多糖单糖组成和甲基化步骤
多糖单糖组成和甲基化步骤
4、单糖组成分析样品的水解乙酸醋酐吡啶甲苯氯仿所需试剂 TFA(三氟乙酸) 甲醇 NaBH4取5mg多糖样品，置于5ml安培管中，加入2mol/L TFA4ml，在110℃下水解2h。
水解完毕后，冷却，溶液于40℃减压浓缩加入3ml甲醇蒸干，重复操作4-5次以除尽TFA。
将完全水解后的样品溶于3ml蒸馏水，加30mgNaBH4,室温下还原3h，期间震荡几次，然后用25%乙酸中和过量的NaBH4，至溶液不再产生气泡为止。
PH应在4-5之间，加甲酸多次，减压蒸干以除去反应副产物及水分，至瓶壁上基本不附固体大颗粒为止，然后置于真空干燥器中过夜。
次日，于110℃烘箱中加热15min，充分除去残留的水分后，加3-5ml醋酐和3ml吡啶，密塞，100℃下反应1h，冷却，加甲苯多次共蒸除去多余醋酐，真空干燥。
将乙酰化产物用适量氯仿溶解，经等体积蒸馏水洗涤次，无水硫酸钠干燥，浓缩至小体积（约0.1ml）后直接进行气相色谱分析。
GC（气相色谱）条件∶载气N2流速20ml∕min，H2流速30ml∕min，空气流速200ml∕min；柱温230℃，检测器温度250℃，气化室温度280℃。
5、糖残基连接方式的确定所需试剂 DMSO NaOH 碘甲烷氮气乙酸甲酸甲醇三氟乙酸 NaBH4 5.1甲基化将样品置于干燥器中80℃处理5h以上，然后置于含有P2O5的真空干燥器中过夜。
分别取18mg干燥后的多糖置于甲基化反应瓶中，加入4ml干燥的DMSO 后超声处理30min使样品完全溶解，然后快速加入20mg预先干燥的NaOH粉末，超声2h使NaOH粉末完全溶解，冰浴甲基化反应瓶5min至反应完全冻结。
取出反应瓶，用移液管分别缓慢加入0.6ml干燥的碘甲烷至冻结的反应完全溶解，充入氮气，再分别超声处理反应液1h。
然后分别加入1ml蒸馏水至反应瓶中使甲基化反应结束。
再加入1mol∕L的乙酸中和反应液。
流水透析至反应液颜色转为无色，冷冻干燥，红外检测多糖羟基是否完全甲基化，若没有则需重复上述操作。
二维核磁共振谱在多糖结构研究中的应用_李波
二维核磁共振谱在多糖结构研究中的应用李 波1,2＊,陈海华2,许时婴2(1.河南科技学院食品学院,新乡453003;2.江南大学食品学院,无锡214036)摘 要:二维核磁共振谱(2D NMR )是获取多糖结构信息,尤其是在多糖序列分析方面的有力工具。
本文重点介绍了在多糖结构解析中常用的几种2D NMR 谱以及2D NM R 解析多糖结构的方法。
关键词:核磁共振;二维核磁共振;多糖;结构中图分类号:O65 Application of Two Dimension Nuclear Magnetic Resonance in the StructuralDetermination of PolysaccharideLI Bo 1,2＊,C HE N Hai -hua 2,XU Shi -ying 2(1.Food School ,Henan Institute of Science and Technology ,Xinxian g 453003,China ;2.School of Food Science and Technology ,Southern Yangt ze Univers ity ,Wuxi 214036,China )A bstract :Two dimension nuclear magnetic resonance (2D NMR )is a powerful tool acq uiring structural information of pol ysac -charide ,especiall y in the sequence analysis of polysaccharide .Several 2D NM R spectra often used in polysaccharide structural analysis and the method for studying polysaccharide structure usin g 2D NMR are introduced in this paper .Key words :nuclear magnetic resonance ;2D NMR ;polysaccharide ;structure 天然产物研究与开发 2005 Vol .17 No .4NA TUR AL PROD UCT RESEARCH AND DEVELOP M ENT 收稿日期:2004-04-06 接受日期:2004-05-12 ＊通讯作者Tel :86-373-3040977;E -mail :libowuxi @yahoo .co m .cn 近年来,多糖类化合物由于具有多方面的功能性质,因而成为研究领域的一个热点,多糖的结构及其构效关系也越来越引起人们的重视。
多糖甲基化步骤
多糖甲基化步骤
嘿，咱今儿就来讲讲多糖甲基化步骤这个事儿哈！
你想想看，多糖就像是一群小伙伴手拉手站在一起，而甲基化呢，
就像是给这些小伙伴穿上了特别的小外套。
那这小外套怎么穿上去的呢？
首先啊，得把多糖准备好，就像给小伙伴们排好队一样。
然后呢，
就要请出能让甲基化发生的那些家伙们啦！这就好比一场魔法，需要
特定的魔法道具和魔法师来施展。
在这个过程中，每一步都很关键呢！就像走钢丝一样，稍有偏差可
能就前功尽弃啦。
比如说，要是添加甲基的时机不对，那可就糟糕了，就好像给小伙伴穿外套穿错了时间，那不是乱套了嘛！
而且哦，这个甲基化的步骤还得很精细，不能马虎。
这就跟做一件
精美的工艺品似的，得用心、仔细地去雕琢。
你说要是随随便便搞一下，能行么？那肯定不行呀！
这多糖甲基化步骤可真是个神奇又有趣的过程呢。
你看，通过这一
系列的操作，多糖就有了新的特性和功能。
这就好像原本普普通通的
小伙伴，一下子变得特别厉害、有本事了！
你再想想，要是没有这些精确的步骤，多糖能变得这么特别吗？肯定不能呀！所以说呀，这每一步都得认认真真地对待，不能有丝毫的懈怠。
那在实际操作中，可得小心再小心哦。
一个不小心，可能就全白费功夫啦！这多可惜呀，就跟辛苦搭好的积木一下子全倒了一样。
总之呢，多糖甲基化步骤是个既重要又有趣的事儿，咱可得好好研究研究，把它搞清楚，搞明白！这样才能更好地利用它，让它发挥出更大的作用呀！你说是不是这个理儿？。
花青素糖基化、甲基化修饰的研究现状
花青素糖基化、甲基化修饰的研究现状一、概述花青素是一种广泛存在于植物中的天然色素，具有丰富的生物活性和抗氧化作用。
近年来花青素的研究引起了科学家们的高度关注，特别是在糖基化和甲基化修饰方面取得了显著的进展。
本文将对花青素糖基化和甲基化修饰的研究现状进行综述，以期为花青素的功能性研究提供理论依据和实验指导。
糖基化是生物体内蛋白质和多肽的重要修饰方式，通过与糖分子结合，可以影响蛋白质的结构、功能和稳定性。
花青素作为一种天然色素，其结构和功能与其糖基化修饰密切相关。
研究表明花青素的糖基化修饰主要包括羟基化、酰基化、酰胺化等类型，这些修饰方式会影响花青素的抗氧化活性、细胞信号传导途径以及生物学功能。
此外花青素的糖基化修饰还受到多种酶的影响，如糖基转移酶、磷酸化酶等，这些酶的调控对于花青素的糖基化修饰具有重要意义。
甲基化是生物体内DNA的一种重要修饰方式，通过添加甲基基团(CH,可以改变DNA的碱基序列和结构。
甲基化的DNA可以影响基因的表达水平、转录后修饰等生物学过程。
近年来研究发现花青素也可以通过甲基化修饰影响基因的表达，从而调控花青素相关的生物学功能。
例如花青素甲基化修饰可以影响植物对环境胁迫的反应，提高植物的抗逆性和适应性。
此外花青素甲基化修饰还可以影响植物生长发育、开花时间等生理过程。
花青素糖基化和甲基化修饰的研究现状为深入了解花青素的功能机制提供了重要的理论基础和实验依据。
随着研究的不断深入，相信未来会有更多关于花青素糖基化和甲基化修饰的新发现和技术应用。
1. 背景介绍：花青素是一种天然的色素，具有多种生物活性和保健功能花青素(Anthocyanin)是一类广泛存在于植物中的水溶性色素，包括红、蓝、紫等颜色。
它们在自然界中分布广泛，如水果、蔬菜、茶叶、葡萄酒等。
花青素不仅具有美丽的颜色，还具有多种生物活性和保健功能，因此受到了广泛关注。
近年来花青素的研究已经成为了生命科学领域的热点之一。
花青素的主要存在形式是糖苷配基，这些配基可以与蛋白质、多糖等大分子结合。
dna甲基化的过程和机制
dna甲基化的过程和机制
DNA甲基化的过程和机制如下：
DNA甲基化是指在DNA分子的特定位置上添加甲基基团，甲基化后的DNA序列可能发生某些改变，比如可以调节基因的表达等。
甲基化的机制主要涉及到DNA甲基转移酶（DNMT）的作用。
DNMTs是一类能够将甲基基团从S-腺苷甲硫氨酸（SAM）转移到DNA分子上的酶，是DNA甲基化过程的主要参与者。
在DNA甲基化过程中，DNMT首先将SAM转化为活性中间体，然后将活性中间体的甲基基团转移到DNA分子上。
DNA甲基化的过程可以分为以下几个步骤：
识别和结合：DNMT首先识别DNA分子上的特定序列，通常是富含胞嘧啶的区域。
识别后，DNMT结合到DNA分子上，形成一个复合体。
甲基化反应：在复合体中，SAM的甲基基团被转移到DNA分子上，通常是胞嘧啶残基的5位碳原子上。
这个过程涉及到化学键的转移，需要消耗能量。
释放和去甲基化：完成甲基化反应后，DNMT从DNA分子上释放下来，留下甲基化的DNA序列。
在某些情况下，甲基化的DNA序列可以被去甲基化，即甲基基团被去除，恢复到未甲基化的状态。
去甲基化的过程通常涉及到特定的去甲基化酶的作用。
总之，DNA甲基化是一种重要的表观遗传修饰方式，可以影响基因的表达和功能。
了解DNA甲基化的过程和机制有助于深入理解生物
学和医学中的许多问题，包括发育、疾病和治疗方法等。
多糖的结构研究
苷键的构型有关。一般呋喃糖苷键较吡喃型易水解 ,
水解试剂的不同会影响水解条件。水解之后的多糖经中和、 过滤 , 可采 用纸层析 ( PC) 、 薄 层层析 ( T L C) 、 气相 色谱法( GC) 、 液相色谱法 ( HPL C) [ 8] 和离子色谱 法 [ 9] 进行分 析。多糖水 解产生 物的 GC 分析 , 通常 是先经 衍 生化处理成易挥发组成分 , 常采用的衍生化方 法是硅烷基化和乙酰化处理。高效液相色谱法则 克服了 G C 需 衍生化的缺陷 , 它可直接进样测定。同样离子色谱法不 需要衍生处理 , 而且检测灵敏度甚至比 HPLC 法更高。 离子色谱法的原理是将样品经强碱性物质离子化后 , 通 过离子色谱柱经脉冲安培检测器检测。 ) 部分 酸水 解 : 利用多糖链中部分糖苷键如呋喃型糖苷键 、 位于链末端的糖苷键和支链上的糖苷键易水解脱落 , 而构成糖 链的主链重复结构的部分和糖醛酸等对酸水解则相对稳定的特点 , 对多糖常采用部分酸水解法处理。多糖经 部分酸水解后 , 经醇析、 离心 , 将上清液和沉淀分别进行 分析。多 糖部分酸水解之后的醇析产物往往是多糖的 主链重复性结构片段、 糖醛酸链片段 , 从这些小片段可以推测多糖链的一些结构特点。 ) 乙酰解 : 将多 糖与
第2期
周
鹏等 : 多糖的结构研究
199
乙酐、 冰醋酸、 浓硫酸等混合反应 , 可得到乙酰化单糖 , 目的也是用于单 糖组成分析。 点在于半缩醛被保护起来 , 使异构体物减少 , 有利于分辨。
) 甲 醇解 : 利用 HCl-
CH 3OH 溶液把多糖的半缩醛甲基化 , 形成甲基糖甙后再经衍生或不衍生进 行 GC 或 HPL C 分析 , 甲醇解 的优 高碘酸氧化法 : 高碘酸可以选择性的氧化 断裂糖分子中的连二羟基或连三羟基处 , 生成相应的 多糖醛、 甲 酸 , 反应定量地进行。每开裂一个 C- C 键消耗一分子高碘酸 , 通过测定高碘酸的消耗 量和甲酸的 生成量 , 可 以判断糖苷键的位置、 连接方式、 支链状况和聚合度等结构信息。以葡萄糖为例 , 以 1 2 或 1 成一分子甲酸 ; 以 1 时需做空白试验。 Smith 降解 : Smit h 降解是将 高碘酸氧化产物还原后 进行酸 水解或 部分水解。 由于糖 基之间以 不同的 位 置缩合 , 用高碘酸氧化后则生成不同的产物 , 由降解产物来 获取多糖的 结构信息。以 1 糖基为例 , 其高碘酸氧化、 Smit h 降解反 应如图 2。 4、 1 6 糖苷键的 己 4 键合 的葡萄 糖基经高碘酸氧化后 , 每糖基消耗一分子高碘 酸 , 无甲酸生成 ; 而 1 6 键合的葡萄糖基消耗二分子高碘酸 , 生 3 键合的糖基不被高碘酸氧化。高碘酸的氧化反应必须在控制的条件下进行 , 以避免副 反应的产生 ( 超氧化反应 ) 。一般使多糖与最小量的高碘酸 反应 , 溶液 pH 值控制在 3- 5, 且应 避光、 低温 , 同
多糖单糖组成和甲基化步骤
4、单糖组成分析样品的水解乙酸醋酐吡啶甲苯氯仿所需试剂 TFA（三氟乙酸）甲醇 NaBH4取5mg多糖样品，置于5ml安培管中，加入2mol/L TFA4ml，在110℃下水解2h。
水解完毕后，冷却，溶液于40℃减压浓缩加入3ml甲醇蒸干，重复操作4-5次以除尽TFA。
将完全水解后的样品溶于3ml蒸馏水，加30mgNaBH4，室温下还原3h,期间震荡几次，然后用25%乙酸中和过量的NaBH4，至溶液不再产生气泡为止。
PH应在4-5之间，加甲酸多次,减压蒸干以除去反应副产物及水分，至瓶壁上基本不附固体大颗粒为止，然后置于真空干燥器中过夜。
次日,于110℃烘箱中加热15min，充分除去残留的水分后，加3—5ml醋酐和3ml吡啶,密塞，100℃下反应1h，冷却,加甲苯多次共蒸除去多余醋酐,真空干燥.将乙酰化产物用适量氯仿溶解，经等体积蒸馏水洗涤次，无水硫酸钠干燥，浓缩至小体积(约0.1ml)后直接进行气相色谱分析.GC（气相色谱)条件∶载气N2流速20ml∕min，H2流速30ml∕min，空气流速200ml∕min;柱温230℃，检测器温度250℃，气化室温度280℃。
5、糖残基连接方式的确定所需试剂 DMSO NaOH 碘甲烷氮气乙酸甲酸甲醇三氟乙酸 NaBH4 5.1甲基化将样品置于干燥器中80℃处理5h以上，然后置于含有P2O5的真空干燥器中过夜。
分别取18mg干燥后的多糖置于甲基化反应瓶中,加入4ml干燥的DMSO 后超声处理30min使样品完全溶解,然后快速加入20mg预先干燥的NaOH粉末，超声2h使NaOH粉末完全溶解，冰浴甲基化反应瓶5min至反应完全冻结。
取出反应瓶，用移液管分别缓慢加入0。
6ml干燥的碘甲烷至冻结的反应完全溶解，充入氮气，再分别超声处理反应液1h。
然后分别加入1ml蒸馏水至反应瓶中使甲基化反应结束。
再加入1mol∕L的乙酸中和反应液。
流水透析至反应液颜色转为无色,冷冻干燥，红外检测多糖羟基是否完全甲基化，若没有则需重复上述操作。
多糖成分分析综述
多糖成分分析摘要：对多糖的提取、分离纯化、含量分析以及组分结构分析的研究进展进行了综述，并对其应用前景进行了展望。
多糖的组分分析是多糖质量控制和提供多糖基本信息的重要环节。
关键词：多糖；提取；分离纯化；表征鉴定多糖(polysaccharides,PS)又称多聚糖，由10个以上的单糖分子通过苷键聚合而成，其分子量较大，一般由几百甚至几万个单糖分子组成，是除了蛋白质和核酸以外的一类重要的生物大分子。
虽然糖类的研究并不比蛋白质和核酸晚，但其研究层次与水平还远远落后于蛋白质和核酸。
多糖在自然界高等植物、动物、藻类及细菌类内均有存在，分布极广。
有些多糖无生物活性，如淀粉、树胶和粘液质等，通常被当做杂质除去。
而具有药效作用的多糖大多是活性多糖。
1969年，日本学者千原率先证实了香菇热水提出物的抗肿瘤活性，羽田、佐木进一步研究证实有效成分是香菇多糖。
自此，全世界掀起了从真菌中提取抗肿瘤活性成分的热潮[1]。
尤其近年来，随着生物学、化学等相关学科的飞速发展，多糖化合物也得到了日益深入的研究。
国际科学界视多糖的研究为生命科学的前沿领域，甚至提出21世纪是多糖的世纪。
鉴于多糖研究所具有的学术价值和广阔的应用前景，使得多糖研究成为人们关注的研究热点之一；又目前研究比较多的是植物多糖和微生物多糖，因此本文将就植物多糖和微生物多糖的成分分析研究进行概括、总结，并就存在的问题加以展望。
1 多糖的提取多糖的提取通常要根据多糖的存在形式及提取部位不同决定其提取方法。
一般从植物中提取多糖，先用石油醚、乙醚、丙酮等有机溶剂进行预处理，除去脂溶性杂质[1]。
然后根据不同的溶解度选择一种溶剂进行萃取，常用的为水、稀盐、稀酸、稀碱等溶剂。
传统的提取方法有水提醇沉法、稀碱浸提法、稀酸浸提法和酶法等，随着对多糖研究的不断深入，又出现超滤法、微波辅助浸提法以及超声波法等等。
1.1 溶剂提取法溶剂提取法是提取多糖的常用方法，利用多糖不溶于乙醇的性质在提取液中加入乙醇使多糖沉淀出来。
多糖结构分析
一：多糖中的单糖组分分析一般对多糖进行完全水解，水解条件：封管0.5~3M硫酸或1~6M盐酸，80℃~100℃水解2.5~8h 即可。
或控制水解条件，进行逐步水解，如封管0.025M硫酸，100℃水解15min，30min，45min 等，水解液用碳酸钡或氢氧化钡中和，滤液浓缩后可用纸层析、薄层层析、气相层析或高压液相层析等鉴定。
二：相邻单糖基连接方式分析将甲基化多糖水解得到甲基化的单糖，而此单糖上甲基化之羟基所在的碳原子就是连接键所在。
高碘酸氧化是定量反应，Smith降解是将高碘酸氧化产物进行还原，酸水解或部分水解，从高碘酸的消耗量和不同产物的生成，便可进行糖苷键位置的判断-产物中若有一分子比例的甲酸生成而消耗两分子比例的高碘酸根时，表明多糖的非还原末端或非末端部分有1-6苷键相连的单糖基存在；产物中若有赤藓醇生成，则提示有1-4结合苷键；若有甘油生成，有1-6、1-2结合的苷键或有还原性末端葡萄糖基等；若产物中能检出单糖，如葡萄糖、半乳糖、甘露糖等，则有1-3苷键存在。
结合¹³C-NMR确定连接位置。
三：端基碳苷键构型分析1：酶解实验：不被淀粉酶水解的多糖，无α-苷键，与纤维素酶有作用者，存在β-苷键。
2；IR：α-型差向异构体的C-H键在844±8cm‾¹处有一个吸收峰；β-型的C-H键在891±7cm‾处有一个吸收峰。
但是，海藻糖、阿洛糖和异阿洛糖的α-型和β-型同时存在的情况下，就不能以次来判断。
3：¹H-NMR：端基碳的δ值大于5.00ppm者，糖苷键为α-型，小于5.00ppm者，则为β-型。
4；¹³C-NMR：α-型连接的C₁化学位移在97-101ppm，β-型的在103~105ppm。
对甘露聚糖不能用化学位移判断α-型或β-型。
可用裂分常数决定，一般¹Jｃ-ｈ=170HZ，为α-型，160HZ 者为β-型。
气相色谱质谱法用于糖类物质结构分析的新方法研究
ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ｅｘｃｅｐｔ ｆｏｒ ２，５·Ｍｅ２Ｇａｌ．Ｔｈｅｓｅ ＰＭＡＡｓ ｃａｎ ｂｅ ｕｓｅｄ ａｓ ＧＣ－ＭＳ ｓｔａｎｄａｒｄｓ ｆｏｒ ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｇａｌａｃｔｏｆｕｒａｎｏｉｃ ｕｎｉｔｓ ｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓ，
气相色谱质谱法用于糖类物质结构分析的新方法研究
摘要
气相色谱一质谱法（ＧＣ—ＭＳ）在糖类结构分析中具有重要作用，利用气相色 谱一质谱技术可以得到有关单糖残基的类型、糖的序列、糖环形式和羟基的取代 情况等多种结构信息，本研究开发了两种分甲基化的呋喃半乳糖醇乙酸酯标准（ＰＭＡＡｓ）——半乳糖 在无水氯化氢的催化下，与一分子甲醇作用，生成甲基半乳糖苷混合物，该混合 物经硅醚化衍生后，用气相色谱（Ｇｃ）、气相色谱一质谱研究了氯化氢浓度、反应 时间、反应温度对甲基呋喃半乳糖苷产率的影响。当氯化氢的浓度为Ｏ．００４ｍｏｌ／Ｌ， 反应温度为７０℃，反应时间为４ ｈ时，甲基呋喃半乳糖苷得率为７９．９％。在 ＢａＯ／Ｂａ（ＯＨ）２＂８Ｈ２０的催化下，甲基呋哺半乳糖苷与碘甲烷反应生成部分甲基化 的糖苷混合物，该混合物用ＴＬＣ检测（ＣＨＣｌ２：ＭｅＯＨ １０：１），结果表明：随着 反应时间的延长，甲基化程度越来越高，当反应４ ｈ后，生成了由一甲基、二 甲基、三甲基及四甲基半乳糖苷组成的混合物。该产物经水解、还原、乙酰化后， 得到部分甲基化的糖醇乙酸酯衍生物。经ＧＣ—ＭＳ分析后，根据保留时间与质谱 碎片可以确定我们合成了除２，５一Ｍｅ２Ｇａｌ外其它的部分甲基化的呋喃半乳糖醇乙 酸酯衍生物标准。该标准可用于ＧＣ．ＭＳ分析含呋喃半乳糖结构的糖复合物结构 分析的标准。
多糖结构构象及生物活性概述
析以及糖含量测定，通常选用示差检测器。
3·3·3 质谱法
•
在糖类的研究中质谱法显示出不可替代的作
用。GC-MS已广泛应用于糖组成分析和甲基化分
析，以确定糖残基连接方式。上世纪80年代各软
电离技术的诞生，如快原子轰击质谱（FAB-
MS）、电喷雾质谱（ESI-MS）、基质辅助激光
解析离子化质谱（MALDI-MS）等，使糖结构分
3·3·2 气相色谱法（GC）
•
气相色谱法主要用于单糖组成、糖醛酸种类
和组成、Smith降解产物等分析。GC具有样品用
量少、分辨率强、灵敏度高、分析速度快等优点，
然而该法需要对多糖样品进行处理，衍生成易挥
发、对热稳定的衍生物后再进行分析。液相色谱
法（HPLC）也可用于糖的分析，如多糖纯化及
其相对分子质量测定，单糖组成、糖醛酸种类分
直 链 淀 粉 的 二 级 结 构
• 1·1·3 三级和四级结构
• 多糖链一级结构的重复顺序,由于糖单位的羟 基、羧基、氨基以及硫酸基之间的非共价相互作 用,导致有序的二级结构空间有规则而粗大的构象, 即是多糖链的三级结构。多糖的四级结构是指多 聚链间非共价键结合形成的聚集体。
2 多糖结构的研究趋势
3·2·5 甲基化分析
•
甲基化分析是确定寡糖和多糖中单糖间糖苷
键位置的重要手段。其原理是：先将多糖中各种
单糖残基中的游离羟基全部甲基化，将甲基化多
糖水解得到甲基化的单糖进行衍生处理，最后用
GC-MS（气相色谱衍生物的归属，
从而确定单糖残基的连接位点。同时根据不同甲
现性好等优点，在国内外得到广泛使用。
3·2 化学降解分析方法
3·2·1 单糖组成测定
多肽甲基化方法
多肽甲基化方法多肽甲基化是一种重要的蛋白质翻译后修饰方式，它在调节蛋白质功能、细胞信号转导等方面扮演着关键角色。
本文将详细介绍多肽甲基化的方法，以供相关领域的研究者参考。
一、化学合成法化学合成法是多肽甲基化的一种常用方法。
通过在多肽合成过程中引入甲基化修饰，可以得到具有特定生物学功能的甲基化多肽。
具体步骤如下：1.设计甲基化多肽序列：根据研究需求，设计目标多肽序列，并在适当的位置引入甲基化修饰。
2.合成多肽：采用Fmoc固相合成法或其他多肽合成方法，合成目标多肽。
3.甲基化修饰：在多肽合成过程中，通过添加甲基化试剂（如S-腺苷甲硫氨酸）进行甲基化修饰。
4.纯化与鉴定：对合成得到的甲基化多肽进行纯化和鉴定，确保其纯度和结构正确。
二、生物化学法生物化学法利用酶促反应实现多肽甲基化。
以下是一种常见的生物化学法：1.表达目标多肽：通过基因工程手段，将目标多肽基因克隆至表达载体，并转化至宿主细胞进行表达。
2.酶促甲基化：在细胞裂解液或纯化的酶体系中，加入甲基转移酶和S-腺苷甲硫氨酸，使目标多肽发生甲基化修饰。
3.纯化与鉴定：对甲基化多肽进行纯化和鉴定。
三、蛋白质工程法蛋白质工程法通过对已知甲基转移酶进行突变，使其具有新的底物特异性，从而实现多肽甲基化。
具体步骤如下：1.选择合适的甲基转移酶作为模板：根据目标多肽序列，选择具有相似底物特性的甲基转移酶。
2.突变甲基转移酶：通过点突变、易位突变等方法，改变甲基转移酶的底物结合口袋，使其能够识别并甲基化目标多肽。
3.验证突变酶活性：通过体外酶活性实验，验证突变酶对目标多肽的甲基化活性。
4.甲基化多肽的纯化与鉴定：对突变酶催化得到的甲基化多肽进行纯化和鉴定。
总结：多肽甲基化方法包括化学合成法、生物化学法和蛋白质工程法。
研究者可根据实际需求选择合适的方法进行多肽甲基化研究。
甲基化和乙酰化 方法
甲基化和乙酰化方法
甲基化和乙酰化是两种常见的有机化学反应，它们分别是添加甲基基团和乙酰基团到分子中的化学反应。
下面将简要介绍这两种反应的方法：
甲基化方法：
甲基化是将甲基基团(-CH3)引入分子中的化学反应。
常见的甲基化方法包括：
1.甲基卤化反应：使用甲烷或者甲基卤化物（如碘甲烷、氯甲烷等）与亲核试剂（如碱、碱金属等）反应，生成相应的甲基化产物。
2.芳香族甲基化：芳香族化合物的甲基化通常使用芳香族底物与甲基卤化物在碱性条件下反应，生成相应的芳香族甲基化产物。
3.Friedel-Crafts甲基化：芳香族化合物与甲基卤化物在Lewis 酸（如AlCl3）的催化下发生芳香族甲基化反应。
乙酰化方法：
乙酰化是将乙酰基团(-COCH3)引入分子中的化学反应。
常见的乙酰化方法包括：
1.醋酸酐酰化：使用醋酸酐与亲核试剂（如醇、酚等）反应，生成相应的乙酰化产物。
2.酸催化的醇酰化：醇与酰氯或酸酐在酸性条件下反应，发生醇酰化反应。
3.酸催化的羧酸酯化：芳香族或脂肪族羧酸与醇反应，生成相应的酯化产物。
4.Friedel-Crafts乙酰化：芳香族化合物与乙酰卤（如乙酰氯）在Lewis酸（如AlCl3）的催化下发生芳香族乙酰化反应。
这些方法都是有机合成中常见的反应，它们在生物化学、药物化学、材料科学等领域都有广泛的应用。
多糖的甲基化方法及图谱解析
1． 1 材料 EPS159 是变形链球菌（ Streptococcus mutans） 的
菌 株 UA159 产 生 的 胞 外 多 糖 （ exopolysaccharide， EPS） ，其制备方法为： UA159 用肉汤培养基加 20%
80
天然产物研究与开发
Vol. 24
蔗糖在 37 °C 厌氧条件下培养过夜，用 4% 三氯乙酸 除去培养液中的细胞碎片、蛋白质等。离心后，上清 液中加入 2 倍体积的乙醇以沉淀出 EPS。EPS 经离 心、复溶、透析除去单糖和寡糖后，再用乙醇进行沉 淀，冻干得到多糖样品。单糖组成分析显示，该样品 仅含葡萄糖，离子交换色谱和凝胶过滤色谱显示为 单一对称峰，表明其纯度较高。
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李 波等： 多糖的甲基化方法及图谱解析
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循环，其结果与表 1 基本相同。
表 1 EPS159 的甲基化分析结果 Table 1 Methylation result of EPS159
部分甲基化的糖醇 乙酰酯 PMAA
2，3，4，6-Me4 -Glc 2，4，6-Me3 -Glc 2，3，4-Me3 -Glc 2，4-Me2 -Glc
收稿日期： 2010-12-27
接受日期： 2011-06-21
* 通讯作者 Tel： 86-373-3040777； E-mail： libowuxi@ yahoo． com． cn
和 Selvendran［4］ 对 Ciucanu 法 进 行 了 改 进，先 加 入 NaOH 使糖的羟基充分解离后，再加入碘甲烷使羟 基迅速甲基化，减少了多糖氧化降解的可能性。对 于难溶于二甲亚砜（ DMSO） 易溶于水的多糖，可将 其先用少量水溶解，再转溶于 DMSO，然后用 3A 分 子筛脱除其 中 的 水 分，再 进 行 甲 基 化 反 应［5］，但 该 法多糖用量较多。本文对微量多糖的甲基化方法进 行了研究，对甲基化产物的图谱解析等难点问题进 行了探讨，旨在为多糖工作者提供借鉴。
多糖结构方面
多糖的提取、分离纯化真菌多糖是从真菌细胞壁和组织体的菌丝之中分离出的由十个以上的单糖以糖苷键连接而成的高分子多聚物。
真菌多糖能通过对淋巴细胞、巨噬细胞、网状内皮系统而调节机体的免疫功能，在治疗肿瘤、心血管、肝炎、糖尿病，甚至爱滋病等方面显示出特殊的效果，有些已在临床上广泛应用[1]。
真菌多糖作为药物毒性极小，其在治疗代谢紊乱、感染及癌症等疾病方面的应用正不断增加，它在医疗上是一种很好的佐料。
真菌多糖其研究日益受到人们重视。
1 真菌多糖的提取、分离纯化与纯度检测1.1 真菌多糖的提取和分离提取真菌多糖的原料，应先用丙酮、乙醚或乙醇进行预处理，以除去原料中的脂类物质,然后用热水、稀酸或稀碱反复提取，提取液中和至中性后，用甲醇或乙醇沉淀，沉淀物经离心、干燥后，制得粗多糖。
1.1.1 粗多糖中蛋白的去除常用的脱蛋白的方法主要有3种：Sevag法是用氯仿、正丁醇或正戊醇按5:1混合后,加到样品水溶液中振摇，离心除去凝胶状蛋白质，反复多次直至蛋白质除尽为止。
三氟三氯乙烷法[2]是多糖溶液和三氟三氯乙烷1:1混合,在低温下搅拌10min左右,离心得上层溶液, 上层溶液继续用上述方法处理几次,即得无蛋白的多糖溶液。
三氯乙酸法是在多糖水溶液中滴加3%的三氯乙酸，直至溶液不再浑浊为止，于5～10℃放置过夜，离心除去沉淀即得无蛋白的的多糖溶液，但是此法会引起多糖的降解，不宜采用。
另外还有硫酸铵法和蛋白酶法。
1.1.2脱色多糖中所含的色素一般有两种，即游离色素和结合色素。
游离色素大多呈阴离子状态，可以通过离子交换法除去，常用DEAE纤维素或DEAE-Sepharose TM Fast Flow来吸附色素。
若多糖与色素结合，则色素易被离子交换柱吸附，不易被水洗脱，这类色素可采用氧化脱色：以浓氨水（或NaOH溶液）调至ph8.0左右，于50℃以下滴加H2O2至浅黄色，保温2h；根据真菌多糖与色素的结合情况选择合适的脱色方法[3]。
薄层快速分析多糖的单糖组成概要
干扰物质NaCl KCl Ca(NO 32葡萄糖麦芽糖果糖蔗糖酒石酸柠檬酸倍数200200200100100100100100100表 1 干扰物质的影响Table 1 Effect of foreign species 样品编号加入 (×10-5mol/L检出a (×10-5mol/L10.550.5420.760.7330.790.8240.970.98表 2 样品测定结果Table 2 Results of the determination of samples注:a 10次检测的平均值。
误差控制在±5%之内时。
因此,该电极应用于蔬菜和水果中抗坏血酸的测定将具有很好的选择性。
2.3.2样品测定为了验证该修饰电极能否在实际样品中抗坏血酸含量进行正确的测量,我们自制了几种样品。
自制样品组成为:1.0×10-4mol/L NaCl 、KCl 、Ca(NO 32、葡萄糖、麦芽糖、果糖、蔗糖、酒石酸及柠檬酸及0.5×10-5~1×10-5mol/L 抗坏血酸。
其测定结果如表2所示。
由表2可知,测定的抗坏血酸含量与已知含量基本一致。
3结论该新型的修饰电极具有极高的化学稳定性,且对溶液中的抗坏血酸具有良好的电催化作用,已成功地应用于水果中抗坏血酸含量的测定,获得了比较满意的结果,可望成为能满足不同需要的抗坏血酸传感器。
参考文献:[1] D W Martin Jr. Harper's Review of Biochemistry, 19th ed Eds: D W Martin Jr, PA Mayes, V W Rodwell. Lange, Los Altos, CA, 1983. 112.[2]胡慰望, 谢笔钧. 食品化学[M]. 北京: 科学出版社, 1992. 243.[3]黄伟坤, 等. 食品检验与分析[M]. 北京: 中国轻工业出版社, 1989.96.[4]A H Ensminger, M E Ensminger, J E Konlande, 等. 食品与营养百科全书[M]. 王淮洲, 王惟球, 王模善, 等译. 北京:农业出版社, 1989.收稿日期:2006-07-26 *通讯作者基金项目:四川省中医药管理局重点及专项项目(2003A001、2003C001作者简介:颜军(1971-,男,实验师,研究方向为生物活性成分的提取及检测。
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4、单糖组成分析
样品的水解
乙酸醋酐吡啶甲苯氯仿
所需试剂 TFA(三氟乙酸) 甲醇 NaBH
4
取5mg多糖样品，置于5ml安培管中，加入2mol/L TFA4ml，在110℃下水解2h。
水解完毕后，冷却，溶液于40℃减压浓缩加入3ml甲醇蒸干，重复操作4-5次以除尽TFA。
将完全水解后的样品溶于3ml蒸馏水，加30mgNaBH4,室温
下还原3h，期间震荡几次，然后用25%乙酸中和过量的NaBH4
，至溶液不再产生气泡为止。
PH应在4-5之间，加甲酸多次，减压蒸干以除去反应副产物及水分，至瓶壁上基本不附固体大颗粒为止，然后置于真空干燥器中过夜。
次日，于110℃烘箱中加热15min，充分除去残留的水分后，加3-5ml醋酐和3ml吡啶，密塞，100℃下反应1h，冷却，加甲苯多次共蒸除去多余醋酐，真空干燥。
将乙酰化产物用适量氯仿溶解，经等体积蒸馏水洗涤次，无水硫酸钠干燥，浓缩至小体积（约0.1ml）后直接进行气相色谱分析。
GC（气相色谱）条件∶载气N2流速20ml∕min，H2流速30ml∕min，空气流速200ml∕min；柱温230℃，检测器温度250℃，气化室温度280℃。
5、糖残基连接方式的确定
所需试剂 DMSO NaOH 碘甲烷氮气乙酸甲酸甲醇三氟乙酸 NaBH
4 5.1甲基化
将样品置于干燥器中80℃处理5h以上，然后置于含有P2O5的真空干燥器中过夜。
分别取18mg干燥后的多糖置于甲基化反应瓶中，加入4ml干燥的DMSO 后超声处理30min使样品完全溶解，然后快速加入20mg预先干燥的NaOH粉末，超声2h使NaOH粉末完全溶解，冰浴甲基化反应瓶5min至反应完全冻结。
取出反应瓶，用移液管分别缓慢加入0.6ml干燥的碘甲烷至冻结的反应完全溶解，充入氮气，再分别超声处理反应液1h。
然后分别加入1ml蒸馏水至反应瓶中使甲基化反应结束。
再加入1mol∕L的乙酸中和反应液。
流水透析至反应液颜色转为无色，冷冻干燥，红外检测多糖羟基是否完全甲基化，若没有则需重复上述操作。
5.2样品的水解
将完全甲基化的多糖样品分别溶于4ml 90％的甲酸溶液，密塞后于110℃烘箱中解聚6h。
反应结束后减压蒸干，分别加3ml甲醇重复蒸干4次，以除去过量甲酸。
然后将蒸干后的解聚样品加入4ml 2mol/L三氟乙酸的安培管中，封管后110℃水解2h后减压蒸干，重复加甲酸多次蒸干以除去过量的三氟乙酸。
再
加入3ml蒸馏水充分使样品溶解。
30mg NaBH
还原乙酰化后制得部分甲基化的乙
4
酸衍生物，氯仿-水体系萃取衍生物，回收氯仿层，减压浓缩至约0.1ml后进行GC-MS分析。
5.3 GC-MS分析
设定好GC/MS操作参数， GC-MS测试条件为：毛细管柱HP-5,程序升温50-250℃,10℃∕min，进样口温度260℃；离子源：EI；氦气流速1ml/min.。
当系统提示可以进样时，使用10 μL进样针准确吸取5 μL样品溶液（不能有气泡）加入到进样口，分析开始。
对得到的总离子流色谱图（TIC），在不同位置双击鼠标右键即得到相应的质谱图。
在质谱库中检索后，根据匹配度、置信度可确定各峰的归属。