置液氮5min或－20℃12h。

（5）12 000r/min离心沉淀DNA，70％乙醇洗1次后，真空抽干。

（6）溶于20μl的TE缓冲液中。

（7）加入终浓度为10μg/ml RNase，37℃，30min。

（8）同法用等体积酚：氯仿：异戊醇抽提，乙醇沉淀，真空抽干。

（9）溶液20μl的TE缓冲液中，－20℃保存备用。

DNA含量测定：用260nm波长紫外分光光度计：吸光单位为20时约为1mg/ml DNA。

3、DNA 5’末端脱磷酸
（1）取纯化的细胞DNA 10μg，然后加入：10×CIP 2μl（1U），双蒸水加至50μl。

（2）37℃水浴2h。

（3）90℃水浴5min以灭活CIP。

（4）用等体积酚：氯仿：异戊醇抽提，乙醇沉淀，真空抽干。

4、DNA 5’末端32P标记
（1）将脱磷酸样品DNA置冰浴上，再加双蒸水10μl，10×缓冲液2μl，T4多核苷酸激酶10U，32P-ATP 740kBq（20μCi），双蒸水加至20μl。

（2）混合后，37℃水浴60min。

（3）加入1μl的0.5mol/L EDTA，90℃灭活5min。

5、观测
（1）取一定量的标记DNA稀释后在1.8％琼脂糖凝胶上点样，50V电泳约2h。

（2）电泳后的凝胶置滤纸上烘干，进行放射自显影。

（3）含32P标记DNA电泳干凝胶进行同位素液闪测定，计算放射活性。

6、结果判断：
正常活细胞DNA 电泳出现阶梯状（LADDER）条带；坏死细胞DNA电泳类似血抹片时的连续性条带。

运用这种生物化学的方法直接检测DNA在细胞凋亡中的变化，我觉得更为直接以及有效。

因为DNA是细胞中最根本的物质，如果DNA发生了质的
变化，细胞也不在是原来的细胞了，这一点应该能最大把握地检测到细胞是否发生凋亡。

当然，在实际检测中，我们往往希望通过共同运用多种实验手段来检测细胞的凋亡与否，这样才能获得完全肯定的判断。