动物细胞大规模培养 ppt

目前, 大规模动物细胞培养中已经普遍使用 无血清培养基, 在此之前使用过天然培养基、 合成培养基。无血清培养基避免了血清培养基 污染的可能性, 并减少了纯化的难度。 但无血 清培养基没有广泛的适应性, 不同的细胞甚至 不同的细胞株和细胞系有各自独立的无血型培 养基配方。采用无血清培养而诱发细胞凋亡也 成为动物细胞无血清培养技术中急待解决的问 题。在培养基中加入某些化合物, 如金精三羧 酸(ATA )、锌离子、抗氧化剂和细胞因子等, 在一定程度上可阻止因采用无血清培养基而导 致的细胞凋亡。
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贴壁培养细 胞转瓶机
2、贴壁培养的优点：
●容易更换培养液：细胞紧密黏附于固相表面， 可直接倾去旧培养液，清洗后直接加入新培养液。 ●容易采用灌注培养，从而达到提高细胞密度的
目的；因细胞固定表面，不需过滤系统。
●当细胞贴壁于生长基质时，很多细胞将更有效 的表达一种产品。
●同一设备可采用不同的培养液/细胞的比例。
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三.生物反应器分类
按其培养细胞的方式不同，可分三类：
1.悬浮培养用反应器：如搅拌反应器、中 空纤维反应器、陶质矩形通道蜂窝状反应器、 气升式反应器； 2.贴壁培养用反应器：如搅拌反应器（微 载体培养）、玻璃珠床反应器、中空纤维反 应器、陶质矩形通道蜂窝状反应器； 3.包埋培养用反应器：如流化床反应器、 固化床反应器。
2、共价贴附法: 利用共价键将动物细胞与固相载体结合的 固定化方法称为共价贴附法（attachment by covalent bonding）。此法可减少细胞的泄漏， 但须引入化学试剂，对细胞活性有影响，且因 贴附而导致扩散限制小，细胞得不到保护。
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3、离子/共价交联法: 双功能试剂处理细胞悬浮液，会在细胞
(三) 中空纤维细胞培养反应器流程
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4.流化床生物反应器
流化床生物反应器的传质性能好, 并在循环系统中 采用膜气体交换器, 能快速提供给高密度细胞所需 要的氧, 同时排出代谢产物; 反应器中的液体流速 足以使细胞微粒悬浮却不损坏脆弱的细胞。流化 床生物反应器满足了高密度细胞培养, 使高产量细 胞长时间停留在反应器中, 优化了细胞生长与产物 合成的环境等细胞培养的要求。可用于贴壁依赖 性细胞和非贴壁依赖性细胞的培养
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Hale Waihona Puke 目前已实现商业化的产品：口蹄疫疫苗、狂犬病疫苗、牛白血病病毒疫苗、 脊髓灰质炎病毒疫苗、乙型肝炎疫苗、疱疮病毒 疫苗、巨细胞病毒疫苗、α及β干扰素、血纤维 蛋白溶酶原激活剂、凝血因子Ⅷ和Ⅸ、促红细胞 素、松弛素、生长激素、蛋白C、免疫球蛋白、尿 激酶、激肽释放酶及200种单克隆抗体等。
●适用于所有类型细胞。
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灌注培养
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3、贴壁培养的缺点：
与悬浮培养法相比，
●扩大培养比较困难，投资大；
●占地面积大；
●不能有效监测细胞的生长；
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二、悬浮培养（suspension culture）
指细胞在反应器中自由悬浮生长的过程。
主要用于非贴壁依赖型细胞培养，如杂交瘤
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二.大规模培养动物细胞的方法

贴壁培养
悬浮培养
固定化培养
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一、贴壁培养（attachment culture）
细胞贴附在一定的固相表面进行的培养。
1、生长特性：贴壁依赖型细胞在培
养时要贴附于培养（瓶）器皿壁上，
细胞一经贴壁就迅速铺展，然后开始
有丝分裂，并很快进入对数生长期。 一般数天后就铺满培养表面，并形成 致密的细胞单层。

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四.动物细胞培养体系前景展望
1.生产单克隆抗体 目前我国单抗市场规模每年以50%以上的速度 递增。单克隆抗体在我国市场仍属高端产品，主 要依赖进口。2010年我国肿瘤药物市场销售额达 160亿元，同比增长24%，全球排名第七，远超美 国4.4%和其他成熟或新兴市场；2011年市场销售 额达到208亿元。同比增长率30%。"十二五"期间， 医药工业发展目标为总产值年均增长20%，到 2015年达到3.1万亿元。单克隆抗体仍是目前研 发的热点，也将是未来生物制药行业发展的重要 动力所在。
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细胞大规模培养过程中要注意环境监测
(1)氨离子：细胞培养环境中抑制因素的积聚是 提高细胞密度的主要限制因素。 (2)乳酸：高乳酸浓度必将抑制细胞生长 (3)二氧化碳：二氧化碳积聚，对细胞产生毒性 作用或者改变细胞代谢水平。 (4)甲基乙二醛(Mc)：对细胞有潜在的损伤作用 (5)渗透压：恒定、适宜 (6)载体：可考虑采用多孔径载体替代容易使细 胞受机械搅拌与喷气损伤的常规载体。
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1.搅拌罐生长反应器

最经典、最早被采用。针 对动物细胞培养的特点， 采用了不同的搅拌器及通 气方式。通过搅拌器的作 用使细胞和养分在培养液 中均匀分布，使养分充分 被细胞利用，并增大气液 接触面，有利于氧的传递。
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搅拌罐式生物反应器
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间形成桥而絮结产生交联作用，此固定化细 胞方法称为离子/共价交联法（crosslinking by covalent bonding）。交联试 剂会使一些细胞死亡，也会产生扩散限制。
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4、包埋法: 将细胞包埋在多孔载体内部制成固定化细胞的 方法称为包埋法（entrapment）。 优点：步骤简便、条件温和、负荷量大、细胞 泄漏少，抗机械剪切。 缺点：扩散限制，并非所有细胞都处于最佳基 质浓度，且大分子基质不能渗透到高聚物网络内 部。一般适用于非贴壁依赖型细胞的固定化，常 用载体为多孔凝胶，如海藻酸钙凝胶、琼脂糖凝 胶和血纤维蛋白。
大规模动物细胞培养体系
Large-scale animal cell cultivation system
彭文丽 袁跃 王杰 刘小婷 邓念龙 杨彬 李亮
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动物细胞培养之创始
蛙胚延髓组织培养在青蛙淋巴凝块内
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体 外 培 养 技 术 的 发 展
滚瓶 培养
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机械搅拌装置示意图
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2.气升式生物反应器
气升式生物反应器的基本原理是气体混合物从底 部的喷射管进入反应器的中央导流管, 使得中央 导流管侧的液体密度低于外部区域从而形成循环。 气升式生物反应器主要采用内循环, 但也有采用 外循环式。
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（二）气升式流程
特点：没有移动部件、完全密封、便 于无菌操作、不易染菌、设计简单、 便于放大、氧转换率高。
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琼脂糖凝胶
琼脂糖凝胶可用二相法制得。将含有细胞的 琼脂糖溶液分散到一个水不溶相中(如石蜡油) , 形 成直径0. 2 mm 凝胶珠珠, 移去石蜡油后, 细胞即可 进行培养。同海藻钙一样, 琼脂糖更适于培养悬浮 细胞。尽管凝胶珠形成过程很复杂, 目前放大体积 不超过20 L 。但琼脂糖凝胶无毒性, 具有较大的空 隙, 可以允许大分子物质自由扩散, 因此该法特别 适用于蛋白产物的连续生产。有人曾用琼脂糖包 埋杂交瘤细胞和淋巴细胞生产单克隆抗体和白细 胞介素 。
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细胞大规模培养过程中要注意过程监控

测量在线氧吸收速率确定从细胞生长期生产病毒 到病毒感染期和细胞死亡后终止感染的转换时间； 用在线葡萄糖分析仪的测定调整灌流速度； 测定氧消耗估计营养供应率的代谢负荷； 测定氧吸收速率估测ATP的形成； 测量在线氧化还原能力作为活细胞浓度的指标等 均得以应用。
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大 规 模 动 物 细 胞 培 养 工 艺 流 程 图
1
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3 10
细胞培养反应器 诱生剂 细胞 细胞 浓缩纯化
4
5 提取 纯化 6 产品（肿瘤抗原） 提取 纯化 产品（干扰素） 产品（单克隆抗体）
一.培养基的选择
Spinner培养系统
细胞工厂
细胞培养瓶
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五.填充床反应器（Packed Bed Reactor,PBR）
固定床是在反应器中装配固定的 篮筐，中间装填聚脂纤维载体， 细胞可附着在载体上生长，也可 固定在载体纤维之间，靠上搅拌 中产生的负压，迫使培养基不断 流经填料，有利于营养成分和氧 的传递，这种形式的灌流速度较 大，细胞在载体中高密度生长。 优点是：高效率、易操作、结 构简单 缺点是：传质系数和传热系数 相对较低。
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（四）流化床式反应器结构及工作原理 流化床反应器：
固体颗粒被流体 吹起呈悬浮状态，可 作上下左右剧烈运动 和翻动，好象是液体 沸腾一样，故流化床 反应器又称沸腾床反 应器。适合于固定化 细胞的培养。
1—旋风分离器 2—筒体扩大段
3—催化剂入口
4—筒体 5—冷却介质出口 6—换热器 7—冷却介质进口 8—气体分布板 9—催化剂出口 10—反应气入口
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血纤维蛋白
将动物细胞与血纤维蛋白原混合, 然后加入凝
血酶。凝血酶将血纤维蛋白原转化为不溶性的血
纤维蛋白, 将动物细胞固定在其中。血纤维蛋白可 以促进细胞贴壁, 因此两种类型的细胞都适于培养。 而且基质高度多孔, 允许大分子物质的自由扩散。 但机械强度差, 对剪切力很敏感。
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细胞等，是在微生物发酵的基础上发展起来
的。
悬浮培养瓶
小规模悬浮培养
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