多糖单糖组成和甲基化步骤

4、单糖组成分析

样品的水解

乙酸醋酐吡啶甲苯氯仿

所需试剂 TFA(三氟乙酸) 甲醇 NaBH

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取5mg多糖样品，置于5ml安培管中，加入2mol/L TFA4ml，在110℃下水解2h。水解完毕后，冷却，溶液于40℃减压浓缩加入3ml甲醇蒸干，重复操作4-5次以除尽TFA。将完全水解后的样品溶于3ml蒸馏水，加30mgNaBH4,室温

下还原3h，期间震荡几次，然后用25%乙酸中和过量的NaBH4

，至溶液不再产生气泡为止。PH应在4-5之间，加甲酸多次，减压蒸干以除去反应副产物及水分，至瓶壁上基本不附固体大颗粒为止，然后置于真空干燥器中过夜。次日，于110℃烘箱中加热15min，充分除去残留的水分后，加3-5ml醋酐和3ml吡啶，密塞，100℃下反应1h，冷却，加甲苯多次共蒸除去多余醋酐，真空干燥。将乙酰化产物用适量氯仿溶解，经等体积蒸馏水洗涤次，无水硫酸钠干燥，浓缩至小体积（约0.1ml）后直接进行气相色谱分析。

GC（气相色谱）条件∶载气N2流速20ml∕min，H2流速30ml∕min，空气流速200ml∕min；柱温230℃，检测器温度250℃，气化室温度280℃。

5、糖残基连接方式的确定

所需试剂 DMSO NaOH 碘甲烷氮气乙酸甲酸甲醇三氟乙酸 NaBH

4 5.1甲基化

将样品置于干燥器中80℃处理5h以上，然后置于含有P2O5的真空干燥器中过夜。分别取18mg干燥后的多糖置于甲基化反应瓶中，加入4ml干燥的DMSO 后超声处理30min使样品完全溶解，然后快速加入20mg预先干燥的NaOH粉末，超声2h使NaOH粉末完全溶解，冰浴甲基化反应瓶5min至反应完全冻结。取出反应瓶，用移液管分别缓慢加入0.6ml干燥的碘甲烷至冻结的反应完全溶解，充入氮气，再分别超声处理反应液1h。然后分别加入1ml蒸馏水至反应瓶中使甲基化反应结束。再加入1mol∕L的乙酸中和反应液。流水透析至反应液颜色转为无色，冷冻干燥，红外检测多糖羟基是否完全甲基化，若没有则需重复上述操作。

5.2样品的水解

将完全甲基化的多糖样品分别溶于4ml 90％的甲酸溶液，密塞后于110℃烘箱中解聚6h。反应结束后减压蒸干，分别加3ml甲醇重复蒸干4次，以除去过量甲酸。然后将蒸干后的解聚样品加入4ml 2mol/L三氟乙酸的安培管中，封管后110℃水解2h后减压蒸干，重复加甲酸多次蒸干以除去过量的三氟乙酸。再

加入3ml蒸馏水充分使样品溶解。30mg NaBH

还原乙酰化后制得部分甲基化的乙

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酸衍生物，氯仿-水体系萃取衍生物，回收氯仿层，减压浓缩至约0.1ml后进行GC-MS分析。

5.3 GC-MS分析

设定好GC/MS操作参数， GC-MS测试条件为：毛细管柱HP-5,程序升温50-250℃,10℃∕min，进样口温度260℃；离子源：EI；氦气流速1ml/min.。当系统提示可以进样时，使用10 μL进样针准确吸取5 μL样品溶液（不能有气泡）加入到进样口，分析开始。

对得到的总离子流色谱图（TIC），在不同位置双击鼠标右键即得到相应的质谱图。在质谱库中检索后，根据匹配度、置信度可确定各峰的归属。